絕對定量和相對定量

1、絕對定量和相對定量第1頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二提綱：實時熒光定量PCR原理 數(shù)學原理 化學原理實時熒光定量PCR的方法應用 絕對定量 相對定量定量PCR的實驗要素平臺定量PCR儀器介紹第2頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二實時熒光定量PCR定義： 在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實現(xiàn)了實時監(jiān)測整個PCR進程，對起始模板進行定量分析的方法。第3頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二與普通PCR的區(qū)別普通PCR技術： 在PCR結束后對終點產物進行定量分析。實時定量PCR技術：實時檢測PCR擴增，在擴增的指

2、數(shù)期對起始模板進行定量。第4頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二第5頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二第6頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二第7頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，一般熒光域值的設置是 基線（背景）熒光信號的標準偏差的 10 倍。每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT 值（ threshold value ）。 第8頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二第

3、9頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二定量PCR的數(shù)學原理第10頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二第11頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二斜率與擴增效率第12頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二第13頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二熒光定量PCR化學原理 非特異性熒光標記： 1、SYBR Green 特異性熒光標記： 2、TaqMan第14頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二1、SYBR Green 法第15頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46

4、分，星期二SYBR Green 熔解曲線分析第16頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二SYBR Green法優(yōu)缺點優(yōu)點:對DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA使用方便-不必設計復雜探針非常靈敏便宜第17頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二2、TaqMan探針法第18頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二TaqMan作用機理第19頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二TaqMan法優(yōu)缺點第20頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二 Real-time PCR 方法應用第21頁，共38頁，202

5、2年，5月20日，19點46分，星期二絕對定量(Absolute Quantification，AQ) 病原體檢測 轉基因食品檢測 基因表達研究相對定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同組織中的表達差異 藥物療效考核 耐藥性研究第22頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二絕對定量與相對定量的定義第23頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二絕對定量通過標準品定量絕對定量的標準樣品： 已知拷貝數(shù)的質粒DNA，做系列稀釋。標準樣品的種類：含有和待測樣品相同擴增片段的克隆質粒含有和待測樣品相同擴增片段的cDNAPCR的產物第24

6、頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二絕對定量：從熒光到拷貝數(shù)第25頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二相對定量通過內標定量內標（Endogenous Control）通常是-actin、GAPDH基因等看家基因在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小內標定量結果代表了樣本中所含細胞或基因組數(shù)量第26頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二相對定量：參照因子Calibrator 第27頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二相對定量分析方法1 -Ct前提：目標序列和內參序列的擴增效率接近100且偏

7、差在 5以內 1、用內參基因的CT值歸一目標基因的CT值： CT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test) CT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator) 2、用校準樣本的CT值歸一試驗樣本的CT值： CT= CT（test) - CT（calibrator) 3、計算表達水平比率： 2 CT=表達量的比值第28頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二相對定量分析方法2：雙標準曲線法目標基因與內參基因擴增效率不同 待測樣品目的基因濃度 待測樣品內參基因濃度 F=

8、 對照樣品目的基因濃度 對照樣品內參基因濃度第29頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二 定量PCR的實驗要素第30頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二樣品DNA純度：OD260/OD280=1.8，1.6 2.0之間DNA用量：0.05 ng 100 ngRNA純度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100 ng 總RNA反轉錄的cDNA取1 uL第31頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二標準品第32頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二標準品梯度稀釋方法第33頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二復管測試樣品和標準品都要重復重復次數(shù)須遵循統(tǒng)計學要求第34頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星期二平臺PCR儀介紹ABI 7500 fast第35頁，共38頁，2022年，5月20日，19點46分，星