廣西地方標準《豬鏈球菌2型抗體的檢測 酶聯(lián)免疫吸附法》編制說明

1、 廣西地方標準豬鏈球菌2型抗體的檢測 酶聯(lián)免疫吸附法（送審稿）編制說明1、項目來源本標準來源于廣西壯族自治區(qū)市場監(jiān)督管理局關(guān)于下達2021年第二批廣西地方標準制修定項目計劃的通知（桂市監(jiān)函20212199號）文件，由廣西動物疫病預(yù)防控制中心承擔。廣西動物疫病預(yù)防控制中心“豬鏈球菌2型抗體的檢測 酶聯(lián)免疫吸附法”編寫小組，按GB/T1.1 2020標準化工作導則 第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的要求組織編寫的。計劃于2022年完成。2、目的意義豬鏈球菌病是通過接觸病豬或病豬產(chǎn)品引發(fā)的一種人獸共患傳染病。病原豬鏈球菌血清型眾多，其中豬鏈球菌2型為最常見和毒力最強的血清型。人感染豬鏈球菌主要是

2、通過創(chuàng)口感染，導致腦膜炎、中毒性休克綜合征等疾病，甚至引起死亡，帶來嚴重的公共衛(wèi)生問題。近年來，與廣西毗連的越南和泰國等東盟國家均有報道人感染豬鏈球菌2型并死亡的病例。美國、英國、葡萄牙、澳大利亞、荷蘭等國也相繼出現(xiàn)了人感染豬鏈球菌的報道。在越南和我國香港地區(qū)，豬鏈球菌已成為引起成人腦膜腦炎的第一和第三大病原。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，全球因豬鏈球菌感染已引致400人以上死亡，其感染和發(fā)病有逐年增多的趨勢。因此，預(yù)防豬鏈球菌病不僅是全世界養(yǎng)豬業(yè)的迫切需求，也是全球公共衛(wèi)生急需解決的焦點問題。我國豬鏈球菌病疫情也十分嚴峻，病原主要以豬鏈球菌2型（SS2）和馬鏈球菌獸疫亞種（SEZ）為主。1998年夏季江蘇南

3、通地區(qū)及2005年7月四川資陽地區(qū)，由豬鏈球菌2型感染豬群出現(xiàn)暴發(fā)性死亡事例，并引起多名相關(guān)從業(yè)人員死亡，一度引發(fā)極大的社會恐慌。而近幾年來，廣西人感染豬鏈球菌發(fā)病數(shù)呈逐年上升趨勢，20182020年廣西分別有34、65、95人感染豬鏈球菌2型并發(fā)病。廣西是養(yǎng)豬大省，年平均氣溫高、環(huán)境濕度大，利于豬鏈球菌2型的擴散傳播，且廣西防城港、百色、崇左3個地級市中的8個縣（市）與越南交界，陸地邊境線長1020公里。邊境地區(qū)山林密布，野生動物眾多。越南等東南亞國家由于防控水平低，豬鏈球菌病等人獸共患病可能通過野生動物的跨境活動和動物及動物產(chǎn)品的非法貿(mào)易傳入廣西乃至國內(nèi)。因此，在廣西開展家畜及野生動物豬鏈

4、球菌檢測項目的研究，尤其是豬鏈球菌2型的研究及診斷方法的開發(fā)。不僅能掌握野生動物攜帶豬鏈球菌的情況，更能有效遏制東南亞疫情的傳入，對豬鏈球菌病等人獸共患病的防控具有十分重要的意義。動物機體在被動免疫或感染病原后會相應(yīng)產(chǎn)生特異性抗體，通過檢測抗體，監(jiān)視其變化情況可以評價預(yù)防接種效果、協(xié)助臨床診斷、觀察療效、判斷預(yù)后，有助于流行病學調(diào)查。及時、快速、準確的檢測動物的豬鏈球菌2型抗體，具有重要作用。然而，當前國內(nèi)外檢測豬鏈球菌2型尚無統(tǒng)一的標準，各類檢測方法良莠不齊，不能對豬群感染鏈球菌或免疫豬鏈球菌疫苗后產(chǎn)生的抗體進行有效監(jiān)測。亟需建立一種針對豬鏈球菌2型抗體的特異性強、敏感性好、高效率、低成本的

5、檢測方法，從而快速診斷機體感染狀況，及時制定相應(yīng)的防控策略，對保護易感豬群、高危人群具有非常重要的意義。3、國內(nèi)外標準對比情況通過檢索美國標準及英國標準未有查詢到具體的豬鏈球菌抗體檢測相關(guān)標準。當前，國內(nèi)外豬鏈球菌2型抗體檢測技術(shù)有瓊脂擴散試驗、間接血凝、免疫膠體金檢測方法。但是，上述方法在實際應(yīng)用中尚存在一定的不足或缺陷。如：瓊脂擴散試驗耗時太長、敏感性較低；間接血凝試驗受電解質(zhì)、溫度、酸堿度影響較大，結(jié)果不穩(wěn)定；免疫膠體金檢測結(jié)果不穩(wěn)定，容易出現(xiàn)假陽性和假陰性，而且沒有相關(guān)檢測標準，影響豬鏈球菌2型抗體的準確檢測。豬鏈球菌2型感染動物機體后會產(chǎn)生特異性抗體，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）通

6、過將抗原吸附在固相載體，在載體上進行免疫酶反應(yīng)，通過底物顯色，用分光光度計判定結(jié)果。利用抗原抗體特異性和酶催化反應(yīng)的高靈敏性，有效的建立了豬鏈球菌2型抗體檢測方法，操作簡便、準確性高、耗時少，適合快速檢測豬鏈球菌2型抗體，用于家畜及野生動物豬鏈球菌2型感染流行病學調(diào)查以及疫苗免疫效果評估。但該方法目前國內(nèi)外沒有相關(guān)的統(tǒng)一標準，本課題組制定標準建立相應(yīng)的檢測規(guī)程，作為研究工作的重點，并承諾本標準內(nèi)容與各項指標不低于國家強制性標準、推薦性國家標準和行業(yè)標準。4、編制過程 （1）接到任務(wù)后，廣西動物疫病預(yù)防控制中心結(jié)合近幾年的科研情況和人員情況，成立了以韋顯凱為組長， HYPERLINK /egra

7、ntweb/proposal/view-prp?posCodeStr=ut7c3XhcE6igRxeiB9Ok1Jzw8Q5y0YPsn1/gIsXGOmc=&grantCodeStr=MXokMZCwStpQT9YOeDDzxChNw3peHGJ8&subGrantCodeStr=TreCeGW6XI5b01EX94PJc33LO1QU9w6E&鄭敏、 HYPERLINK /egrantweb/proposal/view-prp?posCodeStr=ut7c3XhcE6igRxeiB9Ok1Jzw8Q5y0YPsn1/gIsXGOmc=&grantCodeStr=MXokMZCwStpQT

8、9YOeDDzxChNw3peHGJ8&subGrantCodeStr=TreCeGW6XI5b01EX94PJc33LO1QU9w6E&閉璟珊、 HYPERLINK /egrantweb/proposal/view-prp?posCodeStr=ut7c3XhcE6igRxeiB9Ok1Jzw8Q5y0YPsn1/gIsXGOmc=&grantCodeStr=MXokMZCwStpQT9YOeDDzxChNw3peHGJ8&subGrantCodeStr=TreCeGW6XI5b01EX94PJc33LO1QU9w6E&周慶安、張燦星、李軍等同志為成員的標準編制課題組，負責標準的起草工作。

9、（2）為了確保制定的標準具有科學性、先進性、實用性和可操作性，標準編制課題組根據(jù)工作方案和任務(wù)要求進行了分工，分成2個小組，其中一個小組負責做生產(chǎn)實踐的調(diào)查研究，深入到廣西南寧、來賓、柳州、河池、梧州、賀州、玉林、北海、百色、桂林、崇左等地一些規(guī)模化豬場、散養(yǎng)戶及屠宰場進行實地調(diào)查研究，了解我區(qū)生豬養(yǎng)殖鏈球菌病防控有關(guān)情況，并查閱相關(guān)的技術(shù)檔案和規(guī)章制定，收集流行病學資料；另一個小組負責查閱國內(nèi)外豬鏈球菌檢測方面的標準、技術(shù)資料和研究報告，并進行實驗比對。（3）起草完成標準征求意見稿最后課題組將兩個小組收集的材料進行匯總和整理，起草完成標準征求意見稿。（4）廣泛征求意見，形成網(wǎng)上征求意見稿20

10、22年4月將標準征求意見稿（1稿），分別送有關(guān)生產(chǎn)、技術(shù)推廣、科研、教學和標準化等方面專家征求意見。發(fā)出征詢專家意見表8份，收回8份，8位專家提出了修改意見65條，采納59條。根據(jù)專家意見修改完善標準征求意見稿，形成網(wǎng)上征求意見稿。5、關(guān)鍵技術(shù)指標依據(jù)和來源廣西動物疫病預(yù)防控制中心長期致力于廣西地區(qū)動物疫病防控研究，承擔了大量的疫病防控研究工作，從人員配備以及儀器設(shè)備等均符合項目開展的需要。課題組長期承擔廣西壯族自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心業(yè)務(wù)項目豬鏈球菌病流行病學調(diào)查與防控，對廣西地區(qū)生豬鏈球菌病的流行情況有系統(tǒng)深入的調(diào)查，掌握了大量第一手的流行病學實踐數(shù)據(jù)。為夯實制定標準的科學依據(jù)，項目組對

11、廣西豬鏈球菌病進行了系統(tǒng)流行病學調(diào)查及數(shù)據(jù)總結(jié), 重點了解廣西生豬豬鏈球菌病的感染率、感染強度、血清型以及耐藥性。20132018年，廣西動物疫病預(yù)防控制中心承擔了國家公益性項目“豬鏈球菌病防控技術(shù)研究與示范”的子課題，20152017年，承擔了原廣西水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局科技推廣項目“中越邊境豬鏈球菌病防控研究與示范”。與南京農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點實驗室以及OIE豬鏈球菌病診斷實驗室密切合作，對中越邊境的豬鏈球菌病進行監(jiān)測和防控。發(fā)現(xiàn)菌株GX10對昆明小鼠和BALB/c小鼠致死率均為100%，菌株GX11對BALB/c小鼠致死率80%，菌株GX10、GX11對BALB/c小鼠的LD50

12、分別為4.5105 CFU、3.6109 CFU。表明廣西BALB/c小鼠對豬鏈球菌的敏感性高于昆明小鼠，更適合作為豬鏈球菌致病性研究動物模型，詳見表1和表2。表1 部分菌株對昆明小鼠和BALB/c小鼠致病性試驗Table 1 Pathogenicity test of different strains to Kunming mice and BALB/c mice組別 Group血清型 Serum type攻毒數(shù)（只）Offensive number死亡數(shù)（只） Number of deaths昆明小鼠 Kunming miceBALB/c小鼠BALB/c miceGX75500GX915

13、00GX108555GX112504GX1229500其他型其他5500HA98012503生理鹽水組500表2 對BALB/c小鼠有致病性的菌株不同濃度的毒力試驗Table 2 Test of different concentration of pathogenic bacteria in BALB/c mice組別 Group攻毒數(shù)（只） Offensive number死亡數(shù)（只） Number of deathsGX10 GX11HA9801原液5534105423105200105000生理鹽水5000本研究建立的豬鏈球菌2型抗體ELISA方法可應(yīng)用于監(jiān)測豬群的豬鏈球菌2型感染狀況

14、，同時用于評估疫苗免疫后的效果。運用豬鏈球菌2型ELISA抗體檢測試劑盒連續(xù)5年對東興市、那坡縣、大新縣的屠宰場和免疫豬場進行豬鏈球菌2型抗體水平進行監(jiān)測，其中屠宰場每個示范每年監(jiān)測300份血清，免疫豬場每個示范每年監(jiān)測100份以上血清。屠宰場豬鏈球菌2型抗體平均陽性率為27.00%，免疫豬場豬鏈球菌2型抗體平均陽性率為93.37%，屠宰場和免疫場血清豬鏈球菌2型抗體平均陽性率差異顯著（P0.01），詳見表3。表3. 2016-2020年屠宰場和免疫豬場豬鏈球菌2型抗體監(jiān)測結(jié)果Table 3. Detection results of Streptococcus suis type 2 ant

15、ibody in slaughterhouses and immunized pig farms, 2016-2020年份 Year屠宰場 HYPERLINK javascript:void(0); Slaughter HYPERLINK javascript:void(0); house 免疫場 Immune field樣品數(shù) HYPERLINK javascript:void(0); Sample HYPERLINK javascript:void(0); number陽性數(shù) Positive number陽性率（%） HYPERLINK javascript:void(0); Posit

16、ive HYPERLINK javascript:void(0); incidence（%）樣品數(shù) HYPERLINK javascript:void(0); Sample HYPERLINK javascript:void(0); number陽性數(shù) Positive number陽性率（%） HYPERLINK javascript:void(0); Positive HYPERLINK javascript:void(0); incidence（%）201690024927.67 38035292.63 201790024627.3336534193.42201890022625.113

17、5032693.14201990023826.4434031291.76202090025628.4436034595.83合計4500121527.00a1795167693.37b注：標注不同字母代表P0.01，差異極顯著。此外還通過向各地養(yǎng)殖場(戶)發(fā)放調(diào)查表格, 調(diào)查生豬發(fā)病情況, 同時到各縣市的動物疫病預(yù)防控制中心調(diào)查當?shù)厣i發(fā)病情況記載、疫情報告表和檢疫記載等，并采集樣品檢測豬鏈球菌2型和常見豬病的混合感染狀況。綜合流行病學調(diào)查以及實驗室檢測，發(fā)現(xiàn)在豬常見疾病中，鏈球菌2型病感染率僅次于PCV2、PRRSV，平均感染率達10.88%，其中在發(fā)病場和屠宰場的檢出率分別為11.84%和

18、10.11%。詳見表4。表4 6種疫病檢測結(jié)果Table 4 Result of 2 disease detection樣品來源sample source樣品數(shù)目Sample numberSS2陽性率(%)positve rateCSFV陽性率(%)positve ratePRRSV陽性率(%)positve ratePEDV陽性率(%)positve ratePCV2陽性率(%)positve ratePRV陽性率(%)positve rate發(fā)病場morbidity farms15211.84(18)1.97(3)16.45(25)034.21(52)3.95(6)屠宰場slaughter

19、 houses18810.11(19)0.53(1)11.17(21)043.09(81)0(0)合計34010.88(37)1.18(4)13.53(46)039.12(133)1.76(6)分析SS2和病毒混合感染情況，在發(fā)病場中，PCV2和其他病原的混合感染最為多見。其中，感染最高的是CSFV+PCV2，達到3.95%，其次為PRRSV+PCV2，陽性率為3.29%，PCV2+SS2的陽性率為1.31%。屠宰場二重感染較多的感染最高的是PRRSV+PCV2，達到2.66%，其次為PCV2+SS2，陽性率為1.06%。詳見表5表5 二重感染情況Table 5 Status of doubl

20、e infection檢測項目Dtection item發(fā)病場 morbidity farms屠宰場slaughter houses合計 total樣品數(shù)Sample number陽性數(shù)positive number陽性率(%)positve rate樣品數(shù)Sample number陽性數(shù)positive number陽性率(%)positve rate陽性數(shù)positive number陽性率(%)positve ratePCV2+SS215221.3118821.0641.17PRRSV+CSFV10.6610.5320.59PRRSV+PCV253.2952.66102.94CSFV+P

21、CV263.950061.76本研究選取了平果縣的的鳳梧鄉(xiāng)百豐村興隆土豬養(yǎng)殖場、坡造鎮(zhèn)綠德村布覺屯潘福春豬場以及四塘鎮(zhèn)紅福養(yǎng)豬場作為免疫示范豬場進行免疫，跟蹤研究免疫抗體水平產(chǎn)生規(guī)律。使用豬鏈球菌2型ELISA抗體檢測試劑盒對3個豬場，不同時間階段的180份豬血清進行豬鏈球菌2型抗體的檢測。檢測結(jié)果如表6。實驗結(jié)果表明，仔豬注射豬鏈球菌2型疫苗后能夠產(chǎn)生豬鏈球菌2型抗體，且免疫30 d后，抗體水平最高，免疫60 d后抗體水平逐漸降低。如果仔豬不進行豬鏈球菌疫苗免疫，仍然能夠產(chǎn)生豬鏈球菌2型抗體，但抗體水平較低。表6 豬血清樣品的豬鏈球菌2型抗體的ELISA檢測結(jié)果Table 6 The results of ELISA detection of streptococci 2 antibodies in pig serum samples組別 Group一免前 Before the first immunization二免前 Before the second immunization二免后30天 30 days after the second exemption二免后60天 60 days after the second exemption抗體陽性數(shù) Antibody positive number抗體陽性率（%）Antibody pos