廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《豬鏈球菌2型抗體的檢測(cè) 酶聯(lián)免疫吸附法》編制說(shuō)明

1、 廣西地方標(biāo)準(zhǔn)豬鏈球菌2型抗體的檢測(cè) 酶聯(lián)免疫吸附法（送審稿）編制說(shuō)明1、項(xiàng)目來(lái)源本標(biāo)準(zhǔn)來(lái)源于廣西壯族自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局關(guān)于下達(dá)2021年第二批廣西地方標(biāo)準(zhǔn)制修定項(xiàng)目計(jì)劃的通知（桂市監(jiān)函20212199號(hào)）文件，由廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心承擔(dān)。廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心“豬鏈球菌2型抗體的檢測(cè) 酶聯(lián)免疫吸附法”編寫(xiě)小組，按GB/T1.1 2020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的要求組織編寫(xiě)的。計(jì)劃于2022年完成。2、目的意義豬鏈球菌病是通過(guò)接觸病豬或病豬產(chǎn)品引發(fā)的一種人獸共患傳染病。病原豬鏈球菌血清型眾多，其中豬鏈球菌2型為最常見(jiàn)和毒力最強(qiáng)的血清型。人感染豬鏈球菌主要是

2、通過(guò)創(chuàng)口感染，導(dǎo)致腦膜炎、中毒性休克綜合征等疾病，甚至引起死亡，帶來(lái)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。近年來(lái)，與廣西毗連的越南和泰國(guó)等東盟國(guó)家均有報(bào)道人感染豬鏈球菌2型并死亡的病例。美國(guó)、英國(guó)、葡萄牙、澳大利亞、荷蘭等國(guó)也相繼出現(xiàn)了人感染豬鏈球菌的報(bào)道。在越南和我國(guó)香港地區(qū)，豬鏈球菌已成為引起成人腦膜腦炎的第一和第三大病原。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，全球因豬鏈球菌感染已引致400人以上死亡，其感染和發(fā)病有逐年增多的趨勢(shì)。因此，預(yù)防豬鏈球菌病不僅是全世界養(yǎng)豬業(yè)的迫切需求，也是全球公共衛(wèi)生急需解決的焦點(diǎn)問(wèn)題。我國(guó)豬鏈球菌病疫情也十分嚴(yán)峻，病原主要以豬鏈球菌2型（SS2）和馬鏈球菌獸疫亞種（SEZ）為主。1998年夏季江蘇南

3、通地區(qū)及2005年7月四川資陽(yáng)地區(qū)，由豬鏈球菌2型感染豬群出現(xiàn)暴發(fā)性死亡事例，并引起多名相關(guān)從業(yè)人員死亡，一度引發(fā)極大的社會(huì)恐慌。而近幾年來(lái)，廣西人感染豬鏈球菌發(fā)病數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)，20182020年廣西分別有34、65、95人感染豬鏈球菌2型并發(fā)病。廣西是養(yǎng)豬大省，年平均氣溫高、環(huán)境濕度大，利于豬鏈球菌2型的擴(kuò)散傳播，且廣西防城港、百色、崇左3個(gè)地級(jí)市中的8個(gè)縣（市）與越南交界，陸地邊境線長(zhǎng)1020公里。邊境地區(qū)山林密布，野生動(dòng)物眾多。越南等東南亞國(guó)家由于防控水平低，豬鏈球菌病等人獸共患病可能通過(guò)野生動(dòng)物的跨境活動(dòng)和動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品的非法貿(mào)易傳入廣西乃至國(guó)內(nèi)。因此，在廣西開(kāi)展家畜及野生動(dòng)物豬鏈

4、球菌檢測(cè)項(xiàng)目的研究，尤其是豬鏈球菌2型的研究及診斷方法的開(kāi)發(fā)。不僅能掌握野生動(dòng)物攜帶豬鏈球菌的情況，更能有效遏制東南亞疫情的傳入，對(duì)豬鏈球菌病等人獸共患病的防控具有十分重要的意義。動(dòng)物機(jī)體在被動(dòng)免疫或感染病原后會(huì)相應(yīng)產(chǎn)生特異性抗體，通過(guò)檢測(cè)抗體，監(jiān)視其變化情況可以評(píng)價(jià)預(yù)防接種效果、協(xié)助臨床診斷、觀察療效、判斷預(yù)后，有助于流行病學(xué)調(diào)查。及時(shí)、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)動(dòng)物的豬鏈球菌2型抗體，具有重要作用。然而，當(dāng)前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)豬鏈球菌2型尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，各類檢測(cè)方法良莠不齊，不能對(duì)豬群感染鏈球菌或免疫豬鏈球菌疫苗后產(chǎn)生的抗體進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)。亟需建立一種針對(duì)豬鏈球菌2型抗體的特異性強(qiáng)、敏感性好、高效率、低成本的

5、檢測(cè)方法，從而快速診斷機(jī)體感染狀況，及時(shí)制定相應(yīng)的防控策略，對(duì)保護(hù)易感豬群、高危人群具有非常重要的意義。3、國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比情況通過(guò)檢索美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)及英國(guó)標(biāo)準(zhǔn)未有查詢到具體的豬鏈球菌抗體檢測(cè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外豬鏈球菌2型抗體檢測(cè)技術(shù)有瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、間接血凝、免疫膠體金檢測(cè)方法。但是，上述方法在實(shí)際應(yīng)用中尚存在一定的不足或缺陷。如：瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)耗時(shí)太長(zhǎng)、敏感性較低；間接血凝試驗(yàn)受電解質(zhì)、溫度、酸堿度影響較大，結(jié)果不穩(wěn)定；免疫膠體金檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性，而且沒(méi)有相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，影響豬鏈球菌2型抗體的準(zhǔn)確檢測(cè)。豬鏈球菌2型感染動(dòng)物機(jī)體后會(huì)產(chǎn)生特異性抗體，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）通

6、過(guò)將抗原吸附在固相載體，在載體上進(jìn)行免疫酶反應(yīng)，通過(guò)底物顯色，用分光光度計(jì)判定結(jié)果。利用抗原抗體特異性和酶催化反應(yīng)的高靈敏性，有效的建立了豬鏈球菌2型抗體檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性高、耗時(shí)少，適合快速檢測(cè)豬鏈球菌2型抗體，用于家畜及野生動(dòng)物豬鏈球菌2型感染流行病學(xué)調(diào)查以及疫苗免疫效果評(píng)估。但該方法目前國(guó)內(nèi)外沒(méi)有相關(guān)的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，本課題組制定標(biāo)準(zhǔn)建立相應(yīng)的檢測(cè)規(guī)程，作為研究工作的重點(diǎn)，并承諾本標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容與各項(xiàng)指標(biāo)不低于國(guó)家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)、推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。4、編制過(guò)程 （1）接到任務(wù)后，廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心結(jié)合近幾年的科研情況和人員情況，成立了以韋顯凱為組長(zhǎng)， HYPERLINK /egra

7、ntweb/proposal/view-prp?posCodeStr=ut7c3XhcE6igRxeiB9Ok1Jzw8Q5y0YPsn1/gIsXGOmc=&grantCodeStr=MXokMZCwStpQT9YOeDDzxChNw3peHGJ8&subGrantCodeStr=TreCeGW6XI5b01EX94PJc33LO1QU9w6E&鄭敏、 HYPERLINK /egrantweb/proposal/view-prp?posCodeStr=ut7c3XhcE6igRxeiB9Ok1Jzw8Q5y0YPsn1/gIsXGOmc=&grantCodeStr=MXokMZCwStpQT

8、9YOeDDzxChNw3peHGJ8&subGrantCodeStr=TreCeGW6XI5b01EX94PJc33LO1QU9w6E&閉璟珊、 HYPERLINK /egrantweb/proposal/view-prp?posCodeStr=ut7c3XhcE6igRxeiB9Ok1Jzw8Q5y0YPsn1/gIsXGOmc=&grantCodeStr=MXokMZCwStpQT9YOeDDzxChNw3peHGJ8&subGrantCodeStr=TreCeGW6XI5b01EX94PJc33LO1QU9w6E&周慶安、張燦星、李軍等同志為成員的標(biāo)準(zhǔn)編制課題組，負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的起草工作。

9、（2）為了確保制定的標(biāo)準(zhǔn)具有科學(xué)性、先進(jìn)性、實(shí)用性和可操作性，標(biāo)準(zhǔn)編制課題組根據(jù)工作方案和任務(wù)要求進(jìn)行了分工，分成2個(gè)小組，其中一個(gè)小組負(fù)責(zé)做生產(chǎn)實(shí)踐的調(diào)查研究，深入到廣西南寧、來(lái)賓、柳州、河池、梧州、賀州、玉林、北海、百色、桂林、崇左等地一些規(guī)模化豬場(chǎng)、散養(yǎng)戶及屠宰場(chǎng)進(jìn)行實(shí)地調(diào)查研究，了解我區(qū)生豬養(yǎng)殖鏈球菌病防控有關(guān)情況，并查閱相關(guān)的技術(shù)檔案和規(guī)章制定，收集流行病學(xué)資料；另一個(gè)小組負(fù)責(zé)查閱國(guó)內(nèi)外豬鏈球菌檢測(cè)方面的標(biāo)準(zhǔn)、技術(shù)資料和研究報(bào)告，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比對(duì)。（3）起草完成標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿最后課題組將兩個(gè)小組收集的材料進(jìn)行匯總和整理，起草完成標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿。（4）廣泛征求意見(jiàn)，形成網(wǎng)上征求意見(jiàn)稿20

10、22年4月將標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿（1稿），分別送有關(guān)生產(chǎn)、技術(shù)推廣、科研、教學(xué)和標(biāo)準(zhǔn)化等方面專家征求意見(jiàn)。發(fā)出征詢專家意見(jiàn)表8份，收回8份，8位專家提出了修改意見(jiàn)65條，采納59條。根據(jù)專家意見(jiàn)修改完善標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿，形成網(wǎng)上征求意見(jiàn)稿。5、關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)依據(jù)和來(lái)源廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心長(zhǎng)期致力于廣西地區(qū)動(dòng)物疫病防控研究，承擔(dān)了大量的疫病防控研究工作，從人員配備以及儀器設(shè)備等均符合項(xiàng)目開(kāi)展的需要。課題組長(zhǎng)期承擔(dān)廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心業(yè)務(wù)項(xiàng)目豬鏈球菌病流行病學(xué)調(diào)查與防控，對(duì)廣西地區(qū)生豬鏈球菌病的流行情況有系統(tǒng)深入的調(diào)查，掌握了大量第一手的流行病學(xué)實(shí)踐數(shù)據(jù)。為夯實(shí)制定標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)依據(jù)，項(xiàng)目組對(duì)

11、廣西豬鏈球菌病進(jìn)行了系統(tǒng)流行病學(xué)調(diào)查及數(shù)據(jù)總結(jié), 重點(diǎn)了解廣西生豬豬鏈球菌病的感染率、感染強(qiáng)度、血清型以及耐藥性。20132018年，廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心承擔(dān)了國(guó)家公益性項(xiàng)目“豬鏈球菌病防控技術(shù)研究與示范”的子課題，20152017年，承擔(dān)了原廣西水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局科技推廣項(xiàng)目“中越邊境豬鏈球菌病防控研究與示范”。與南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室以及OIE豬鏈球菌病診斷實(shí)驗(yàn)室密切合作，對(duì)中越邊境的豬鏈球菌病進(jìn)行監(jiān)測(cè)和防控。發(fā)現(xiàn)菌株GX10對(duì)昆明小鼠和BALB/c小鼠致死率均為100%，菌株GX11對(duì)BALB/c小鼠致死率80%，菌株GX10、GX11對(duì)BALB/c小鼠的LD50

12、分別為4.5105 CFU、3.6109 CFU。表明廣西BALB/c小鼠對(duì)豬鏈球菌的敏感性高于昆明小鼠，更適合作為豬鏈球菌致病性研究動(dòng)物模型，詳見(jiàn)表1和表2。表1 部分菌株對(duì)昆明小鼠和BALB/c小鼠致病性試驗(yàn)Table 1 Pathogenicity test of different strains to Kunming mice and BALB/c mice組別 Group血清型 Serum type攻毒數(shù)（只）Offensive number死亡數(shù)（只） Number of deaths昆明小鼠 Kunming miceBALB/c小鼠BALB/c miceGX75500GX915

13、00GX108555GX112504GX1229500其他型其他5500HA98012503生理鹽水組500表2 對(duì)BALB/c小鼠有致病性的菌株不同濃度的毒力試驗(yàn)Table 2 Test of different concentration of pathogenic bacteria in BALB/c mice組別 Group攻毒數(shù)（只） Offensive number死亡數(shù)（只） Number of deathsGX10 GX11HA9801原液5534105423105200105000生理鹽水5000本研究建立的豬鏈球菌2型抗體ELISA方法可應(yīng)用于監(jiān)測(cè)豬群的豬鏈球菌2型感染狀況

14、，同時(shí)用于評(píng)估疫苗免疫后的效果。運(yùn)用豬鏈球菌2型ELISA抗體檢測(cè)試劑盒連續(xù)5年對(duì)東興市、那坡縣、大新縣的屠宰場(chǎng)和免疫豬場(chǎng)進(jìn)行豬鏈球菌2型抗體水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)，其中屠宰場(chǎng)每個(gè)示范每年監(jiān)測(cè)300份血清，免疫豬場(chǎng)每個(gè)示范每年監(jiān)測(cè)100份以上血清。屠宰場(chǎng)豬鏈球菌2型抗體平均陽(yáng)性率為27.00%，免疫豬場(chǎng)豬鏈球菌2型抗體平均陽(yáng)性率為93.37%，屠宰場(chǎng)和免疫場(chǎng)血清豬鏈球菌2型抗體平均陽(yáng)性率差異顯著（P0.01），詳見(jiàn)表3。表3. 2016-2020年屠宰場(chǎng)和免疫豬場(chǎng)豬鏈球菌2型抗體監(jiān)測(cè)結(jié)果Table 3. Detection results of Streptococcus suis type 2 ant

15、ibody in slaughterhouses and immunized pig farms, 2016-2020年份 Year屠宰場(chǎng) HYPERLINK javascript:void(0); Slaughter HYPERLINK javascript:void(0); house 免疫場(chǎng) Immune field樣品數(shù) HYPERLINK javascript:void(0); Sample HYPERLINK javascript:void(0); number陽(yáng)性數(shù) Positive number陽(yáng)性率（%） HYPERLINK javascript:void(0); Posit

16、ive HYPERLINK javascript:void(0); incidence（%）樣品數(shù) HYPERLINK javascript:void(0); Sample HYPERLINK javascript:void(0); number陽(yáng)性數(shù) Positive number陽(yáng)性率（%） HYPERLINK javascript:void(0); Positive HYPERLINK javascript:void(0); incidence（%）201690024927.67 38035292.63 201790024627.3336534193.42201890022625.113

17、5032693.14201990023826.4434031291.76202090025628.4436034595.83合計(jì)4500121527.00a1795167693.37b注：標(biāo)注不同字母代表P0.01，差異極顯著。此外還通過(guò)向各地養(yǎng)殖場(chǎng)(戶)發(fā)放調(diào)查表格, 調(diào)查生豬發(fā)病情況, 同時(shí)到各縣市的動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心調(diào)查當(dāng)?shù)厣i發(fā)病情況記載、疫情報(bào)告表和檢疫記載等，并采集樣品檢測(cè)豬鏈球菌2型和常見(jiàn)豬病的混合感染狀況。綜合流行病學(xué)調(diào)查以及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在豬常見(jiàn)疾病中，鏈球菌2型病感染率僅次于PCV2、PRRSV，平均感染率達(dá)10.88%，其中在發(fā)病場(chǎng)和屠宰場(chǎng)的檢出率分別為11.84%和

18、10.11%。詳見(jiàn)表4。表4 6種疫病檢測(cè)結(jié)果Table 4 Result of 2 disease detection樣品來(lái)源sample source樣品數(shù)目Sample numberSS2陽(yáng)性率(%)positve rateCSFV陽(yáng)性率(%)positve ratePRRSV陽(yáng)性率(%)positve ratePEDV陽(yáng)性率(%)positve ratePCV2陽(yáng)性率(%)positve ratePRV陽(yáng)性率(%)positve rate發(fā)病場(chǎng)morbidity farms15211.84(18)1.97(3)16.45(25)034.21(52)3.95(6)屠宰場(chǎng)slaughter

19、 houses18810.11(19)0.53(1)11.17(21)043.09(81)0(0)合計(jì)34010.88(37)1.18(4)13.53(46)039.12(133)1.76(6)分析SS2和病毒混合感染情況，在發(fā)病場(chǎng)中，PCV2和其他病原的混合感染最為多見(jiàn)。其中，感染最高的是CSFV+PCV2，達(dá)到3.95%，其次為PRRSV+PCV2，陽(yáng)性率為3.29%，PCV2+SS2的陽(yáng)性率為1.31%。屠宰場(chǎng)二重感染較多的感染最高的是PRRSV+PCV2，達(dá)到2.66%，其次為PCV2+SS2，陽(yáng)性率為1.06%。詳見(jiàn)表5表5 二重感染情況Table 5 Status of doubl

20、e infection檢測(cè)項(xiàng)目Dtection item發(fā)病場(chǎng) morbidity farms屠宰場(chǎng)slaughter houses合計(jì) total樣品數(shù)Sample number陽(yáng)性數(shù)positive number陽(yáng)性率(%)positve rate樣品數(shù)Sample number陽(yáng)性數(shù)positive number陽(yáng)性率(%)positve rate陽(yáng)性數(shù)positive number陽(yáng)性率(%)positve ratePCV2+SS215221.3118821.0641.17PRRSV+CSFV10.6610.5320.59PRRSV+PCV253.2952.66102.94CSFV+P

21、CV263.950061.76本研究選取了平果縣的的鳳梧鄉(xiāng)百豐村興隆土豬養(yǎng)殖場(chǎng)、坡造鎮(zhèn)綠德村布覺(jué)屯潘福春豬場(chǎng)以及四塘鎮(zhèn)紅福養(yǎng)豬場(chǎng)作為免疫示范豬場(chǎng)進(jìn)行免疫，跟蹤研究免疫抗體水平產(chǎn)生規(guī)律。使用豬鏈球菌2型ELISA抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)3個(gè)豬場(chǎng)，不同時(shí)間階段的180份豬血清進(jìn)行豬鏈球菌2型抗體的檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如表6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，仔豬注射豬鏈球菌2型疫苗后能夠產(chǎn)生豬鏈球菌2型抗體，且免疫30 d后，抗體水平最高，免疫60 d后抗體水平逐漸降低。如果仔豬不進(jìn)行豬鏈球菌疫苗免疫，仍然能夠產(chǎn)生豬鏈球菌2型抗體，但抗體水平較低。表6 豬血清樣品的豬鏈球菌2型抗體的ELISA檢測(cè)結(jié)果Table 6 The results of ELISA detection of streptococci 2 antibodies in pig serum samples組別 Group一免前 Before the first immunization二免前 Before the second immunization二免后30天 30 days after the second exemption二免后60天 60 days after the second exemption抗體陽(yáng)性數(shù) Antibody positive number抗體陽(yáng)性率（%）Antibody pos