枸杞基因組DNA提取及指紋圖譜分析

1、枸杞基因組DNA提取及指紋圖譜分析【關(guān)鍵詞】枸杞；,基因組DNA；,RAPD；,指紋圖譜摘要：目的建立一種適于RAPD分析的快速提取枸杞葉片基因組DNA的方法，并利用RAPD技術(shù)研究枸杞屬植物基因組DNA指紋圖譜。方法采用改良的TAB法提取枸杞冷藏幼葉的基因組DNA，利用RAPD技術(shù)對其進(jìn)展指紋圖譜分析。結(jié)果改良的TAB法提取的10份枸杞材料基因組DNA均適于RAPD分析；可提供明晰的RAPD指紋圖譜，利用挑選出的2個隨機(jī)引物對供試材料DNA進(jìn)展隨機(jī)擴(kuò)增，共得到56條帶，其中多態(tài)性條帶44條，多態(tài)性百分率為78.6%。結(jié)論說明改良的TAB法提取的枸杞基因組DNA不需經(jīng)氯化銫梯度離心或柱層析純化

2、，可以直接用于RAPD分析；RAPD對枸杞屬植物進(jìn)展指紋圖譜分析是可行的。關(guān)鍵詞：枸杞；基因組DNA；RAPD；指紋圖譜ExtratinfGeniDNAfrLyiubararuandItsFingerprintAnalysisAbstrat：bjetiveTdevelpvalidethdtextratDNAfrLyiubararufrRAPDanalysisandresearhitsDNAfingerprintbyusingRAPDtehnlgy.ethdsTheextratsfhighqualitygeniDNAasextratedfrthefrzenleavesfLyiubararubyd

3、ifiedTABethdanditsfingerprintasanalyzedbyRAPD.ResultsThelearfingerprintsftheextratsfgeniDNAuldbegtbyRAPD.TRAPDpriersereappliedtdrandaplifiatin.Attalf56DNAbandsasdeteted,44anghihereplyrphi,theaverageratefplyrphibandsas78.6%.nlusinThedifiedTABethdasvalid,quikanddidntneedphenlextratin.ThisislatedDNAuld

4、beuseddiretlyfrRAPDanalysisithutsedientatininesiuhlridegradientrlunhratgraphy.TheRAPDarkersanbeusedfrthestudiesffingerprintfLyiubararusensitively.Keyrds：Lyiubararu;GeniDNA；RAPD；FingerprintRAPD由illias和elsh兩個研究小組幾乎同時于1990年建立起來的一項分子標(biāo)記技術(shù)1,2，是目前中藥研究者最常使用的DNA標(biāo)記技術(shù)。RAPD標(biāo)記所需樣品基因組DNA的量僅為10ng，且RAPD引物已商品化消費(fèi)。因此，

5、它可以在不知道特異DNA序列的情況下檢測DNA的多態(tài)性，尤其在目前絕大多數(shù)動、植物中藥材DNA序列尚不清楚的情況下，在中藥品種研究方面RAPD標(biāo)記比其它分子標(biāo)記更具有廣闊的應(yīng)用前景3。雖然DNA分子標(biāo)記技術(shù)在枸杞屬植物鑒定等方面已有一些報道，張艷波等4搜集了6種枸杞屬植物，其中2個正品，4個混淆品種，運(yùn)用RAPD技術(shù)進(jìn)展分析，獲得了枸杞屬不同種的特異性DNA指紋圖譜，從而將它們準(zhǔn)確區(qū)別。鄭可大等5搜集了20個臺北市場枸杞商品，運(yùn)用RAPD技術(shù)進(jìn)展分析，獲得了2個DNA指紋圖譜類型，推測其中15個是正品枸杞，5個混淆品。魏玉清等6對寧夏不同地區(qū)主栽枸杞品種利用RAPD技術(shù)進(jìn)展了鑒別。但目前分子標(biāo)

6、記用于枸杞屬植物研究的種類和數(shù)量都非常有限，本實驗所選的局部枸杞材料未見有RAPD研究報道。獲得高質(zhì)量的DNA樣品是進(jìn)展RAPD分析的首要步驟。目前，有許多植物基因組DNA提取方法79。要用于RAPD分析，DNA提取步驟越少越好，能減少對DNA的破壞；多步驟、多種試劑容易引起DNA的破壞和污染，從而影響PR反響及PR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果分析。關(guān)于從枸杞果實中提取基因組DNA有一些報道4,510,11，而有關(guān)從枸杞葉片中進(jìn)展基因組DNA提取與PR分析的詳細(xì)研究尚未見報道。枸杞(Lyiubararu)葉內(nèi)多糖等物質(zhì)含量較高，這些次生物質(zhì)與DNA形成復(fù)合物，這種DNA不能用于PR擴(kuò)增。為理解決這個問題，最

7、理想的方法是用氯化銫梯度離心或柱層析純化DNA，但此法昂貴、費(fèi)時，且需大量試材。本研究力圖通過實驗建立一種簡易的提取枸杞葉片基因組DNA的方法，并對其進(jìn)展RAPD鑒定，從而在此根底上進(jìn)展RAPD指紋圖譜分析。1材料與方法1.1材料實驗所用的10份材料及來源見表1野生枸杞為野外獲得的一棵外形不同于寧夏主栽品種的植株。表1材料名稱略1.2儀器與試劑PR儀PT200TPeltierTheralyler，JResearh，In，USA；電泳儀DYY10型；北京六一儀器廠；電泳槽DYp31型；北京六一儀器廠；SartSpeT3000核酸蛋白測定儀BIRADLab，In，USA；Eppendrf5415D

8、離心機(jī)；UVPGDS8000凝膠成像系統(tǒng)。Buffer，TaqDNA聚合酶，dNTPs，gl2，300bpDNAladder購自北京天為時代公司，10堿基隨機(jī)引物購自上海生工生物工程，AgarsePrega公司，EB瑞士Flukaheika公司。1.3方法1.3.1基因組DNA提取采用TAB法1215，并適當(dāng)改良。詳細(xì)步驟為：枸杞幼葉在液氮中研磨至無可見組織塊后裝入1.5l的Eppendrf管中大約1/3體積，參加500l提取緩沖液含100l/LTrisHlpH8.0，20l/LEDTA,1.4l/LNal，2%TAB，0.2%巰基乙醇，混勻，65溫育30in，取出立即放入冰中冷凍10in。參

9、加500l的氯仿異戊醇241，混勻，于4冰箱中冷凍10in，12000r/in離心10in，轉(zhuǎn)移上清液于干凈的1.5l的Eppendrf管中，重復(fù)1次。參加300500l的異丙醇或1l的無水乙醇混合，于-20下靜置20in。12000r/in離心15in，棄上清液，先參加70%乙醇洗沉淀兩次去除有機(jī)溶劑、無機(jī)鹽等，然后參加無水乙醇脫水，室溫枯燥。將枯燥DNA溶解于200l的ddH2或TE緩沖液含10l/LTrisHl，1l/LEDTA，pH8.3做母液于-20儲存。將DNA母液取出10l稀釋40倍后，用SartSpeT3000核酸蛋白測定儀測波長260，280及320n處光吸收，直接從儀器主屏

10、上讀出被測樣品A260，A280，A260/A280和DNA含量。點6上樣緩沖液10l于玻璃板上，分別汲取各材料DNA母液2l與其混勻，然后在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳72v電壓下電泳30in，檢驗DNA片段大校最后將DNA母液稀釋為20ng/l的工作液分裝成小包裝于-20儲存或4保存?zhèn)溆谩?.3.2PR擴(kuò)增及電泳檢測反響在PT200型PR儀上進(jìn)展。采用本實驗室長期使用的20l反響體系，其成分為：10Buffer不含g2+加0.8l25lL-1g2+，1l2.5dNTPs，1UTaqDNA聚合酶，1l0.37510堿基隨機(jī)引物，50ng模板。反響程序：預(yù)變性942in；預(yù)擴(kuò)增程序：9420s，3

11、630s，721in，5個循環(huán)；擴(kuò)增程序：9420s，4030s，721in，40個循環(huán)；然后72延伸10in，最后4保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)含有0.5g/lEB的1.4%瓊脂糖凝膠電泳別離72v電壓下電泳45in，電泳完畢后在UVPGDS8000凝膠成像系統(tǒng)上觀察照相。1.3.3RAPD隨機(jī)引物挑選用一種材料做完20個引物后，去除只擴(kuò)增出3條帶以下或沒有條帶的引物，再用另一種材料依次挑選下去。挑選出多態(tài)性較強(qiáng)、重現(xiàn)性好的引物2個S331：5TAGTGA3和S2063：5GAGGAA3。2結(jié)果2.1改良的TAB法成功提取了枸杞葉片基因組DNA本實驗在參考TAB法根底上適當(dāng)改良，成功提取了枸杞基因組DN

12、A，該方法不需飽和酚抽提、氯化銫梯度離心和柱層析純化，可直接用于RAPD分析。2.2枸杞基因組DNA質(zhì)量檢測采用改良的TAB法所提枸杞的DNA顏色為透明的白色、干后無色。點樣孔110分別對應(yīng)110號供試材料圖1枸杞基因組DNA電泳圖略由圖1可看出，枸杞基因組DNA經(jīng)電泳檢測在點樣孔附近呈一條亮且集中的條帶，說明DNA未降解；亮帶前面的條帶經(jīng)RNase處理后不再存在，說明這些條帶為RNA。表2基因組DNA純度及含量檢測略由表2可看出，波長260n和280n光吸收比值在2.082.53之間，DNA含量在7122870g/l之間。2.3模板濃度對擴(kuò)增結(jié)果的影響我們實驗室長期使用50ng/20l體系的

13、模板DNA濃度，RAPD標(biāo)記所需樣品基因組DNA的量僅為10ng3，于是我們設(shè)計了10ng/20l體系、20ng/20l體系、50ng/20l體系3個模板濃度對擴(kuò)增結(jié)果的影響。本實驗用了1個挑選過的隨機(jī)引物S1：5GTTTGT3S3：5對3種材種2號寧杞1號、4號血杞1號和5號精杞1號材料進(jìn)展?jié)舛忍荻仍囼灐Ｓ蓤D2可知，反響體系中模板DNA濃度為1050ng/20l體系時擴(kuò)增結(jié)果沒有明顯區(qū)別；由于實驗室習(xí)慣，我們選用了50ng/20l體系的模板DNA濃度。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.圖2不同模板DNA濃度擴(kuò)增結(jié)果略2.4枸杞基因組DNA指紋圖譜分析2.4.1挑選的2個隨機(jī)引物對10份材料基因組DNA的

14、擴(kuò)增由于RAPD隨機(jī)引物10個堿基太短，而且退火溫度較低3640，很容易造成錯誤配對，再加上各種試劑的質(zhì)量和濃度差異，造成擴(kuò)增出現(xiàn)假陽性帶型和結(jié)果的不穩(wěn)定。因此，在本實驗利用RAPD技術(shù)時，筆者首先對實驗室長期使用的反響體系進(jìn)展了優(yōu)化，然后以10份供試材料的DNA為模板，運(yùn)用挑選出的2個RAPD引物分別擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖34所示，擴(kuò)增出的DNA帶的分子大小在5002500bp之間；2個引物擴(kuò)增的條帶數(shù)量以及區(qū)分10份供試材料6類，野生枸杞不計入的區(qū)分率均存在差異，2個引物擴(kuò)增6類材料的條帶數(shù)量分別為23條和33條，平均每個引物擴(kuò)增28條帶；擴(kuò)增的具有多態(tài)性的條帶分別為17條和27條，平均每個引

15、物擴(kuò)增22條具有多態(tài)性的帶，其統(tǒng)計分析結(jié)果如表3所示，從表3統(tǒng)計結(jié)果可知，區(qū)分6類供試材料的區(qū)分率分別83.3%S331不能區(qū)分2和3和66.7%S2063不能區(qū)分2和3及4和9，平均為75%。兩個引物共擴(kuò)增出56條明晰條帶，其中44條具有多態(tài)性，多態(tài)性比率PPB達(dá)78.6%。2.4.2指紋圖譜解析由圖3、圖4和表3可知，運(yùn)用挑選出的S331和S2063兩個引物僅不能區(qū)分2和3寧杞1號和寧杞2號。雖然引物S331擴(kuò)增的條帶數(shù)量和具有多態(tài)性的條帶數(shù)量均比S2063的少，但引物S331擴(kuò)增條帶的明晰度比S2063的要好，且區(qū)分6類供試材料的區(qū)分率比S2063的高，擴(kuò)增出現(xiàn)假陽性帶型和結(jié)果不穩(wěn)定性的

16、機(jī)率大大減少，綜合各種結(jié)果可看出，引物S331比S2063的擴(kuò)增效果要好。從圖34可知，2，6，7和8不同地方的寧杞1號指紋圖譜一致，2和3僅在S331擴(kuò)增出的500bp處共有帶的亮度不同，不能有效地進(jìn)展區(qū)分，其它種類可以有效地進(jìn)展區(qū)分，說明RAPD技術(shù)用于不同品種枸杞的鑒別是有效的。：300bpDNAladder2500，2000，1500，1000，500，300K：陰性對照不加模板DNA點樣孔110分別對應(yīng)110號供試材料圖3引物S331擴(kuò)增10份DNA樣品的結(jié)果略：300bpDNAladder2500，2000，1500，1000，500，300K：陰性對照不加模板DNA點樣孔110分

17、別對應(yīng)110號供試材料圖4引物S2063擴(kuò)增10份DNA樣品的結(jié)果略表3擴(kuò)增譜帶情況分析略3討論3.1植物藥中的小分子次生代謝產(chǎn)物如萜類、黃酮、香豆素、有機(jī)酸、鞣質(zhì)等含有酚羥基的化合物，氧化后易與DNA結(jié)合，引起DNA降解或抑制酶的活性，而植物中存在的多糖類由于與DNA同屬大分子化合物，一般提取過程很難去除干凈，也可能影響DNA的進(jìn)一步酶處理或PR擴(kuò)增16。采用改良的TAB法對枸杞幼葉基因組DNA進(jìn)展提取，經(jīng)電泳檢測，紫外吸收檢測及RAPD分析發(fā)現(xiàn)，改良后的TAB法合適枸杞幼葉基因組DNA提齲采用該法提取的基因組DNA枯燥時呈透明的白色，溶于水或緩沖液中無色，說明TAB除色素及次生代謝物效果好

18、。TAB是一種去污劑，既能裂解細(xì)胞又能有效地沉淀次生代謝物，特別是多糖。由于提取過程未用RNase處理，10份材料基因組DNA的A260/A280均大于2.00，但對上述10份材料DNA樣品進(jìn)展RAPD分析，能獲得好的結(jié)果圖24。由實驗結(jié)果可見，枸杞RAPD分析所用的DNA，無需復(fù)雜的純化過程，只需簡單的氯仿異戊醇241抽提，并且不需去除RNA，但研磨要充分?？梢?，采用改良TAB法提取枸杞幼葉基因組DNA，步驟簡單，合適進(jìn)展RAPD分析用，防止了使用苯酚這種有毒試劑。3.2RAPD技術(shù)本身存在多態(tài)性少和重現(xiàn)性的缺點17，對此缺點筆者在實驗設(shè)計的時候就已經(jīng)考慮到了。挑選引物時筆者用了3種枸杞材料

19、，選出在3種枸杞材料中均有3條以上條帶、并且重復(fù)23次均能擴(kuò)增出一樣結(jié)果的引物進(jìn)展擴(kuò)增。選出的引物在一定程度上可以作為枸杞屬植物的通用引物，本實驗根本上證實了這一點。考慮到枸杞變異較大，中間類型很多，種的界限不清楚，對有些種和品種的形態(tài)學(xué)分類操作者存在著客觀和主觀的原因等因素，本實驗所用候選引物的數(shù)量還不夠多，可以再增加，這在一定程度上可以減少實驗結(jié)果分析的誤差，以及種和品種間遺傳多樣性所產(chǎn)生的影響。3.3隨著分子標(biāo)記技術(shù)的開展，各種新的標(biāo)記技術(shù)不斷產(chǎn)生，假如要科學(xué)、準(zhǔn)確地對植物的基因組DNA進(jìn)展指紋圖譜分析，進(jìn)而對植物的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)展研究還得運(yùn)用多種分子標(biāo)記技術(shù)，將每一種標(biāo)記的結(jié)果

20、和傳統(tǒng)的分類結(jié)果進(jìn)展全面的比擬和分析才能獲得令人信服的結(jié)果。但由于對枸杞屬植物的遺傳背景理解不多，運(yùn)用RAPD技術(shù)對其基因組DNA進(jìn)展指紋圖譜分析從而進(jìn)展道地品種的鑒別、遺傳多樣性及親緣關(guān)系的研究是目前最有效的方法。3.41野生枸杞和2，6，7，8不同地方的寧杞1號指紋圖譜一致，說明野生枸杞可能是寧杞1號，其植株外形不同于寧夏栽培的寧杞1號可能是受環(huán)境的影響發(fā)生了形態(tài)變異。參考文獻(xiàn)：1illiasJG,KubelikAR,LivakKJ,etal.DNAplyrphissaplifiedbyarbitrarypriersareusefulasgenetiakersJ.NulEiAidsRes,

21、1990,25(18)：6531.2elshJ,lelland.FingerprintinggenesusingPRitharbitrarypriersJ.NulEIAidsRes,1990,25(18)：7213.3曹暉，劉玉萍.分子標(biāo)記技術(shù)在中藥品種鑒別中的應(yīng)用J.中國藥學(xué)雜志,1998，335：269.4ZhangKYB,LeungH,YeungH,etal.DifferentiatinfLyiubararufritsrelatedLyiuspeiesusingrandaplifiedplyrphiDNAJ.Plantaed,2001,67：379.5hengKT,hangH,HuangH,etal.RAPDanalysisfLyiubararuediineinTaianarketJ.BtBullAadSin,2000,41：11.6魏玉清，許興，王掌軍等.寧夏不同地區(qū)主要栽培枸杞的RAPD分析J.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報自然科學(xué)版，2022，181：60.7王培訓(xùn),周聯(lián),賴小平.分子生物學(xué)技術(shù)與中藥鑒別RAPD技術(shù)的研究與應(yīng)用.廣州：廣東世界圖書出版，2002：94.8周延清.DNA分子標(biāo)記技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2022：1