實(shí)驗(yàn)一質(zhì)粒的提取

1、關(guān)于實(shí)驗(yàn)一質(zhì)粒的提取第1頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑 實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論 第2頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私鈮A法提取質(zhì)粒的原理；掌握堿法提取質(zhì)粒的方法；掌握DNA瓊脂糖電泳的原理和方法。第3頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三實(shí)驗(yàn)原理質(zhì)粒是一種細(xì)菌染色體外的、具有自主復(fù)制能力的、共價閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)的小型DNA分子。堿裂解法提取質(zhì)粒是實(shí)驗(yàn)室常用的方法。這種方法是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們。第4頁，共27頁，2022年

2、，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三結(jié)構(gòu)的三大要素： 多克隆位點(diǎn) 選擇標(biāo)記（耐藥性，LacZ） 獨(dú)立的復(fù)制單位種類： 質(zhì)粒 噬菌體 酵母人工染色體（YAC） 反轉(zhuǎn)錄病毒載體 表達(dá)載體等第5頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三第6頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三pET-32a VectorThe pET System is the most powerful system yet developed for the cloning and expression of recombinant proteins in E. coli. 第7頁，共27頁，202

3、2年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三pET-32 cloning/expression region第8頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三Vector (pET-32a)Gene fragment (SmPR10)pET-32a-SmPR10第9頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三 質(zhì)粒的分離是利用質(zhì)粒DNA與染色體DNA在變性與復(fù)性中的差異來達(dá)到的目的。 當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液(堿性條件pH 12.5)中裂解時，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，由于染色體DNA與質(zhì)粒DNA拓樸構(gòu)型不同，染色體DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，而共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵雖被斷裂，但兩

4、條互補(bǔ)鏈彼此相互盤繞仍會緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入乙酸鉀溶液pH恢復(fù)至中性時, 在高鹽濃度的情況下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等形成沉淀；不同的是，質(zhì)粒DNA復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，保持可溶狀態(tài)而留在上清中。這樣，通過離心可沉淀大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)。除去沉淀后上清中的質(zhì)?？捎梅勇确鲁樘徇M(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。用異丙醇或乙醇沉淀后洗滌，可得到較純的質(zhì)粒DNA。 4000kb1kb到200kb第10頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑 （一） 儀器 1. 恒溫?fù)u床 2. 超凈工作臺 3. 高壓滅菌鍋 4. 高速

5、臺式離心機(jī) 5. 微量取液器 第11頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三第12頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三第13頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三第14頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三第15頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三（二） 材料 大腸桿菌E. coli DH 5含重組質(zhì)粒pET-32a-SmPR10第16頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三（三） 試劑 1. LB液體培養(yǎng)基（1L） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去離子水至

6、800ml，攪拌，使溶質(zhì)完全溶解，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，加入去離子水至總體積為1升，高壓蒸汽滅菌20 分鐘。 LB固體培養(yǎng)基（1L） 在上述LB液體培養(yǎng)基（1L）中加入瓊脂粉15g。 第17頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三2. 溶液：葡萄糖（50mmol/L ）；TrisHCl（ 25mmol/L， pH8.0）； EDTA （10mmol/L）3. 溶液： NaOH （0.2mol/L） ；SDS （ 1%，新鮮配制）4. 溶液： 60ml的 5mol/L KAC ； 11.5ml的冰醋酸 ； 28.5ml H2O溶液I：低濃度的葡萄糖溶液使細(xì)胞處于低滲狀態(tài)而

7、細(xì)胞澎脹；葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，減少抽提過程中的機(jī)械剪切作用，防止破壞DNA。 EDTA的作用是螯和掉Mg2+、Ca2+等二價金屬離子，防止DNA酶對質(zhì)粒分子的降解作用。 TrisCl能使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍。溶液II：SDS的作用：破壞細(xì)胞膜；解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性。 NaOH(pH12)的作用：破壞氫鍵，使DNA分子變性。溶液III：由KAc與HAc組成，是pH值為5.5的高鹽溶液。能中和溶液II的堿性，使DNA復(fù)性。但是質(zhì)粒DNA與染色體DNA復(fù)性的速度不同。K+離子會與SDS形成溶解度很低的鹽并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去。溶液中的染色體DNA也會與蛋白質(zhì)-

8、SDS形成相互纏繞的大分子物質(zhì)，很容易與小分子的質(zhì)粒DNA分離。第18頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三5. 氨芐青霉素（Amp） 用無菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20冰箱保存?zhèn)溆谩?. RNaseA 將RNA 酶 A溶于10 mmol/L Tris.Cl (pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中， 配成10 mg/ml的濃度，于100加熱15分鐘，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于-20。 7. 酚/氯仿(1:1)，氯仿/異戊醇(24:1)，乙醇 ，75%乙醇。 第19頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三實(shí)驗(yàn)步驟 質(zhì)粒的提取 1.

9、用滅菌的牙簽挑取單菌落放入1-2ml LB液體培養(yǎng)基（含Amp 0.1 mg/ml ）中，37振蕩培養(yǎng)過夜。 2. 將菌液倒入1.5 ml Eppendorf管中，10,000 rpm離心1min，棄上清液。3. 加入100 l SolutionI，渦旋使細(xì)胞充分懸浮。 4. 加入200 l SolutionII，立即上下顛倒離心管5-10次，使之混勻（注意動作輕），冰上放置5min。 5. 加入150 l SolutionIII，立即上下顛倒離心管5-10次，使之混勻（注意動作輕） ，冰上放置5min。 第20頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三6. 15,000rpm，

10、離心10min，將上清移至一干凈的1.5 ml Eppendorf 管中，注意所取體積（約400 l ） 。 7. 加入等體積酚/氯仿（1:1），顛倒數(shù)次混勻（注意動作輕），12,000rpm，4，離心3min，取上清液。 8. 小心吸取上清液中至一干凈的1.5 ml Eppendorf 管中，加入等體積的氯仿/異戊醇（24:1），顛倒數(shù)次混勻， 12,000rpm，4，離心3min，取上清液。 第21頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三9. 小心吸取上清液中至一干凈的1.5 ml Eppendorf 管中，加入2倍體積的無水乙醇，顛倒混勻，于冰上放置10min， 4離心，

11、15,000rpm，10min。10. 棄上清，加1ml 75%乙醇漂洗沉淀， 4離心，10,000rpm，5min。11. 去掉上清（注意沉淀勿丟失），室溫或真空干燥沉淀。 12. 加入50 l TE buffer，室溫振蕩溶解質(zhì)粒DNA。第22頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增1. 挑取瓊脂培養(yǎng)板上的單菌落至2ml LB培養(yǎng)液中（含Amp100 g/ml) 37搖蕩培養(yǎng)過夜。2. 取1ml菌液轉(zhuǎn)接到一個含有100 ml LB培養(yǎng)液三角瓶中(含 Amp100 g/ml ）, 37搖蕩培養(yǎng)過夜。37振搖過夜37振搖過夜第23頁，共27頁，2022年，5月

12、20日，22點(diǎn)8分，星期三 Tiangen質(zhì)粒DNA 小量提取試劑盒（實(shí)際用）操作過程1. 柱平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500 l 的平衡液BL，12,000 rpm 離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。2. 將1-2ml 過夜培養(yǎng)的細(xì)菌菌液加入1.5ml 離心管中，12,000rpm離心1分鐘，并棄去上清液。如有需要，可多次重復(fù)步驟2，以收集更多細(xì)菌菌體。但勿過量，以免影響提取質(zhì)粒的質(zhì)量。3. 加200 l 溶液P1（用前檢查是否已加入RNase A），重懸細(xì)菌體沉淀，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀。第24頁，共27頁，2022年，5月

13、20日，22點(diǎn)8分，星期三4. 加200 l 溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。注意不要劇烈振動，以防止基因組DNA 被打斷，注意不要讓反應(yīng)持續(xù)超過5 分鐘。5. 加300 l 溶液P3，立即輕柔顛倒離心管6-8 次，充分混勻，此時溶液應(yīng)該出現(xiàn)白色絮狀沉淀。6. 12,000rpm離心10 分鐘。如離心機(jī)轉(zhuǎn)速不夠可延長離心時間，直至形成緊密的白色沉淀。7. 將步驟6 離心后得到的上清液轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中，12,000rpm離心30-60秒，并棄去接液管內(nèi)液體。8. 向吸附柱CP3 內(nèi)加600 l漂洗液PW ，12,000rpm 離心30-60 秒，并棄去收集管內(nèi)廢液。9. 重復(fù)第8 步一次。第25頁，共27頁，2022年，5月20日，22點(diǎn)8分，星期三10.將吸附柱CP3 放入收集管中，12,000 rpm 離心2分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實(shí)驗(yàn)。為確保下游實(shí)驗(yàn)不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱CP3開蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾