實(shí)驗(yàn)一光合細(xì)菌的培育

1、關(guān)于實(shí)驗(yàn)一光合細(xì)菌的培育第1頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)，了解并掌握光合細(xì)菌的培養(yǎng)方法。第2頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三二、實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備：光和細(xì)菌的培養(yǎng)設(shè)備：包括滅菌設(shè)備、培養(yǎng)容器、培養(yǎng)用具和檢測(cè) 儀器。1.滅菌設(shè)備：高壓蒸汽滅菌鍋，用于高壓濕熱滅菌。2、培養(yǎng)容器 (1)試管：15mmL160mm(中型試管)。主要用于液體培養(yǎng)和斜面 培養(yǎng)。 20mmL180mm(大型試管)。主要用于制平板深層試管 或盛無(wú)菌 水等。(2)培養(yǎng)皿： 610cm(常用9cm).用于制作平板培養(yǎng)基，以分離 菌種和觀察菌落形態(tài)。 (3)移液

2、管：容量110ml(常用1ml、5ml、10ml)，制備培養(yǎng)基、稀 釋液體、吸取樣品等使用。第3頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三(4)錐形瓶(有、無(wú)具塞磨口兩種)：30500ml。用于各種光和細(xì)菌單體或組合連續(xù)培養(yǎng)的逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)用。(5)三角燒瓶：5005000ml，用于擴(kuò)大培養(yǎng)。(6)細(xì)口瓶：500020000ml，用于擴(kuò)大培養(yǎng)和生產(chǎn)性大量培養(yǎng)。(7)塑料薄膜袋：用于生產(chǎn)性大量培養(yǎng)。(8)大型塑料水槽：一般為圓柱形。容量為300500L，用于生產(chǎn)性大量培養(yǎng)。 第4頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三3、培養(yǎng)用具 (1)操凈工作臺(tái)：用于菌種的分離和接

3、種。(2)恒溫培養(yǎng)箱（或人工氣候箱，光照培養(yǎng)箱）：主要用于培養(yǎng)菌種和小型培養(yǎng)使用。箱內(nèi)必須帶有鎢絲燈泡的人工光源。(3)電冰箱和冷藏冰柜：主要用于菌種和某些有機(jī)試劑的保存以及光和細(xì)菌母菌種液的長(zhǎng)期保存(5-10)。(4)接種環(huán)：用于菌種取樣、接種。(5)電動(dòng)離心機(jī)：用于液體菌種濃縮和采收。第5頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三(6)空壓機(jī)：用于微氣方式培養(yǎng)。(7)電風(fēng)扇和排氣風(fēng)扇：用于培養(yǎng)時(shí)控溫、調(diào)穩(wěn)。(8) 分析天平：用于試驗(yàn)產(chǎn)品烘干后的稱重及分析稱樣等。(9）此外，應(yīng)還有分液漏斗、載波片、蓋玻片、酒精燈及電光源(碘鎢燈、白熾燈泡等)設(shè)施及其支架、控溫設(shè)備和充氣設(shè)備。

4、第6頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1.光和細(xì)菌培養(yǎng)基的制備2.光合細(xì)菌菌種的分離3.菌種的培養(yǎng) 4.菌種的保存5.光和細(xì)菌的大量培養(yǎng) 6.光合細(xì)菌的培養(yǎng)技術(shù)和保種技術(shù)。第7頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三四、實(shí)驗(yàn)步驟與方法：（一）光和細(xì)菌培養(yǎng)基的制備Sawad培養(yǎng)基(1975)：用于單菌落分離和莢膜紅假單孢菌的培養(yǎng)。 第8頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三 1.微量金屬元素(T.m.) 貯液培方EDTA 2.5g ZnSO47H2O 10.95g MgSO4H2O 1.54g CuSO45H2O 0.39g

5、CoCl26H2O 0.2g FeSO47H2O 7.0g 蒸餾水 1000ml第9頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三 2.生長(zhǎng)素貯液培方：生物素 1mg 煙酸(尼克酸) 0.1mg 對(duì)氨基苯甲酸 10mg 維生素B1 100mg蒸餾水 1000ml。酵母膏和生長(zhǎng)素貯液二者有一即可(即：有了酵母膏就不必加生長(zhǎng)素)。第10頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三（二）光合細(xì)菌菌種的分離培養(yǎng)光和細(xì)菌，首先要有菌種，菌種可以從別的單位獲得。如果別的單位沒(méi)有適合的菌種，就要從自然生態(tài)環(huán)境中分離。分離菌種的工作要求雖然比較高，但也并非高不可攀，只要按照要求操作，就能

6、分離出需要的菌種。第11頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三1.采樣 要根據(jù)光和細(xì)菌的生態(tài)特點(diǎn)，選擇光和細(xì)菌大量分布的地方采樣。 目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)使用的光和細(xì)菌，主要是紅螺菌科的一些種類。這些光和細(xì)菌是以有機(jī)質(zhì)作為光和細(xì)菌的碳源和供氫體，故廣泛分布在被有機(jī)質(zhì)污染的地方，如河底、湖底、海底、水田、溝渠和污水池塘的泥土以及豆制品廠、淀粉廠和食品工業(yè)等廢水排水溝處呈橙黃色或分紅色的泥土中。 第12頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三光和細(xì)菌在污水池塘等有機(jī)質(zhì)含量豐富的地方，分布數(shù)量更大。在以上所述地方都可以采集樣品。采樣工具有杯、采水器和采泥器，淺水處直接用杯

7、舀取少量樣品，深水處借用采水器和采泥器采樣，采集到的底泥連同水一起放入廣口瓶中帶回。第13頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三2.富集培養(yǎng)采集的樣品中光和細(xì)菌的數(shù)量一般較少，并且含有不少雜菌，難以直接進(jìn)行分離，必須進(jìn)行富集培養(yǎng)。所謂富集培養(yǎng)，就是為要分離的光和細(xì)菌提供適宜的培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件，使其大量增殖。同時(shí)抑制雜菌的生長(zhǎng)。第14頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三 富集培養(yǎng)除了培養(yǎng)基以外，還要給培養(yǎng)物制造缺氧的培養(yǎng)環(huán)境。為此，先將采回的樣品(泥土或水)裝入玻璃圓筒或大型試管或具塞的磨口玻璃瓶中，再倒入預(yù)先配制好的液體培養(yǎng)基，充分?jǐn)嚢瑁箻悠放c培養(yǎng)基充分

8、分散混合，然后在玻璃圓筒或大型試管中加入液體石蠟，以完全隔絕空氣，防止空氣中的氧氣溶解于培養(yǎng)基中（圖1，a）。光和細(xì)菌的富集培養(yǎng)法a.玻璃圓筒富集培養(yǎng)法 b.具塞磨口玻璃瓶富集培養(yǎng)法 1.液體石蠟 2.橡皮圈 3. 塑料布第15頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三如果用具塞的磨口瓶，則要加滿培養(yǎng)液，蓋上瓶塞，讓多余的培養(yǎng)液總瓶口溢出，瓶?jī)?nèi)不能有氣泡存在。瓶口套上塑料薄膜，用橡皮筋扎以減少水分蒸發(fā)（圖1，b）。第16頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三為了加快光和細(xì)菌的增殖，除了缺氧的環(huán)境條件以外，適宜的溫度和光照度也很重要。培養(yǎng)溫度一般為2530 ，光照

9、強(qiáng)度為500010000lx，最好一天24h連續(xù)光照，經(jīng)過(guò)26周的富集培養(yǎng)，在培養(yǎng)容器的內(nèi)壁逐漸出現(xiàn)光和細(xì)菌菌落，或整個(gè)培養(yǎng)液長(zhǎng)成紅色。一般地說(shuō)，海水光和細(xì)菌比淡水光和細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，故富集培養(yǎng)的時(shí)間更長(zhǎng)。第17頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三如果富集培養(yǎng)初步獲得成功，就用吸管或移液管插入菌液中或光和細(xì)菌大量繁殖的泥層中，將菌液吸入大型試管或具塞磨口瓶中，加入培養(yǎng)基，按前述的方法和條件繼續(xù)培養(yǎng)。反復(fù)多次后，光和細(xì)菌壓倒其他細(xì)菌而占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，培養(yǎng)液呈深紅色，這時(shí)富集培養(yǎng)成功。 第18頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三（ 3）分離方法一旦富集培養(yǎng)成功，就

10、可以分離培養(yǎng)。淡水生長(zhǎng)的紫色非硫細(xì)菌生長(zhǎng)速度較快，在一周左右移植比較合適，而海水生長(zhǎng)的紫色非硫細(xì)菌生長(zhǎng)速度較慢，培養(yǎng)三周以上才能移植。菌種的分離一般采用平板分離法。平板分離法是使待分離的菌種以單個(gè)細(xì)胞在平板培養(yǎng)基上分散開(kāi)，形成一個(gè)個(gè)菌落，從而達(dá)到分離的目的。第19頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三紅螺菌屬的分離方法:利用紅螺菌屬細(xì)菌具有快速運(yùn)動(dòng)的能力來(lái)分離這種細(xì)菌的方法。在載波片上加一滴無(wú)菌水，再在它的近旁加一滴紫色非硫細(xì)菌的富集培養(yǎng)液，無(wú)菌水旁加一滴培養(yǎng)液，當(dāng)培養(yǎng)液與無(wú)菌水滴結(jié)合時(shí)，紅螺菌較其他微生物更快地達(dá)到培養(yǎng)液的部位，用微吸管吸出到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，這樣反復(fù)移植幾

11、次后，就能在瓊脂斜面或平板上分離取得紅螺菌的菌落，并進(jìn)一步分離而取得純培養(yǎng)物。第20頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三4.菌種的培養(yǎng)(1)培養(yǎng)方式大量培養(yǎng)光和細(xì)菌，通常采用兩種方式進(jìn)行培養(yǎng)。一種是全封閉式厭氣光照培養(yǎng)方式，另一種是開(kāi)放式微氣光照培養(yǎng)方式。第21頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三(1) 全封閉式厭氣光照培養(yǎng)全封閉式厭氣光照培養(yǎng)是采用無(wú)色透明的玻璃容器或塑料薄膜袋，經(jīng)消毒后，裝入消毒好的培養(yǎng)液接入20%50%的菌種母液，使整個(gè)容器均被液體充滿，加蓋（或扎緊袋口），造成厭氣的培養(yǎng)環(huán)境，置于有陽(yáng)光的地方或人工光源進(jìn)行培養(yǎng)，定時(shí)攪動(dòng)，在適宜的溫

12、度下，因經(jīng)過(guò)510天的培養(yǎng)，即可達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期高峰，此時(shí)可采收或進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。第22頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三(2) 開(kāi)放式微氣光照培養(yǎng)開(kāi)放式微氣光照培養(yǎng)，一般采用容量為100200L的塑料桶或500L的鹵蟲(chóng)孵化桶為培養(yǎng)容器。底部成錐形并有排放開(kāi)關(guān)的鹵蟲(chóng)孵化桶比較理想。在桶底部裝一氣石，培養(yǎng)時(shí)微充氣，是桶內(nèi)的光和細(xì)菌呈上下緩慢翻動(dòng)。在桶的正上方距桶面30cm左右裝一有罩的白熾燈泡，使液面照度達(dá)2000lx左右。培養(yǎng)前把容器消毒，加入消毒好的培養(yǎng)液，接入20%50%的菌種母液，照明，微氣培養(yǎng)。在適宜的溫度下，因經(jīng)過(guò)710d的培養(yǎng)，即可達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期高峰，此時(shí)可采收

13、或進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。第23頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三(2) 培養(yǎng)方法光和細(xì)菌的培養(yǎng)，按次序分為容器、工具的消毒，培養(yǎng)基的制備，接種和培養(yǎng)管理四個(gè)步驟(1) 容器、工具的消毒所有培養(yǎng)用容器(如試管、三角燒瓶等)、工具(如移液管、分液漏斗等)都必須在用前用去污粉、洗液、或肥皂粉等刷洗并沖洗干凈，如果玻璃瓶壁上有白色菌膜或碳酸容器、工具洗刷干凈后，用以下幾種方法進(jìn)行消毒滅菌:第24頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三1)加熱消毒法 A 直接燒灼消毒B 煮沸消毒C 高溫烘箱干燥消毒(干熱滅菌)D 高壓蒸汽消毒(濕熱滅菌)E 化學(xué)藥品消毒法a.酒精(C2H

14、5OH)： b.高錳酸鉀(KMnO4)：c.石炭酸(酚C6H6OH)： d.鹽酸(HCl)： 第25頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三2)培養(yǎng)基的配制3)滅菌和消毒 (3)接種培養(yǎng)基配好后(培養(yǎng)基需冷卻的要冷卻到適宜的溫度，應(yīng)立即進(jìn)行接種。開(kāi)始時(shí)由于菌種數(shù)量少，先在試管中培養(yǎng)，然后再逐漸往大培養(yǎng)容器接種。隨著菌種數(shù)量增加，可以加大接種量，掌握在20%50%，即菌種母液量和新配培養(yǎng)液量之比為1:4(20%)1:1(50%)，尤其是微氣培養(yǎng)，接種量不應(yīng)低于1:4(20%)。(4)培養(yǎng)管理第26頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三光和細(xì)菌的培養(yǎng)過(guò)程中，管理工

15、作包括： A.日常管理操作和測(cè)試； B.生長(zhǎng)情況的觀察和檢查； C.出現(xiàn)問(wèn)題的分析處理。第27頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三1) 日常管理操作和測(cè)試a.攪拌和充氣b.調(diào)節(jié)光照度 c.調(diào)節(jié)溫度： 2) 生長(zhǎng)情況的觀察和檢查3)問(wèn)題的分析和處理第28頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三3)問(wèn)題的分析和處理通過(guò)日常管理、檢測(cè)、檢查，了解光和細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，就可以結(jié)合當(dāng)時(shí)的環(huán)境條件的變化進(jìn)行分析，找出影響光和細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的原因，采取相應(yīng)的措施。第29頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三影響光和細(xì)菌生長(zhǎng)的原因很多：內(nèi)因：菌種是否優(yōu)良。外因

16、：光照、溫度、pH值、營(yíng)養(yǎng)、敵害、厭氣程度等。光照、溫度、pH值同時(shí)影響著光和細(xì)菌的生長(zhǎng)，而且光照、溫度、pH值之間是互相制約的，即溫度高，光照應(yīng)弱；溫度低，光照應(yīng)強(qiáng)。如果溫度高，光照強(qiáng)，pH值就會(huì)迅速升高，培養(yǎng)基產(chǎn)生沉淀，抑制光和細(xì)菌的生長(zhǎng)。如果溫度低，光照弱，光和細(xì)菌得不到最佳能源，生長(zhǎng)速度也慢。經(jīng)試驗(yàn)得出光和細(xì)菌生長(zhǎng)的最適條件是：溫度1520時(shí)，光照3000050000lx，培養(yǎng)基pH值為7.0；溫度2530時(shí)，光照為30005000lx，培養(yǎng)基pH值為7.0。 第30頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三光和細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中的問(wèn)題分析例1 出現(xiàn)問(wèn)題：測(cè)定pH值無(wú)大變化，

17、O.D.值不上升，生長(zhǎng)受阻。檢查結(jié)果：水溫42，其余條件正常。分析原因：溫度超出生長(zhǎng)適應(yīng)范圍。第31頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三例2出現(xiàn)問(wèn)題：測(cè)定O.D.值，升高較慢，光和細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖不快。檢查結(jié)果：磁力攪拌棒偏于邊緣，不起攪拌作用，其余條件正常。分析原因：菌液無(wú)攪拌，影響光和細(xì)菌的生長(zhǎng)。第32頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三例3出現(xiàn)問(wèn)題：測(cè)定pH值和O.D.值均不上升，發(fā)生附壁現(xiàn)象。檢查結(jié)果：環(huán)境條件正常，培養(yǎng)措施得當(dāng)。分析原因：培養(yǎng)基配制出現(xiàn)差錯(cuò)，對(duì)光和細(xì)菌不適合，菌種老化。第33頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三4.菌種的保存保存菌種的培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基。其配方與分離菌種的培養(yǎng)基相同。也可以根據(jù)分離菌株的特殊要求而另行配制。保存方法第34頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，22點(diǎn)7分，星期三1、培養(yǎng)基盛于小型試管中，經(jīng)滅菌處理待冷卻凝固后備用。2、將分離出來(lái)的菌種，穿刺接種于盛有固體培養(yǎng)基的試管中。3、將接種試管置于厭氧光照條件下培養(yǎng)，待長(zhǎng)好后取出。4、在光和細(xì)菌已充分生長(zhǎng)的試管中，加入無(wú)菌液體石蠟，以隔絕空氣。也可將保存用的菌株試管，放入大型試管中，其底部加吸氧劑（焦性沒(méi)食子酸碳酸鈉），大試管用塞子塞緊并減壓抽氣（圖4）。5、放入溫度34的冰箱