實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍(lán)染色法

1、關(guān)于實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)含量測定考馬斯亮藍(lán)染色法第1頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三 Please be quiet, 上課了！第2頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三 1、學(xué)習(xí)利用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定蛋白質(zhì)含量的原理及方法； 2、掌握分光光度計(jì)的使用方法； 3、掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模旱?頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三 考馬斯亮藍(lán)G-250在酸性溶液中游離狀態(tài)下為棕紅色。 當(dāng)它與蛋白質(zhì)通過范德華鍵結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色. 蛋白質(zhì)染料復(fù)合物對595nm可見光有最大光吸收. 在一定范圍內(nèi)（ 10 -1000ug/ml）其

2、OD595nm值與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用分光光度法進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量測定。二、實(shí)驗(yàn)原理：第4頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三考馬斯亮藍(lán)G-250染色法原理465 nm595 nm酸性環(huán)境下呈棕紅色與蛋白質(zhì)結(jié)合變藍(lán)色加入蛋白質(zhì)第5頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三雙縮脲反應(yīng)：Folin-酚試劑法（Lowry法）：紫外吸收法：微量凱式定氮法：其他蛋白質(zhì)含量的測定方法第6頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三（1）雙縮脲法： 原理是蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵（-CO-NH-）因此，有雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2+形成紫色絡(luò)合物，

3、其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，故可以用來測定蛋白質(zhì)含量.第7頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三（2）Folin-酚試劑法（Lowry法）： 是雙縮脲法的發(fā)展，第一步涉及到堿性溶液中銅蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成，然后這個(gè)復(fù)合物還原磷鉬酸磷鎢酸試劑，產(chǎn)生深藍(lán)色（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)混合物）比雙縮脲法靈敏，但費(fèi)時(shí)； 第8頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三（3）紫外吸收法： 蛋白質(zhì)中Trp，Phe，Tyr的殘基中的苯環(huán)含有共軛雙鍵，吸收高峰在280nm處，所以蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，并且蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與其含量成正比，可用作定量測定。 簡單、靈敏、快速、不耗樣品，低濃

4、度的鹽類不干擾。 第9頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三（4）微量凱式定氮法： 根據(jù)蛋白質(zhì)的平均含氮量為16%，因此，測得1g蛋白氮，相當(dāng)于6.25g蛋白質(zhì)。 第10頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三 1、 實(shí)驗(yàn)材料：豆芽 2、儀器：(1)S-22pc可見光分光光度計(jì) (2)研缽 (3)離心機(jī) (4)試管 (5)容量瓶等 3、試劑：（1）染色液：考馬斯亮藍(lán)G-250 (100mg 考馬斯亮藍(lán)溶于50ml 95%乙醇，加100ml 85%磷酸，加水稀釋至 1L)（2）濃度：0.25mg/ml的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。 三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑：第11頁，

5、共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三 1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線： 取7支試管，依次分別加入0.0，0.10, 0.15, 0.20, 0.30, 0.40, 0.50ml的牛血清蛋白溶液，用水補(bǔ)足到0.5ml，每管均再加5ml染色液，立即搖勻，置室溫下放置5分鐘。然后測各管的OD595nm 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。四、實(shí)驗(yàn)步驟： 第12頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三制作標(biāo)準(zhǔn)曲線： 編號1(空白）234567樣品標(biāo)準(zhǔn)蛋白 (ml)0.00.10.150.20.30.40.50.5ml 水(ml)0.50.40.350.30.20.10.0濃度(mg/ml)0.00.0

6、50.0750.10. 150.20.25C0染色液(ml)55555 55 5OD值第13頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度OD值0樣品OD值C00.05 0 .0750.1 0.150.20.25OD1OD2OD3OD4OD5OD6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（圖）y=ax+bR2=第14頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制目的：得到樣品中蛋白質(zhì)的濃度。首先，用一組已知濃度的蛋白質(zhì)溶液與考馬斯亮藍(lán)G-250反應(yīng),然后在595 nm處測定吸光度（OD）。其次，繪制濃度與吸光度對應(yīng)的曲線圖。最后，測定樣品蛋白質(zhì)的吸光度然后在曲線上找到對

7、應(yīng)的濃度。第15頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三 稱取豆芽葉片2g 研缽中加2ml水研成勻漿轉(zhuǎn)入離心管用水分三次沖洗研缽，每次2ml均轉(zhuǎn)入同一離心管 等重后4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘取上清液轉(zhuǎn)入25ml容量瓶定容。2、樣品蛋白質(zhì)提?。旱?6頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三 吸取0.5ml提取液于試管中,加入考馬斯亮藍(lán)G-250 染色劑5ml，充分混勻，放置5分鐘，測OD595nm，記錄結(jié)果，查曲線，得蛋白質(zhì)濃度C0(mg/ml)。3、測定：第17頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三分光光度技術(shù) 利用紫外光、可見光、紅外光和激光

8、等測定物質(zhì)的吸收光譜，利用此吸收光譜對物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析和物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的方法，稱為分光光度法或分光光度技術(shù)，使用的儀器稱為分光光度計(jì). 紅外吸收光譜：波長范圍2.51000 m,主要用于有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)鑒定。 紫外吸收光譜：波長范圍200400 nm（近紫外區(qū)）可用于結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析。 可見吸收光譜：波長范圍400750 nm ，主要用于溶液等的定量分析。第18頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三 朗伯比爾(Lambert-bee)光吸收定律： Alg（I0/It) -lgT b c（1）A吸光度 “OD”：描述溶液對光的吸收程度； 同一種溶液對不同波長光的吸光度是不相同

9、的，在吸光度最大處所對應(yīng)的波長稱為最大光吸收處。同一種物質(zhì)不同濃度的吸光度，在某一定波長下有差異，在最大光吸收處吸光度的差異最大。這是分光光度法進(jìn)行物質(zhì)定量分析的重要依據(jù)。I0：表示入射光強(qiáng)度，It ：表示光線通過溶液后的強(qiáng)度。光吸收定律：第19頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三（2）T透光度：描述入射光透過溶液的程度； （3）摩爾吸光系數(shù)(是溶液的特征常數(shù))，在數(shù)值上等于濃度為1mol/L、液層厚度為1cm時(shí)該溶液在某一波長下的吸光度；單位molL1；（4）b樣品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收地，b=1cm（5）C樣品濃度（mol/L）由上式可以看出：吸光度O

10、D與物質(zhì)的濃度“C”和溶液吸光的厚度成正比。 Alg（I0/It)=-lgTb c第20頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三 分光光度計(jì)的組成和構(gòu)造： （1）光源； （2）單色器 （3）吸收池； （4）接收檢測放大系統(tǒng)(檢測器)； （5）信號指示系統(tǒng)(顯示或記錄器)。第21頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三 光源： 用于可見光光源是鎢燈和鹵鎢 ，現(xiàn)在最常用的是鹵鎢燈（Halogen lamp），適用波長范圍是3201100nm。 用于紫外光區(qū)的是氫燈和氘燈適用波長范圍是195400nm。第22頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三 單

11、色器：單色器是分光光度計(jì)的心臟部分。把來自光源的混合光波分解為單一波長的光能隨意改變光的波長。單色器一般由入射狹縫、準(zhǔn)光器（透鏡或凹面反射鏡使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狹縫等幾部分組成。其核心部分是色散元件:主要是棱鏡和光柵第23頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三吸收池吸收池（即比色杯）：用來盛裝被測試的溶液。光學(xué)比色杯和石英比色杯兩種。 光學(xué)比色杯適用波長范圍是400nm2000nm ，只能用于可見光。 石英比色杯可透過紫外光、可見光和紅外光， 是最常使用的吸收池，使用波長范圍是180nm3000nm。光程可由0.1cm至10cm，最常用的是1cm池（容

12、積3ml）第24頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三比色杯使用注意事項(xiàng)： 比色杯在使用前后都要徹底的清洗。 嚴(yán)禁用手指觸摸透光面，因指紋不易洗凈。 嚴(yán)禁用硬紙和布擦拭透光面，只能使用鏡頭紙和綢布。 嚴(yán)禁加熱烘烤。急用干的杯子時(shí)，可用酒精蕩洗后用冷風(fēng)吹干。決不可用超聲波清洗器清洗。 第25頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三 檢測器： 檢測器是一種光電轉(zhuǎn)換設(shè)備，即把光強(qiáng)度以電訊號顯示出來，常用的檢測器有光電管，光電倍增管和光電二極管等。 顯示裝置：分光光度計(jì)現(xiàn)在已都使用數(shù)字顯示，有的還連有打印機(jī)。高性能分光光度計(jì)均可以連接微機(jī)，而且有的主機(jī)還使用帶液晶或C

13、RT熒屏顯示的微處理機(jī)和打印繪圖機(jī)，有的還帶有標(biāo)準(zhǔn)軟驅(qū)，存取數(shù)據(jù)更加方便。第26頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三偏離朗伯比耳定律的原因 標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定未知溶液的濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線常發(fā)生彎曲（尤其當(dāng)溶液濃度較高時(shí)），這種現(xiàn)象稱為對朗伯比耳定律的偏離。 引起這種偏離的因素（兩大類）： （1）物理性因素，即儀器的非理想引起的； （2）化學(xué)性因素。第27頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三（1）物理性因素 難以獲得真正的純單色光。 朗伯比耳定律的前提條件之一是入射光為單色光。 分光光度計(jì)只能獲得近乎單色的狹窄光帶。復(fù)合光可導(dǎo)致對朗伯比耳定律的正或負(fù)偏離。 非單色光、雜散光、散射光和反射光、非平行入射光都會引起對Beer-Lambert定律的偏離，最主要的是非單色光作為入射光引起的偏離。 第28頁，共31頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三(2) 化學(xué)性因素 朗比耳定律的假定：所有的吸光質(zhì)點(diǎn)之間不發(fā)生相互作用；假定只有在稀溶液(c10 2 mol/L 時(shí)，溶液中溶質(zhì)可因濃度改變而有離解、締合、互變異構(gòu)、配合物的形成和與溶劑間的作用，使吸光質(zhì)點(diǎn)的濃度發(fā)生變化，影響吸光度。 例： 鉻酸鹽或重鉻酸鹽溶液中存在下列平衡： CrO42- 2H = Cr2O72- H