臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)-課件-第8章-熒光免疫技術(shù)

1、第八章 熒光免疫技術(shù) Fluoroimmunoassay, FIA第八章 熒光免疫技術(shù) Fluoroimmunoassa概念：是將免疫學(xué)反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)的敏感性結(jié)合起來的一種方法。方法： 熒光抗體技術(shù)(FAT): 用熒光素標(biāo)記抗體進(jìn)行抗原定位、定量檢測(cè)等。熒光免疫技術(shù)概念：是將免疫學(xué)反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)的敏感性結(jié)合起來的一種第一節(jié) 熒光免疫試驗(yàn)的組成要素1.熒光：某些物質(zhì)受到一定波長光的激發(fā)后，在極短時(shí)間內(nèi)發(fā)射出的波長大于激發(fā)光波長的光。2.產(chǎn)生機(jī)制： 基態(tài)-能量(波長短的光)-激發(fā)態(tài)-熒光(波長長的光，光致發(fā)光)-基態(tài)一、熒光的基本知識(shí)化學(xué)物質(zhì)基態(tài)吸收能量釋放能量：發(fā)光激發(fā)態(tài)第一節(jié)

2、熒光免疫試驗(yàn)的組成要素1.熒光：某些物質(zhì)受到一定3.特點(diǎn)： 即時(shí)性(停止供能，熒光現(xiàn)象即止10-710-8s） 4.能量來源：光、化學(xué)物質(zhì)、射線。3.特點(diǎn)：1.發(fā)射光譜：固定激發(fā)波長，在不同波長下所記 錄到的樣品發(fā)射熒光的相對(duì)強(qiáng)度。2.激發(fā)光譜：固定發(fā)射波長，用不同波長的激發(fā)光 激發(fā)樣品,所記錄到的相應(yīng)的熒光發(fā)射強(qiáng)度。3.熒光效率：是指熒光物質(zhì)將吸收的光能轉(zhuǎn)變成 為熒光的百分率。 熒光效率發(fā)射熒光的光量子數(shù)(熒光強(qiáng)度)/ 吸收光的光量子數(shù)(激發(fā)光強(qiáng)度)有關(guān)參數(shù)取決于熒光色素本身的物理特性1.發(fā)射光譜：固定激發(fā)波長，在不同波長下所記有關(guān)參數(shù)取決于熒4.熒光的淬滅： 指熒光物質(zhì)在某些理化因素作用下

3、，發(fā)射熒光減弱甚至消退的現(xiàn)象。原因： (1)紫外光照射長； (2)苯胺、酚、鐵、汞、鎳等。有利：猝滅劑消除不需要的熒光,如硝基苯 處理有熒光的鏡油。 保存：避光、避免與其它化學(xué)物質(zhì)接觸4.熒光的淬滅：二、熒光物質(zhì)(一)熒光色素：具有光致熒光的特性。1、熒光色素應(yīng)具備的條件 P87 能與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，結(jié)合蛋白質(zhì)后不易解離，而未 與蛋白質(zhì)結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物容易被清除 熒光效率高 熒光的顏色與背景組織的顏色對(duì)比鮮明 結(jié)合蛋白質(zhì)后，不影響蛋白質(zhì)的生化性質(zhì)及免疫 學(xué)活性，而且標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、快速，結(jié)合物穩(wěn) 定，易于保存。 安全無毒，不具有附加的抗原性。二、熒光物質(zhì)(一)熒光色素：具有光致熒光的特性。

4、1、熒光色2、常用的熒光色素：(1)異硫氰酸熒光素(FITC） 最大吸收光譜: 490-495nm 。最大發(fā)射光譜: 520-530nm 。熒光顏色: 黃綠色。應(yīng)用最廣： 人眼對(duì)黃綠色較橘色更為敏感。 一般切片等標(biāo)本中綠色的自發(fā)熒光少于紅色的，本底低 。缺點(diǎn)：易猝滅2、常用的熒光色素：(2)四乙基羅丹明 (RB200)最大吸收光譜: 570nm 。最大發(fā)射光譜: 595-600nm 。熒光顏色: 亮橙、橘紅色。應(yīng)用： 常用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。可作為FITC的補(bǔ)充，但其熒光效率較低。 (2)四乙基羅丹明 (RB200)(3)四甲基異硫氰酸羅丹明 (TRITC) 最大吸收光譜: 550nm 。最

5、大發(fā)射光譜: 620nm 。熒光顏色: 橘紅色。應(yīng)用： 常用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?激發(fā)峰和熒光距離較大，易于選擇濾光系統(tǒng)。(3)四甲基異硫氰酸羅丹明 (TRITC) (4)藻紅蛋白（ PE）最大吸收光譜: 565nm 。最大發(fā)射光譜: 575nm 。熒光顏色: 橙色。應(yīng)用： ?？勺鳛镕ITC的補(bǔ)充。(4)藻紅蛋白（ PE）(二)其他熒光物質(zhì)1、鑭系螯合物 銪(Eu3+)（應(yīng)用最廣）、 鋱(Tb3+) 、鈰(Ce3+)的螯合物應(yīng)用：熒光衰變時(shí)間長，用于時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定2、酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)(熒光底物) 如堿性磷酸酶（4-甲基傘酮磷酸鹽）、辣根過氧化物酶（對(duì)羥基苯乙酸）的底物。應(yīng)用：酶免

6、疫熒光分析(二)其他熒光物質(zhì)3、花菁染料 (Cyanine Dyes，Cy2，Cy3，Cy5） 熒光特性與傳統(tǒng)熒光素類似，但水溶性和對(duì)光穩(wěn)定性較強(qiáng)，熒光量子產(chǎn)率較高，對(duì)pH等環(huán)境不敏感。常用于多重染色。 Cy2比FITC更穩(wěn)定，熒光強(qiáng)度更大，光穩(wěn)定性和抗淬滅性更好。 Cy3和Cy5比大多數(shù)熒光基團(tuán)更亮，更穩(wěn)定，背景更弱。 Cy5的缺點(diǎn)是不能用表面熒光顯微鏡觀察，因此通常用具有遠(yuǎn)紅外檢測(cè)器的共聚焦顯微鏡觀察。3、花菁染料 (Cyanine Dyes，Cy2，Cy3，C臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)-課件-第8章-熒光免疫技術(shù)臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)-課件-第8章-熒光免疫技術(shù)熒光顯微鏡觀察1、熒光顯微鏡 1）光源：（供能

7、作用）用短波長的光源 提供很強(qiáng)的激發(fā)光源高壓汞燈：波長不連續(xù)：365nm435nm (紫外光或藍(lán)紫光) 只能用作熒光激發(fā)光源氙燈 鹵素?zé)艄庠从幸欢▔勖簶?biāo)本要集中觀察熒光顯微鏡觀察1、熒光顯微鏡高壓汞燈：波長不連續(xù)：365n2）濾片系統(tǒng)：激光濾片（exciter filter）： 位置：光源和物鏡之間 作用：使短波長的光通過、吸收長波長的光紫外光濾片： UG 通過275nm400nm 阻擋400nm以上的可見光 組織的自發(fā)熒光弱,呈灰藍(lán)色藍(lán)紫外光濾片： BG 通過325nm500nm 熒光強(qiáng)度大,適于觀察細(xì)菌標(biāo)本; 不適于觀察有自發(fā)熒光的組織標(biāo)本2）濾片系統(tǒng)：阻擋濾片（barrier filt

8、er）：吸收濾片或抑制濾片 位置：物鏡和目鏡之間 作用：使熒光通過(410650nm) 阻斷熒光以外的其它光。保護(hù)眼睛。OG(橙黃色)：GG(淡綠色)：隔熱濾片 位置：燈室聚光器前 作用：阻攔紅外線阻擋濾片（barrier filter）：吸收濾片或抑制3）鏡頭: 需消色差、無熒光4）光路: 透射式：適于觀察對(duì)光可通透的標(biāo)本 落射式：適于觀察透明度不好及各種活性組織3）鏡頭: 需消色差、無熒光4）光路:臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)-課件-第8章-熒光免疫技術(shù)臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)-課件-第8章-熒光免疫技術(shù)一、抗體要求 純度高、特異性強(qiáng)、親和力高、效價(jià)高（雙擴(kuò)效價(jià)1：32）第二節(jié) 熒光抗體的制備一、抗體要求第二節(jié)

9、熒光抗體的制備 二、熒光素要求 攪拌法: 用于標(biāo)記體積大, Pr含量高的Ab溶液。 優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)記時(shí)間短、熒光素用量少（10g FITC/1mg Ig） 缺點(diǎn)：非特異性熒光高逐滴加入FITC溶液攪拌46h離心抗體溶液三、熒光素標(biāo)記抗體的方法 二、熒光素要求 攪拌法: 用于標(biāo)記體積大, 透析法：蛋白質(zhì)含量低，樣品體積小。 優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)記均勻，非特異性熒光低。 缺點(diǎn)：時(shí)間長，熒光素用量多TITC抗體溶液FITC標(biāo)記的抗體溶液反應(yīng)過夜PBS透析法：蛋白質(zhì)含量低，樣品體積小。 優(yōu)點(diǎn)： 影響因素溫度和時(shí)間：pH：8.89.5蛋白含量：20 25mg/mL蛋白為宜熒光素的純度：不應(yīng)低于75% 影響因素溫度和時(shí)間：

10、四、 熒光標(biāo)記抗體的純化除去未結(jié)合的游離熒光素及其降解產(chǎn)物:減少非特異性染色的來源 透析法、凝膠過濾色譜法去除過度標(biāo)記和未結(jié)合熒光素的抗體： 離子交換層析（攪拌）非特異反應(yīng)物質(zhì)的去除：以同一正常組織同種動(dòng)物其它組織的組織粉預(yù)先吸收，使非特異熒光大為減弱。四、 熒光標(biāo)記抗體的純化除去未結(jié)合的游離熒光素及其降解產(chǎn)物抗體效價(jià)(高者特異熒光強(qiáng)，非特異熒光相對(duì)減弱) 雙擴(kuò)抗體效價(jià)：1：161:32比較理想?？贵w特異性:吸收試驗(yàn)、抑制試驗(yàn)熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合比例（F/P）P50 固定標(biāo)本的熒光抗體：F/P=1.5為主 用于活細(xì)胞染色的抗體：F/P=2.4為主五、 標(biāo)記抗體的鑒定抗體效價(jià)(高者特異熒光強(qiáng)，非特

11、異熒光相對(duì)減弱)五、 標(biāo)記抗體六、熒光抗體的保存 低溫、避光，防止抗體失活及熒光素的脫落和淬滅六、熒光抗體的保存第二節(jié) 免疫熒光試驗(yàn) 熒光抗體(已知Ab) 切片標(biāo)本(未知Ag) 去除未結(jié)合的熒光Ab 熒光顯微鏡下觀察是否有特異熒光第二節(jié) 免疫熒光試驗(yàn)（一）標(biāo)本的制作1、材料：細(xì)胞、微生物、組織 要求： 標(biāo)本片盡量薄，以利于抗原抗體的接觸、結(jié)合和鏡檢。 盡可能保持Ag的完整性，并保證在染色、洗滌和封埋過程中不發(fā)生溶解、變性或脫落，也不擴(kuò)散到臨近細(xì)胞或組織間隙中去。 標(biāo)本中干擾抗原抗體反應(yīng)的物質(zhì)要充分洗去，對(duì)有傳染性的標(biāo)本要注意實(shí)驗(yàn)室生物安全。（一）標(biāo)本的制作2、玻片和蓋玻片的處理3、制片涂片：細(xì)

12、胞、微生物可用此法。 印片：組織標(biāo)本用此法。 切片：組織標(biāo)本用此法（目前少用）。2、玻片和蓋玻片的處理3、制片4、固定目的：防止細(xì)胞或切片從玻片上脫落； 去除防礙抗原抗體結(jié)合的類脂； 易于保存。4、固定目的：防止細(xì)胞或切片從玻片上脫落；常見的固定方法常見的固定方法1、染色方法（1）直接法：測(cè)抗原。 標(biāo)本片 + 特異熒光抗體（已知）（2）間接法：測(cè)抗體、抗原 已知（或未知）抗原固定（制片） 加待測(cè)抗體（或已知抗體） 加熒光標(biāo)記的第二抗體。 （二）熒光抗體染色與結(jié)果判斷1、染色方法（二）熒光抗體染色與結(jié)果判斷臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)-課件-第8章-熒光免疫技術(shù)直接法 優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)便 特異性高 非特異性熒光染

13、色少 缺點(diǎn)：敏感度偏低 檢測(cè)每一種抗原需制備相應(yīng)的熒光抗體 應(yīng)用：病原微生物的快速檢測(cè) 活檢標(biāo)本的免疫病理檢查直接法間接法： 優(yōu)點(diǎn)：敏感度高于直接法 制備一種熒光抗體可用來檢測(cè)多種抗原 既可用于檢測(cè)抗原，也可檢測(cè)抗體 缺點(diǎn)：易出現(xiàn)非特異性熒光 方法較麻煩 操作時(shí)間較長 應(yīng)用：自身抗體的檢測(cè)間接法：FITCRB200雙標(biāo)記法（3）雙標(biāo)記染色法FITCRB200雙標(biāo)記法（3）雙標(biāo)記染色法2、非特異性熒光來源：自發(fā)熒光 熒光抗體的非特異性熒光色素 抗原不純 染色方法不當(dāng)控制：高質(zhì)量純化免疫原、免疫血清及 標(biāo)記后的抗體 在熒光染色時(shí)設(shè)置對(duì)照2、非特異性熒光來源：自發(fā)熒光3、各種染色法需設(shè)置的對(duì)照標(biāo)本自

14、發(fā)熒光對(duì)照特異性對(duì)照（抑制試驗(yàn)）:標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗 體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體 熒光抗體對(duì)照：適于間接法陽性對(duì)照3、各種染色法需設(shè)置的對(duì)照標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照2、標(biāo)本觀察染色當(dāng)天觀察。特異性熒光強(qiáng)度用“+”表示：（） 無熒光（）極弱的可疑熒光（+）熒光較弱，但清楚可見（+）熒光明亮（+）熒光閃亮2、標(biāo)本觀察直接法檢測(cè)沙眼衣原體直接法檢測(cè)沙眼衣原體直接法檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)桿菌直接法檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)桿菌臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)-課件-第8章-熒光免疫技術(shù)間接法測(cè)抗核抗體間接法測(cè)抗核抗體熒光抗體技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)缺點(diǎn)：1.對(duì)組織細(xì)胞進(jìn)行微細(xì)結(jié)構(gòu)的觀察做不到。2.標(biāo)本不能永久保存，熒光有自然消退現(xiàn)象，需 及時(shí)觀察并照相。3.有非特異性熒光的干擾優(yōu)點(diǎn)：1.Ag和Ab的特異性與形態(tài)的檢查結(jié)合在一起。2.能做到快速、敏感、定位。熒光抗體技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：第五節(jié) 熒光免疫試驗(yàn)的臨床應(yīng)用1. 血清中自身抗體的檢測(cè)：梅毒螺旋體抗體的檢測(cè)2. 各種微生物的快速檢查和測(cè)定3. 寄生蟲感染的診斷：在寄生蟲感染診斷中，間接免疫熒光試驗(yàn) （IFAT）是當(dāng)前公認(rèn)的最有效的檢測(cè)瘧疾抗體的方法。 4. 白細(xì)