實驗四基因組的提取和檢測

1、關于實驗四基因組的提取和檢測第1頁，共14頁，2022年，5月20日，22點13分，星期三實驗目的：1.了解真核生物基因組DNA提取的一般原理。2.了解基因組DNA的實驗用途。3. 掌握基因組DNA提取的方法和步驟。第2頁，共14頁，2022年，5月20日，22點13分，星期三材料：花椰菜/昆蟲組織設備：移液器，高速離心機，水浴鍋，培養(yǎng)箱 。試劑：1. CTAB組織消化液2. 氯仿3. 無水乙醇4. TE緩沖液第3頁，共14頁，2022年，5月20日，22點13分，星期三CTAB溶液配制2%CTAB溶液：100mmol/L Tris-HCl, pH7.0；1.4mol/L NaCl；20mmo

2、l/L EDTA；2%CTAB.10 mlfinal conc.（終濃度）CTAB0.2 g2%H2O5.78 ml1 M Tris-HCl1.0 ml100 mM5 M NaCl2.8 ml1.4 M0.5 M EDTA0.4 ml20 mM第4頁，共14頁，2022年，5月20日，22點13分，星期三實驗原理（CTAB法）CTAB，十六烷基三甲基溴化銨，是一種陽離子去污劑，可使細胞破裂，釋放出核酸；CTAB溶液中含有1.4mol/LNaCl，有助于溶解釋放出來的DNA （ DNA在2mol/LNaCl中DNA具有較高的溶解度）；加入無水乙醇，可以使DNA從溶液中沉淀出來。第5頁，共14頁，

3、2022年，5月20日，22點13分，星期三實驗步驟（常溫操作，2人一組）取適量(300-500mg)植物組織，加入2ml CTAB抽提緩沖液，充分勻漿2-3min，然后每人轉移700ul的勻漿液至一支1.5ml離心管中，65水浴45min（中間搖動2-3次）（裂解細胞，釋放核酸和蛋白）；加入700ul的氯仿，上下搖動2-3min (此步是萃取組織液中的蛋白質；務必帶上手套?。?12000rpm離心10min，取400ul上清液轉移至一支1.5ml離心管中（由于此時懸液已經分層，而我們需要取最上層的溶液，所以注意千萬不要使槍頭觸碰到中間的雜質層，當然，更不能取吸取下層的萃取液了）；加入1/1

4、0體積的NaAc(3mol/L,pH5.2）（40ul），上下顛倒3-4次混勻；然后再加入2倍體積的無水乙醇（0.9ml)，上下顛倒3-4次混勻（如DNA量大，此時可見絮狀DNA沉淀。（如果放置于-20度過夜，DNA產率會更多?。┑?頁，共14頁，2022年，5月20日，22點13分，星期三12000rpm離心5min，緩緩倒掉上清液（剩余的液體可以用移液器吸走），管底的沉淀即DNA（無色透明膠狀物！）；加入200ulTE緩沖液（含50ug/ml RNase），輕彈管底，以溶解DNA；也可以用槍頭緩慢地來回吸放液體來幫助溶解DNA。此時應該可以看到片狀的DNA沉淀物逐漸變少，最終消失。（一定要

5、使DNA完全溶解于TE中，否則影響電泳效果?。粚NA溶液置于37 培養(yǎng)箱或水浴中30min（降解殘留的RNA） ；-20 保存?zhèn)溆谩Ｈ?10ulDNA（加適量loading buffer）電泳檢測；取2ulDNA測定濃度和OD260/280（下次課電泳檢測）。第7頁，共14頁，2022年，5月20日，22點13分，星期三基因組DNA的檢驗（純度）紫外分光光度法：核酸在260nm處有最大吸收峰蛋白質在280nm處有最大吸收峰鹽和小分子在230nm處有最大吸收峰1.7OD260/OD2802.0第8頁，共14頁，2022年，5月20日，22點13分，星期三基因組DNA的檢驗（完整性）凝膠電泳法

6、： 基因組DNA電泳，在電場中泳動慢，如果發(fā)生降解，可出現電泳圖譜脫尾現象。 第9頁，共14頁，2022年，5月20日，22點13分，星期三 M 1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6 123456材料質量（mg）100300500100300500所加TE體積（ul）200200200400400400260/2802.031.971.922.072.022.01260/2302.102.312.192.051.952.02濃度（ng/ul）254.5454.4569.5139.6262.1320.0上樣2ul上樣8ul注：1-6序號分別與表中對應。第10頁，共14頁，2022年，5月20日，22點13分，星期三核酸的貯存DNA保存1）短期貯存： 4或-20存放于TE（Tris和EDTA）緩沖液中。 TE緩沖液(PH為8.0)，可減少DNA脫氨反應；EDTA可以抑制DNase的活性。2）長期貯存： TE緩沖液中-70保存數年；第11頁，共14頁，2022年，5月20日，22點13分，星期三無水乙醇沉淀 沉淀前往往加入NaCl等鹽離子，作用是中和核酸分子表面的負電荷，減少分子間的排斥力，有助于分子之間的聚集。 無水乙醇可以吸收分子之間的水，使DNA沉淀析出，第12頁，共14頁，2022年，5月20日，22點13分，星期三基因組DNA提取的用途構