醫(yī)學實驗內(nèi)參的選擇

1、實驗內(nèi)參，即是在檢測細胞內(nèi)分子表達變化時選擇的參照物，其在細胞內(nèi)的表達 相對恒定，在處理因素作用條件下不會發(fā)生表達改變的基因。內(nèi)參同樣可以校正 上樣量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結果的準確性。1、管家基因最普通的內(nèi)參是內(nèi)源性參照基因，也就是管家基因（持家基因，house keeping gene）。管家基因是一類始終保持著低水平的甲基化并且一直處于活性轉錄狀態(tài)的基因， 高度保守并且在大多數(shù)情況下持續(xù)表達。其表達水平受環(huán)境因素影響較小，而且 是在個體各個生長階段的大多數(shù)，或幾乎全部組織中持續(xù)表達，或變化很小，因 此常存在于生物細胞核的常染色質中。它的表達只受啟動序列或啟動子與RNA 聚合

2、酶相互作用的影響，而不受其他機制調節(jié)。管家基因維持細胞最低限度功能所不可少的基因，如編碼組蛋白基因、編碼核糖 體蛋白基因、線粒體蛋白基因、糖酵解酶的基因等。這類基因在所有類型的細胞 中都進行表達，因為這些基因的產(chǎn)物對于維持細胞的基本結構和代謝功能是必不 可少的。*NM_OO11O1 Homo sapiens actin beta (ACTS) mRMAGGBB叫閘 00OD34 Homo sapiens aldolase A fnjc lose - b is phosph a te (ALOOA) mRNA3425VjM_002046 Homo sapiens giyceraidenyde-3

3、-ph06pnate dehydrogenase (GAPD) mRrJA828*N(J_00029l Homo sapiens phosphogycerate kinase PGK1) mRHA2727*r-lM_005566 Homo sapiens lactate dehydrogenase A (LOHAj mRNA21057jm_002954 Homo sapiens ribosomal protein S2?a(RPS27A) mRriAJi56JNM_OOO981 Homo sapiens ribosomal protein L19(RPL19). mRNA6997*?1_000

4、975 Homo sapiens ribosomal protein L11 (RPL11) mRNA6060*NM_007363 Homo sapiens non-POU domain 匚ontaining octamEnbinding (NONO). mRNA1 ?0&*NM_004309 Homo sapiens Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) alpha (ARHGDIA) mRNAi35B*NM_000994 Homo sapiens ribosomal protein L32 (RPL321 mRNA9523*NM_O22551 Homo

5、sapiens ribosomal protein S18 (RPS1B) mRNAH2&1tNM_007355 Homo sapiens near sncxK 90kDa protein 1 oeta (HSPCB). mRNA4H9部分人類管家基因列表2、內(nèi)參基因選擇的條件1、不存在假基因，以免基因組DNA的擴增；2、高度或中度表達，避免太高或太低的豐度；3、穩(wěn)定表達于不同類型的細胞和組織中，表達量無明顯差異；4、表達水平與細胞周期、活化等無關；5、不受外源性或內(nèi)源性因素的影響。3、不同管家基因在選擇管家基因作為內(nèi)參時，首先要按不同類型的分子選擇正確的內(nèi)參。曾看到有人用檢測miRNA時選擇

6、了 GAPDH作為內(nèi)參呢。a、檢測mRNA時的內(nèi)參通常使用的是 GAPDH、beta-actin、tubulinGAPHDGAPDH是糖酵解反應中的一個酶，由4個3040kDa的亞基組成，分子量146kDa。該酶基因為管家(house keeping)基因，幾乎在所有組織中都高水平 表達，在同種細胞或者組織中的蛋白質表達量一般是恒定的，且不受含有的部分 識別位點、佛波脂等的誘導物質的影響而保持恒定，故被廣泛用作抽提t(yī)otal RNA, poly(A)+ RNA，Western blot等實驗操作的標準化的內(nèi)參。beta-actinp-Actin (ACTB)是PCR常用的內(nèi)參，0-Actin抗

7、體是Western Blot很好的內(nèi)參 指數(shù)。p-Actin是橫紋肌肌纖維中的一種主要蛋白質成分，也是肌肉細絲及細胞 骨架微絲的主要成分，具有收縮功能，分布廣泛。另外，不同的組織來源的樣本在選擇內(nèi)參時還有一定的區(qū)別。比如一些少量特殊 的情況下，如脂肪組織或細胞內(nèi)，0-Actin的表達量就很少，不適合做內(nèi)參。tubulintubulin (微管蛋白)是球形分子，有兩種類型:a微管蛋白(a-tubulin)和0微管 蛋白(0-tubulin),這兩種微管蛋白具有相似的三維結構，能夠緊密地結合成二聚 體，作為微管組裝的亞基。a亞基由450個氨基酸組成，0亞基是由455個氨基 酸組成，它們的分子量約5

8、5 kDa。由于0-Tubulin的檢測分子量大約在55kD，因此該內(nèi)參抗體不是很適合用于檢 測50kD-60kD大小目標蛋白的WB實驗中。b、檢測蛋白時的內(nèi)參檢測蛋白時，常用蛋白內(nèi)參有GAPDH、0-Actin、0-tubulin。選擇的內(nèi)參要跟目 標蛋白分子量差5KD以上，所以需要根據(jù)目標蛋白的分子量來進行內(nèi)參的選擇。檢測核蛋白時的內(nèi)參當實驗樣品中只是核蛋白，而不是細胞總蛋白提取液時，可以用組蛋白H(Histone H)，或者核纖層蛋白(nuclear lamina protein)等為核內(nèi)參抗體。組蛋 白的基因非常保守,在親緣關系較遠的種屬中，四種組蛋白(H2A、H2B、H3、H4) 氨

9、基酸序列都非常相似,H1序列變化則很大。除了這些，其它常見的核蛋白內(nèi)參 還有 K70, K80, Lamin A和 B，在一些文獻報道中,Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。但是需要注意的問題是核蛋白內(nèi)參的 選擇需要考慮實際的試驗環(huán)境，比如在涉及細胞增殖相關試驗中，c-Jun由于自 身表達變化就不適合做內(nèi)參；而在凋亡實驗時，TBP、Lamin等也不適合作為內(nèi) 參。反之，組蛋白Hist one H2A.X及Histo ne H3.1等由于是染色體的組成型表 達組分，表達比較穩(wěn)定，經(jīng)常被作為最廣泛的核內(nèi)參使用。另 NUCLEIC ACI

10、DS RES.上是用 a-Tubulin , RESEARCH DIAGNOSTICS INC專門提到a-Tubuli n。(胞漿表達，存疑)c、檢測miRNA時的內(nèi)參small nuclear RNA (snRNA)和 small nucleolar RNA (snoRNA)長度與 miRNA相 近，200bp左右，在多種組織細胞中高表達，不涉及miRNA的調節(jié)途徑，且與 miRNA探針設計方法相同，所以snoRNA是很好的內(nèi)參選擇。Endogenous control genes recommendedsnoRNA assays: 18, ta and 5 for human, mouse

11、 and rat, resp. Human: U6. RNU48, RNU44, U47n and RNU6BMouse: snaRrJA-202. snoRNA-234, snoF?NA420-Least variable miRNA genesHuman/mouse tissues. miR-152, -186. -25. -92, -26b, -16Human/mouse cell lines miR-374T *16, -93. -156, -26b, -92-18S rRNA or U6常用內(nèi)參簡單介紹一下常用的內(nèi)參U6： U6是一類snRNA，它是由RNA聚合酶山轉錄。主要形成小核

12、核糖核蛋白顆粒，定位與細胞核內(nèi)，表達穩(wěn)定。d、檢測IncRNA時的內(nèi)參檢測IncRNA時，內(nèi)參選擇和mRNA 樣，可以選擇GAPDH、beta-actin等。GAPDH雖然在很多細胞實驗中都很穩(wěn)定，但是因為它是個糖代謝相關酶,在很多 糖代謝變化的實驗中都會劇烈變化，比如缺氧、缺血、糖尿病以及某些腫瘤細胞 中。因此內(nèi)參不是絕對的。同樣，beta-actin也不是絕對的，如果涉及到細胞骨 架重排，解聚，重組的實驗，beta-actin 一樣不可靠。如果不確定，可以多選幾 個內(nèi)參候選，找一個變化量小的。最后，18S rRNA也可以作為IncRNA檢測時 的內(nèi)參。當然，還有其他的內(nèi)參可以作為IncRNA檢測的內(nèi)參，如：RPL13Ae、檢測circRNA時的內(nèi)參檢測circRNA時可以用18S rRNA作為內(nèi)參。18S rRNA是一類核糖體RNA，所常用來進行生物分類的依據(jù)。由于18SrRNA 在生物中的表達比較保守，所以目前也用來作為內(nèi)參。用18s RNA作為RT-PCR的內(nèi)參，應該和0-actin是一個道理，半定量的目的 是要看總RNA中的目的基因mRNA的表達量，內(nèi)參的目的是去除一些