醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)參的選擇

1、實(shí)驗(yàn)內(nèi)參，即是在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)分子表達(dá)變化時(shí)選擇的參照物，其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá) 相對(duì)恒定，在處理因素作用條件下不會(huì)發(fā)生表達(dá)改變的基因。內(nèi)參同樣可以校正 上樣量、上樣過(guò)程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。1、管家基因最普通的內(nèi)參是內(nèi)源性參照基因，也就是管家基因（持家基因，house keeping gene）。管家基因是一類(lèi)始終保持著低水平的甲基化并且一直處于活性轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的基因， 高度保守并且在大多數(shù)情況下持續(xù)表達(dá)。其表達(dá)水平受環(huán)境因素影響較小，而且 是在個(gè)體各個(gè)生長(zhǎng)階段的大多數(shù)，或幾乎全部組織中持續(xù)表達(dá)，或變化很小，因 此常存在于生物細(xì)胞核的常染色質(zhì)中。它的表達(dá)只受啟動(dòng)序列或啟動(dòng)子與RNA 聚合

2、酶相互作用的影響，而不受其他機(jī)制調(diào)節(jié)。管家基因維持細(xì)胞最低限度功能所不可少的基因，如編碼組蛋白基因、編碼核糖 體蛋白基因、線(xiàn)粒體蛋白基因、糖酵解酶的基因等。這類(lèi)基因在所有類(lèi)型的細(xì)胞 中都進(jìn)行表達(dá)，因?yàn)檫@些基因的產(chǎn)物對(duì)于維持細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)和代謝功能是必不 可少的。*NM_OO11O1 Homo sapiens actin beta (ACTS) mRMAGGBB叫閘 00OD34 Homo sapiens aldolase A fnjc lose - b is phosph a te (ALOOA) mRNA3425VjM_002046 Homo sapiens giyceraidenyde-3

3、-ph06pnate dehydrogenase (GAPD) mRrJA828*N(J_00029l Homo sapiens phosphogycerate kinase PGK1) mRHA2727*r-lM_005566 Homo sapiens lactate dehydrogenase A (LOHAj mRNA21057jm_002954 Homo sapiens ribosomal protein S2?a(RPS27A) mRriAJi56JNM_OOO981 Homo sapiens ribosomal protein L19(RPL19). mRNA6997*?1_000

4、975 Homo sapiens ribosomal protein L11 (RPL11) mRNA6060*NM_007363 Homo sapiens non-POU domain 匚ontaining octamEnbinding (NONO). mRNA1 ?0&*NM_004309 Homo sapiens Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) alpha (ARHGDIA) mRNAi35B*NM_000994 Homo sapiens ribosomal protein L32 (RPL321 mRNA9523*NM_O22551 Homo

5、sapiens ribosomal protein S18 (RPS1B) mRNAH2&1tNM_007355 Homo sapiens near sncxK 90kDa protein 1 oeta (HSPCB). mRNA4H9部分人類(lèi)管家基因列表2、內(nèi)參基因選擇的條件1、不存在假基因，以免基因組DNA的擴(kuò)增；2、高度或中度表達(dá)，避免太高或太低的豐度；3、穩(wěn)定表達(dá)于不同類(lèi)型的細(xì)胞和組織中，表達(dá)量無(wú)明顯差異；4、表達(dá)水平與細(xì)胞周期、活化等無(wú)關(guān)；5、不受外源性或內(nèi)源性因素的影響。3、不同管家基因在選擇管家基因作為內(nèi)參時(shí)，首先要按不同類(lèi)型的分子選擇正確的內(nèi)參。曾看到有人用檢測(cè)miRNA時(shí)選擇

6、了 GAPDH作為內(nèi)參呢。a、檢測(cè)mRNA時(shí)的內(nèi)參通常使用的是 GAPDH、beta-actin、tubulinGAPHDGAPDH是糖酵解反應(yīng)中的一個(gè)酶，由4個(gè)3040kDa的亞基組成，分子量146kDa。該酶基因?yàn)楣芗?house keeping)基因，幾乎在所有組織中都高水平 表達(dá)，在同種細(xì)胞或者組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)量一般是恒定的，且不受含有的部分 識(shí)別位點(diǎn)、佛波脂等的誘導(dǎo)物質(zhì)的影響而保持恒定，故被廣泛用作抽提t(yī)otal RNA, poly(A)+ RNA，Western blot等實(shí)驗(yàn)操作的標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參。beta-actinp-Actin (ACTB)是PCR常用的內(nèi)參，0-Actin抗

7、體是Western Blot很好的內(nèi)參 指數(shù)。p-Actin是橫紋肌肌纖維中的一種主要蛋白質(zhì)成分，也是肌肉細(xì)絲及細(xì)胞 骨架微絲的主要成分，具有收縮功能，分布廣泛。另外，不同的組織來(lái)源的樣本在選擇內(nèi)參時(shí)還有一定的區(qū)別。比如一些少量特殊 的情況下，如脂肪組織或細(xì)胞內(nèi)，0-Actin的表達(dá)量就很少，不適合做內(nèi)參。tubulintubulin (微管蛋白)是球形分子，有兩種類(lèi)型:a微管蛋白(a-tubulin)和0微管 蛋白(0-tubulin),這兩種微管蛋白具有相似的三維結(jié)構(gòu)，能夠緊密地結(jié)合成二聚 體，作為微管組裝的亞基。a亞基由450個(gè)氨基酸組成，0亞基是由455個(gè)氨基 酸組成，它們的分子量約5

8、5 kDa。由于0-Tubulin的檢測(cè)分子量大約在55kD，因此該內(nèi)參抗體不是很適合用于檢 測(cè)50kD-60kD大小目標(biāo)蛋白的WB實(shí)驗(yàn)中。b、檢測(cè)蛋白時(shí)的內(nèi)參檢測(cè)蛋白時(shí)，常用蛋白內(nèi)參有GAPDH、0-Actin、0-tubulin。選擇的內(nèi)參要跟目 標(biāo)蛋白分子量差5KD以上，所以需要根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量來(lái)進(jìn)行內(nèi)參的選擇。檢測(cè)核蛋白時(shí)的內(nèi)參當(dāng)實(shí)驗(yàn)樣品中只是核蛋白，而不是細(xì)胞總蛋白提取液時(shí)，可以用組蛋白H(Histone H)，或者核纖層蛋白(nuclear lamina protein)等為核內(nèi)參抗體。組蛋 白的基因非常保守,在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種屬中，四種組蛋白(H2A、H2B、H3、H4) 氨

9、基酸序列都非常相似,H1序列變化則很大。除了這些，其它常見(jiàn)的核蛋白內(nèi)參 還有 K70, K80, Lamin A和 B，在一些文獻(xiàn)報(bào)道中,Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。但是需要注意的問(wèn)題是核蛋白內(nèi)參的 選擇需要考慮實(shí)際的試驗(yàn)環(huán)境，比如在涉及細(xì)胞增殖相關(guān)試驗(yàn)中，c-Jun由于自 身表達(dá)變化就不適合做內(nèi)參；而在凋亡實(shí)驗(yàn)時(shí)，TBP、Lamin等也不適合作為內(nèi) 參。反之，組蛋白Hist one H2A.X及Histo ne H3.1等由于是染色體的組成型表 達(dá)組分，表達(dá)比較穩(wěn)定，經(jīng)常被作為最廣泛的核內(nèi)參使用。另 NUCLEIC ACI

10、DS RES.上是用 a-Tubulin , RESEARCH DIAGNOSTICS INC專(zhuān)門(mén)提到a-Tubuli n。(胞漿表達(dá)，存疑)c、檢測(cè)miRNA時(shí)的內(nèi)參small nuclear RNA (snRNA)和 small nucleolar RNA (snoRNA)長(zhǎng)度與 miRNA相 近，200bp左右，在多種組織細(xì)胞中高表達(dá)，不涉及miRNA的調(diào)節(jié)途徑，且與 miRNA探針設(shè)計(jì)方法相同，所以snoRNA是很好的內(nèi)參選擇。Endogenous control genes recommendedsnoRNA assays: 18, ta and 5 for human, mouse

11、 and rat, resp. Human: U6. RNU48, RNU44, U47n and RNU6BMouse: snaRrJA-202. snoRNA-234, snoF?NA420-Least variable miRNA genesHuman/mouse tissues. miR-152, -186. -25. -92, -26b, -16Human/mouse cell lines miR-374T *16, -93. -156, -26b, -92-18S rRNA or U6常用內(nèi)參簡(jiǎn)單介紹一下常用的內(nèi)參U6： U6是一類(lèi)snRNA，它是由RNA聚合酶山轉(zhuǎn)錄。主要形成小核

12、核糖核蛋白顆粒，定位與細(xì)胞核內(nèi)，表達(dá)穩(wěn)定。d、檢測(cè)IncRNA時(shí)的內(nèi)參檢測(cè)IncRNA時(shí)，內(nèi)參選擇和mRNA 樣，可以選擇GAPDH、beta-actin等。GAPDH雖然在很多細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中都很穩(wěn)定，但是因?yàn)樗莻€(gè)糖代謝相關(guān)酶,在很多 糖代謝變化的實(shí)驗(yàn)中都會(huì)劇烈變化，比如缺氧、缺血、糖尿病以及某些腫瘤細(xì)胞 中。因此內(nèi)參不是絕對(duì)的。同樣，beta-actin也不是絕對(duì)的，如果涉及到細(xì)胞骨 架重排，解聚，重組的實(shí)驗(yàn)，beta-actin 一樣不可靠。如果不確定，可以多選幾 個(gè)內(nèi)參候選，找一個(gè)變化量小的。最后，18S rRNA也可以作為IncRNA檢測(cè)時(shí) 的內(nèi)參。當(dāng)然，還有其他的內(nèi)參可以作為IncRNA檢測(cè)的內(nèi)參，如：RPL13Ae、檢測(cè)circRNA時(shí)的內(nèi)參檢測(cè)circRNA時(shí)可以用18S rRNA作為內(nèi)參。18S rRNA是一類(lèi)核糖體RNA，所常用來(lái)進(jìn)行生物分類(lèi)的依據(jù)。由于18SrRNA 在生物中的表達(dá)比較保守，所以目前也用來(lái)作為內(nèi)參。用18s RNA作為RT-PCR的內(nèi)參，應(yīng)該和0-actin是一個(gè)道理，半定量的目的 是要看總RNA中的目的基因mRNA的表達(dá)量，內(nèi)參的目的是去除一些