免疫學(xué)診斷課件

1、生物技術(shù)學(xué)院抗體工程研究所2009年6月11日免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)1免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)1分子診斷學(xué)分子診斷學(xué)是以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，利用基因和蛋白質(zhì)分析技術(shù)和方法來(lái)研究人體內(nèi)源性或外源性生物大分子體系的存在、結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控的變化，為疾病的監(jiān)測(cè)、診斷、療效判斷和預(yù)后評(píng)估、個(gè)體化治療等提供信息和決策依據(jù)的一門(mén)科學(xué)。隨著分子診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，分子診斷已從傳統(tǒng)的DNA診斷概念發(fā)展到更全面的核酸和蛋白質(zhì)診斷的新概念；分子診斷的內(nèi)容也從早期的單一遺傳性疾病的診斷發(fā)展成為覆蓋臨床醫(yī)學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)等眾多領(lǐng)域的重要技術(shù)。2分子診斷學(xué)分子診斷學(xué)是以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，利用基因和蛋白生化產(chǎn)品30免疫產(chǎn)品25%基因產(chǎn)品58

2、血液分析產(chǎn)品810尿液分析產(chǎn)品35%微生物產(chǎn)品23診斷試劑僅占生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的25%2005年國(guó)內(nèi)臨床診斷市場(chǎng)3生化產(chǎn)品30診斷試劑僅占生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的25%2005年國(guó)內(nèi)免疫學(xué)檢驗(yàn)項(xiàng)目分布情況Infectious diseasesTumor markersSource: UBS Warburg LLC estimates免疫學(xué)技術(shù)在臨床診斷領(lǐng)域中的作用將越來(lái)越重要4免疫學(xué)檢驗(yàn)項(xiàng)目分布情況Infectious diseases主要內(nèi)容（1）酶免疫分析（2）放射免疫分析（3）免疫熒光分析（4）時(shí)間分辨熒光免疫分析（5）化學(xué)發(fā)光免疫分析（6）金標(biāo)和磁性免疫層析分析（7）蛋白印跡（8）AlphaScre

3、en分析技術(shù) 5主要內(nèi)容（1）酶免疫分析51、特異性2、可見(jiàn)性3、可逆性抗原抗體反應(yīng)的特性AgAb-+61、特異性抗原抗體反應(yīng)的特性AgAb-+6(1)抗原抗體的性質(zhì)(2)溫度(3)酸堿度（PH）(4)電解質(zhì)（離子強(qiáng)度）影響抗原抗體反應(yīng)的因素7(1)抗原抗體的性質(zhì)影響抗原抗體反應(yīng)的因素71、天然抗原2、重組抗原3、合成肽1、多克隆抗體2、單克隆抗體3、基因工程抗體抗原抗體抗原和抗體的類別Georges J.F. Khler, Csar Milstein, 1984 McAb 81、天然抗原1、多克隆抗體抗原抗體抗原和抗體的類別Georg標(biāo)記免疫學(xué)分析技術(shù)發(fā)展歷程免疫熒光分析(Coons, 19

4、41)放射免疫分析(Berson和Yalow, 1960)酶聯(lián)免疫吸附分析 (Engvall, 1971)金標(biāo)免疫分析(Faulk和Taylor, 1971)化學(xué)發(fā)光免疫分析(Arakawa， 1977)時(shí)間分辨熒光免疫分析(Soini和Hemmila，1979)電化學(xué)發(fā)光免疫分析(Leland, 1990)9標(biāo)記免疫學(xué)分析技術(shù)發(fā)展歷程9免疫熒光放射免疫化學(xué)發(fā)光電化學(xué)發(fā)光 時(shí)間分辨熒光酶聯(lián)免疫標(biāo)記免疫學(xué)分析技術(shù)發(fā)展歷程10免疫熒光放射免疫化學(xué)發(fā)光電化學(xué)發(fā)光 時(shí)間分辨熒光一、酶免疫分析技術(shù)酶免疫技術(shù)固相(ELISA)酶免疫組織化學(xué)酶免疫測(cè)定均相異相液相11一、酶免疫分析技術(shù)酶免疫技術(shù)固相(ELI

5、SA)酶免疫組織化學(xué) 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay, ELISA ）基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記，反應(yīng)完成后加入酶反應(yīng)底物，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。(一)ELISA技術(shù)12 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme Linked Immun來(lái)源方便，易于純化；比活性高，性質(zhì)穩(wěn)定；與抗體或抗原交聯(lián)后仍保持酶的活性；待測(cè)物中不存在該酶及其底物、抑制劑和其它干擾因素；酶活性和量能用簡(jiǎn)單、快速、敏感的方法測(cè)定。 標(biāo)記用酶的要求辣根過(guò)氧化物酶，堿性磷酸酶13來(lái)源方便，易于純化；

6、標(biāo)記用酶的要求辣根過(guò)氧化物酶，堿性磷酸底物為鄰苯二胺(OPD), 橙紅色 ，檢測(cè)波長(zhǎng)492nm； 四甲基聯(lián)苯胺(TMB)， 藍(lán)綠色，檢測(cè)波長(zhǎng)450nm辣根過(guò)氧化物酶14底物為鄰苯二胺(OPD), 橙紅色 ，檢測(cè)波長(zhǎng)492nm； 堿性磷酸酶 底物為PNP（對(duì)硝基磷酸苯酯）, 檢測(cè)波長(zhǎng)405nm。15堿性磷酸酶 底物為PNP（對(duì)硝基磷酸苯酯）, 檢測(cè)波長(zhǎng)固相的抗原或抗體酶標(biāo)記的抗原或抗體酶作用的底物 ELISA的必要試劑 根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的性狀以及檢測(cè)的具備條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。16固相的抗原或抗體ELISA的必要試劑 根據(jù)試劑的來(lái)源雙抗體夾心法測(cè)抗原雙抗原夾心法測(cè)抗體間接法測(cè)

7、抗體競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原捕獲包被法測(cè)抗體BAS-ELISA法技術(shù)類型17雙抗體夾心法測(cè)抗原技術(shù)類型17(1)雙抗體夾心法測(cè)抗原 此法適用于檢驗(yàn)各種大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。酶標(biāo)抗體樣品底物酶標(biāo)儀測(cè)定OD值終止液18(1)雙抗體夾心法測(cè)抗原 此法適用于檢驗(yàn)各種大分子抗原，在一步法測(cè)定中，如標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時(shí)，過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成“夾心復(fù)合物”。所得結(jié)果將低于實(shí)際的含量，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)(hookeffect)。類風(fēng)濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動(dòng)物IgG的Fc段結(jié)合。表現(xiàn)出假陽(yáng)性反應(yīng)。(1)雙

8、抗體夾心法測(cè)抗原19在一步法測(cè)定中，如標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時(shí)，過(guò)量抗原分別和 反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。 抗-HBs、抗-HCV、抗-HIV的檢測(cè)常采用本法。(2)雙抗原夾心法測(cè)抗體20 反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備(3)間接法測(cè)抗體 一些傳染病的診斷(Torch)。包被抗原利用酶標(biāo)二抗建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。酶標(biāo)抗體樣品樣品稀釋液終止液底物21(3)間接法測(cè)抗體 一些傳染病的診斷(Torch)。2222(4)競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體 當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。如

9、抗-HBc等常用該方法。酶標(biāo)抗體樣品底物終止液23(4)競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體 當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，(5)競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原 其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素(T3、T4)、藥物等ELISA測(cè)定多用此法。24(5)競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原 其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)(6)捕獲包被法測(cè)抗體 IgM的檢測(cè)常用于傳染病的診斷。用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（其中包括針對(duì)抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早期診斷。酶標(biāo)抗體特異性抗原樣品終止液底物25(6)

10、捕獲包被法測(cè)抗體 IgM的檢測(cè)常用于傳染病的診斷。(7) BAS-ELISA法 ：固相支持物；：樣品；：特異性IgG；：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）；：辣根過(guò)氧化物酶HRP-酶標(biāo)鏈親和素（Avidin）；：DAB顯色液；：顯色；26(7) BAS-ELISA法 ：固相支持物；26酶標(biāo)記抗原或抗體的方法1. 戊二醛法一步法：將HRP和抗體與戊二醛同時(shí)反應(yīng)連接而成。一步法操作簡(jiǎn)單，但所得產(chǎn)物質(zhì)量不均一，抗體活性損失大，結(jié)合物的產(chǎn)率低。二步法：將HRP按一定比例與戊二醛反應(yīng)，形成HRP-戊二醛結(jié)合物，透析除去未結(jié)合的戊二醛后，再加入抗體。二步法制備的結(jié)合物產(chǎn)量雖無(wú)提高，但質(zhì)量均一，活性高。

11、 27酶標(biāo)記抗原或抗體的方法1. 戊二醛法27酶標(biāo)記抗原或抗體的方法2. 過(guò)碘酸鈉法 過(guò)碘酸鈉將酶分子上的糖羥基氧化成醛基，醛基與抗體（或抗原）中的游離氨基結(jié)合形成Schiffs堿，經(jīng)NaBH還原生成穩(wěn)定的酶結(jié)合物。 該法快速簡(jiǎn)便、安全，酶結(jié)合物的產(chǎn)率高、活性好，已成為目前最常用的酶標(biāo)記方法 。 28酶標(biāo)記抗原或抗體的方法2. 過(guò)碘酸鈉法 28酶標(biāo)記物的純化硫酸銨鹽析法Sephadex G-200凝膠過(guò)濾SPA親和層析29酶標(biāo)記物的純化硫酸銨鹽析法29最適工作濃度的選擇（間接法） 酶標(biāo)抗體工作濃度100ng/ml人 IgG系列稀釋酶標(biāo)抗體OD值約為1.0時(shí)的稀釋度包被抗原工作濃度系列抗原稀釋度

12、包被加入1:100稀釋強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性、陰性對(duì)照加酶標(biāo)抗人IgG抗體強(qiáng)陽(yáng)性O(shè)D值約為0.8，陰性O(shè)D值小于0.130最適工作濃度的選擇（間接法） 酶標(biāo)抗體工作濃度100ng/m間接ELISA法包被抗原工作濃度的選擇參考血清各抗原稀釋度的吸光度值1:501:1001:2001:4001:800強(qiáng)陽(yáng)性1.261.080.860.680.42弱陽(yáng)性0.680.410.300.220.18陰性0.250.130.050.040.03稀釋液0.090.020.020.020.0431間接ELISA法包被抗原工作濃度的選擇參考血清各抗原稀釋度的雙抗體夾心法工作濃度的選擇(棋盤(pán)法)包被抗體濃度酶標(biāo)抗體稀釋度各

13、抗原濃度的吸光度值25ng/ml1.5ng/ml陰性5g/ml1:20001:40001:80003g/ml1:20001:40001:80001g/ml1:20001:40001:800025ng/ml的抗原OD值約為0.8，陰性O(shè)D值小于0.132雙抗體夾心法工作濃度的選擇(棋盤(pán)法)包被抗體濃度酶標(biāo)抗體稀釋固相載體的選擇包被封閉加樣保溫洗滌顯色ELISA技術(shù)操作要點(diǎn)33固相載體的選擇ELISA技術(shù)操作要點(diǎn)33不同批號(hào)的試劑盒不要混用。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)盡量建立在干凈無(wú)塵的環(huán)境下進(jìn)行。試劑盒與待檢樣本使用前必須平衡至室溫。試劑盒試劑操作前的注意事項(xiàng)34不同批號(hào)的試劑盒不要混用。試劑盒試劑操作前的

14、注意事項(xiàng)34 酶標(biāo)板最常用的材料是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性。酶標(biāo)板良好的酶標(biāo)板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。35 酶標(biāo)板最常用的材料是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì) 以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗滌后每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后，分別測(cè)每孔溶液的吸光度?？刂品磻?yīng)條件，使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右。計(jì)算全部讀數(shù)的平均值。所有單個(gè)讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù)之差，應(yīng)小于10%。酶標(biāo)板的檢定36 以

15、一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被包被液：碳酸鹽緩沖溶液(pH=9.6), PBS (pH=7.4), Tris-HCl (pH=7.8) 包被濃度：100ng/ml-20ug/ml溫度和時(shí)間：在4-8過(guò)夜或37 2小時(shí)包 被37包被液：碳酸鹽緩沖溶液(pH=9.6), PBS (pH= 封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。0.05%-0.5%的牛血清白蛋白10%的小牛血清1%明膠5%脫脂奶粉封 閉38 封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān) 在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。吸頭應(yīng)懸空，避免因吸頭碰到

16、小孔邊緣或其中試劑而造成污染每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染；酶結(jié)合物工作液和底物可用多道加液器，使加液過(guò)程迅速完成。加 樣39 在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本37是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度；室溫較37可避免蒸發(fā)，為加速反應(yīng)，可輔以搖床振蕩；抗原抗體反應(yīng)在4過(guò)夜反應(yīng)更為徹底。孵 育4037是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適決定著實(shí)驗(yàn)的成敗 ELSIA靠洗滌來(lái)分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物。通過(guò)洗滌以清除殘留在板孔中沒(méi)能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。 常用洗滌液為pH7.4 PBS

17、-Tween-20 。手工洗板時(shí)要注意防止氣泡產(chǎn)生。洗板機(jī)在使用前應(yīng)進(jìn)行校正注液量和殘留量，注意管道是否通暢。洗滌時(shí)，確認(rèn)每孔中的洗滌液都注滿微孔，洗滌后，每個(gè)孔必須是干的，如果仍有水可倒扣在無(wú)塵吸水紙上拍干。洗 滌41決定著實(shí)驗(yàn)的成敗 洗 滌41 HRP-TMB顯色系統(tǒng)受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后即可完全消退至無(wú)色。各類酸性終止液(2mol/LH2SO4)則會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，此時(shí)可用特定的波長(zhǎng)（450nm）測(cè)讀吸光值。顯 色42 HRP-T

18、MB顯色系統(tǒng)受光照的影響不大，可ELISA試劑盒（1）已包被抗原或抗體的固相載體；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體(結(jié)合物)；（3）酶的底物；（4）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品(定性測(cè)定中)，參考標(biāo)準(zhǔn)品 (定量測(cè)定中)；（5）標(biāo)本稀釋液；（6）洗滌液；（7）終止液。43ELISA試劑盒（1）已包被抗原或抗體的固相載體；（2）酶實(shí)驗(yàn)儀器：ELISA操作的標(biāo)準(zhǔn)化 變頻振蕩器 全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀BIORAD550 酶標(biāo)儀BIORAD1575洗板儀44實(shí)驗(yàn)儀器：ELISA操作的標(biāo)準(zhǔn)化 (1)在醫(yī)學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用病原體及其抗體的檢測(cè)蛋白質(zhì)的檢測(cè)非肽類激素的檢測(cè)藥物的檢測(cè)毒品檢測(cè)ELISA技術(shù)的應(yīng)用45(1)在醫(yī)學(xué)檢測(cè)

19、中的應(yīng)用ELISA技術(shù)的應(yīng)用45(2)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用食品微生物的檢測(cè)食品毒素的檢測(cè)食品中殘留農(nóng)藥的檢測(cè)食品中殘留抗生素的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)ELISA技術(shù)的應(yīng)用46(2)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用ELISA技術(shù)的應(yīng)用46與放射免疫測(cè)定相比，標(biāo)記物比較穩(wěn)定，無(wú)放射性的危害。與免疫熒光技術(shù)相比，結(jié)果判定更加客觀。操作簡(jiǎn)單，易自動(dòng)化。酶標(biāo)儀普及、價(jià)格低廉。ELISA技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)47與放射免疫測(cè)定相比，標(biāo)記物比較穩(wěn)定，無(wú)放射性的危害。ELISO.D值僅在低濃度范圍與酶活性呈線性關(guān)系，Hook效應(yīng)嚴(yán)重。酶的活性容易失活，使ELISA的靈敏度不高。ELISA的大分子標(biāo)記容易影響被標(biāo)記物的空間結(jié)構(gòu)，使得ELISA

20、的靈敏度進(jìn)一步提高受到限制。 ELISA技術(shù)的缺點(diǎn)48O.D值僅在低濃度范圍與酶活性呈線性關(guān)系，Hook效應(yīng)嚴(yán)重。 免疫組化技術(shù)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，以酶標(biāo)記抗體（或抗原）用于免疫學(xué)檢測(cè)，通過(guò)相應(yīng)底物被酶解后的顯色反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞和組織標(biāo)本中的抗原抗體復(fù)合物進(jìn)行定位、定性分析和鑒定。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見(jiàn)性巧妙地結(jié)合起來(lái)，借助顯微鏡的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測(cè)各種抗原。(二)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)49 免疫組化技術(shù)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，以酶標(biāo)記抗體（或直接法間接法酶橋法 PAP法APAAP法 親和素生物素方法 主要類型50直接法主要類型50主要類型直接法間接法 酶橋法PAP法51主要

21、類型直接法間接法 酶橋法PAP法5180%甲醇+0.3%H2O2處理切片1530min，封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶的活性； 0.05% Tween-20/PBS 洗滌；0.11% BSA濕盒內(nèi)孵育1525min；加第一抗體（5080l），濕盒內(nèi)孵育12h；0.05% Tween-20/PBS 洗滌；加HRP酶標(biāo)記二抗,濕盒內(nèi)孵育4560min；PBS漂洗3次； 0.010.05% DAB顯色1015min（暗處）。 實(shí)驗(yàn)步驟5280%甲醇+0.3%H2O2處理切片1530min，封閉內(nèi)5353 放射免疫分析(Radioimmunoassay，RIA) 1959年由Berson和Yalow創(chuàng)建，是以放射

22、性核素為標(biāo)記物的標(biāo)記免疫分析法，RIA將放射性核素分析的高靈敏度與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合，用于測(cè)定標(biāo)本中抗原或抗體的量。二、放射免疫分析 Rosalyn Yalow, 197754 放射免疫分析(Radioimmunoassay，RI放射免疫分析(RIA)YY+Prior to TestLabeled AgYY+Test+PatientssampleLabeledAg+55放射免疫分析(RIA)YY+Prior to TestLa 1968年Miles和Hales應(yīng)用放射性核素標(biāo)記的抗胰島素抗體檢測(cè)牛血清中胰島素獲得成功。為了區(qū)別于經(jīng)典的放射免疫測(cè)定(RIA)，他們將其命名為免疫放射分析(

23、immunoradiometric assay，IRMA)。 免疫放射分析56 1968年Miles和Hales應(yīng)用放射性核素標(biāo)記的SolidPhaseYAgImmobilizedYAg in PatientssampleLabeledAb免疫放射分析(IRMA)57SolidYAgImmobilizedYAg inLabel高比活度適宜的半衰期對(duì)抗原和抗體損害小容易標(biāo)記放射性核素的選擇原則58高比活度放射性核素的選擇原則58放射性核素14C 和3H：半衰期長(zhǎng)(5730年和12.26年 )，需在真空條件下標(biāo)記，射線測(cè)定需要液體閃爍技術(shù)，一般實(shí)驗(yàn)室不易開(kāi)展，放射性廢物處理困難，應(yīng)用受限制。131

24、I和125I ： 125I化學(xué)性質(zhì)活潑，易標(biāo)記，含有酪氨酸的蛋白質(zhì)和多肽均可標(biāo)記 ；衰變過(guò)程不產(chǎn)生射線，可以晶體閃爍計(jì)數(shù)儀直接測(cè)量射線； 125I半衰期長(zhǎng)(60天)、比活度高(95%)較131I(半衰期8天，比活度僅20%)更為適用。59放射性核素14C 和3H：半衰期長(zhǎng)(5730年和12.26年125I標(biāo)記方法分類 直接標(biāo)記法：標(biāo)記含酪氨酸的化合物，可將125I直接結(jié)合于蛋白質(zhì)側(cè)鏈殘基的酪氨酸上，此法操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)時(shí)間短，標(biāo)記物的比活度高。間接標(biāo)記法：常用環(huán)核苷酸、前列腺素等小分子化合物的標(biāo)記。先將125I標(biāo)記在載體上，再與蛋白質(zhì)結(jié)合。此法操作較復(fù)雜，標(biāo)記蛋白質(zhì)的比活度也低于直接法。但標(biāo)記反

25、應(yīng)較為溫和，可以避免因蛋白質(zhì)直接加入125I引起的生物活性的喪失。60125I標(biāo)記方法分類 直接標(biāo)記法：標(biāo)記含酪氨酸的化合物，可將125I標(biāo)記物的純化 葡聚糖凝膠 ：Sephadex分子量700 1 500 5 000 150020000 型號(hào)G10 G15 G25 G50 分子量300070000 4000150000 5000800000 5000300000 型號(hào)G75 G100 G150G200 61125I標(biāo)記物的純化 葡聚糖凝膠 ：Sephadex分子量125I標(biāo)記物的鑒定 1.放射性化學(xué)純度 是指結(jié)合于抗原上的放射性強(qiáng)度占總放射性總強(qiáng)度的百分率。一般要求游離碘含量占總放射性碘的5

26、%以下。標(biāo)記抗原在貯存過(guò)久后會(huì)出現(xiàn)標(biāo)記物的脫碘，如游離碘超過(guò)5則應(yīng)重新純化去除這部分游離碘。62125I標(biāo)記物的鑒定 1.放射性化學(xué)純度 62125I標(biāo)記物的鑒定 2. 免疫活性 指標(biāo)記抗原結(jié)合于抗體的放射性占總放射性的百分率。方法是用小量的標(biāo)記抗原加過(guò)量的抗體(10倍量)，反應(yīng)后分離結(jié)合部分(B)和游離部分(F)，分別測(cè)定放射性，算出B/T。此值應(yīng)在80以上，該值越大，表示抗原損傷越少。 63125I標(biāo)記物的鑒定 2. 免疫活性 63 3. 比度： 指單位化學(xué)量標(biāo)記物中所含的放射性強(qiáng)度，即每分子被標(biāo)記物平均所標(biāo)記放射性原子數(shù)目，Ci/g、 Ci/g等單位。125I標(biāo)記物的鑒定64 3. 比度

27、：125I標(biāo)記物的鑒定64抗原抗體反應(yīng)類型1. 平衡飽和法 指抗原和抗體反應(yīng)達(dá)到再不結(jié)合、也不解離的平衡狀態(tài)，稱為飽和狀態(tài)。操作時(shí)在反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)加入標(biāo)準(zhǔn)品(或樣品)、標(biāo)記抗原和特異性抗體，混勻后在一定溫度下孵育一定時(shí)間，使三種成分的反應(yīng)幾率相同。一般來(lái)說(shuō)，平衡法的反應(yīng)時(shí)間需較長(zhǎng)，低溫（4）或室溫為1天，但操作方便，精密度較好。 65抗原抗體反應(yīng)類型1. 平衡飽和法65抗原抗體反應(yīng)類型2.順序加樣法 將標(biāo)準(zhǔn)品(或樣品)先與抗體一同溫育反應(yīng)一定時(shí)間，使抗原與抗體充分結(jié)合，甚至達(dá)到平衡，然后加入標(biāo)記抗原再短時(shí)溫育，與剩余的抗體結(jié)合，最后分離B與F。此法使非標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合形成復(fù)合物的幾率大于標(biāo)記抗

28、原，相當(dāng)于使非標(biāo)記抗原具有較高的競(jìng)爭(zhēng)能力，結(jié)果使劑量反應(yīng)曲線的斜率增加，有利于提高分析的靈敏度。 66抗原抗體反應(yīng)類型2.順序加樣法66RIA B、F分離方法1. 第二抗體沉淀法 在抗原與抗體反應(yīng)后加入第二抗體，形成雙抗體復(fù)合物。但因第一抗體濃度甚低，其復(fù)合物亦極少，無(wú)法進(jìn)行離心分離，為此在分離時(shí)加入一定量的與一抗同種動(dòng)物的血清或IgG，使之與第二抗體形成可見(jiàn)的沉淀物，與上述抗原的雙抗體復(fù)合物形成共沉淀。經(jīng)離心即可使含有結(jié)合態(tài)抗原（B）的沉淀物沉淀，與上清液中的游離標(biāo)記抗原（F）分離。該血清或IgG通常稱為分析試劑。67RIA B、F分離方法1. 第二抗體沉淀法67RIA B、F分離方法2.聚

29、乙二醇（PEG）沉淀法 是以PEG溶液代替第二抗體作沉淀劑。在測(cè)定不含有血漿蛋白的樣品時(shí)，用PEG沉淀劑分離B、F，必須加適量蛋白或正常人混合血清，以增加蛋白的含量，便于沉淀。PEG沉淀劑的主要優(yōu)點(diǎn)是制備方便、沉淀完全。缺點(diǎn)是非常特異性結(jié)合率比用第二抗體為高，且溫度高于30時(shí)沉淀物容易復(fù)溶。 68RIA B、F分離方法2.聚乙二醇（PEG）沉淀法 68THANK YOUSUCCESS2022/10/269可編輯THANK YOUSUCCESS2022/10/26RIA B、F分離方法3. PR試劑法 是一種將雙抗體與PEG二法相結(jié)合的方法。此法保持了兩者的優(yōu)點(diǎn)，節(jié)省了兩者的用量，而且分離快速、

30、簡(jiǎn)便。 70RIA B、F分離方法3. PR試劑法 70RIA B、F分離方法4.活性炭吸附法 小分子游離抗原或半抗原被活性炭吸附，大分子復(fù)合物留在溶液中。在抗原與特異性抗體反應(yīng)后，加入葡聚糖活性炭。放置510min，使游離抗原吸附在活性炭顆粒上，離心使顆粒沉淀，上清液中含有結(jié)合的標(biāo)記抗原。此法適用于測(cè)定類固醇激素、強(qiáng)心糖苷和各種藥物，因?yàn)樗鼈兪窍鄬?duì)非極性的，又比抗原抗體復(fù)合物小，易被活性炭吸附。 71RIA B、F分離方法4.活性炭吸附法 71IRMA B、F分離方法固相分離法 利用聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯塑料試管（小珠）作為固相載體，將特異性抗體或抗原直接吸附于管壁（小珠），利用固相抗體或

31、抗原分離B和F。 72IRMA B、F分離方法固相分離法 72RIA與IRMA的比較免疫放射分析放射免疫分析標(biāo)記物抗體抗原標(biāo)記物用量過(guò)量限量反應(yīng)方式直接結(jié)合，反應(yīng)參數(shù)與待測(cè)抗原量成正比競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，反應(yīng)參數(shù)與待測(cè)抗原量成反比反應(yīng)速率較快較慢B、F分離方法固相抗體等第二抗體等特異性高較高靈敏度高較高73RIA與IRMA的比較免疫放射分析放射免疫分析標(biāo)記物抗體抗原所有試劑最好平衡到室溫后加樣。由于血清標(biāo)準(zhǔn)或樣品長(zhǎng)時(shí)間保存后會(huì)出現(xiàn)上稀下濃現(xiàn)象，分離劑更是如此，所以試劑包括樣品在內(nèi)加樣前應(yīng)搖勻。 不同批號(hào)的試劑最好不要混合使用。加樣或溶解時(shí)，注意各試劑之間不要相互污染。 放射免疫分析實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 74所

32、有試劑最好平衡到室溫后加樣。由于血清標(biāo)準(zhǔn)或樣品長(zhǎng)時(shí)間保存后同次實(shí)驗(yàn)要保證所有管中加入的標(biāo)記物、抗體完全一致。當(dāng)一次檢測(cè)大量樣品時(shí)將兩瓶或兩瓶以上的標(biāo)記物混合在一起后加樣，以保證實(shí)驗(yàn)的一致性。抽吸上清液時(shí)，應(yīng)特別注意不要將沉淀抽走，否則將嚴(yán)重影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)于藥盒(100管)中提供2瓶標(biāo)記物的多肽類產(chǎn)品，一般標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性欠佳，要求現(xiàn)用現(xiàn)溶，復(fù)溶后低溫冰凍保存，應(yīng)盡量減少液體狀態(tài)放置的時(shí)間。放射免疫分析實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 75同次實(shí)驗(yàn)要保證所有管中加入的標(biāo)記物、抗體完全一致。當(dāng)一次檢測(cè)1、放射性（125 I），對(duì)環(huán)境的污染及對(duì)身體的危害，該方法已經(jīng)為重視環(huán)保的國(guó)家逐步取消。（如整個(gè)歐洲僅

33、尚存幾個(gè)放免試驗(yàn)室）2、125 I 的半衰期短而導(dǎo)致其試劑有效期短。3、標(biāo)記物125 I 的穩(wěn)定性差，導(dǎo)致試劑盒批間、批內(nèi)的變異較大；標(biāo)準(zhǔn)曲線有效期短，必須每次定標(biāo)，造成浪費(fèi)。4、操作繁瑣，出報(bào)告時(shí)間長(zhǎng)。5、無(wú)法保存?zhèn)溆?。放免技術(shù)的缺點(diǎn)761、放射性（125 I），對(duì)環(huán)境的污染及對(duì)身體的危害，該方法以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體進(jìn)行抗原定位稱為熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱為熒光抗原法。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞（或組織）化學(xué)技術(shù)。 三、免疫熒光技術(shù)（FIA）77以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體進(jìn)行抗原定位稱為熒光抗體法；三、免疫熒光技能與蛋

34、白質(zhì)分子形成共價(jià)鍵，結(jié)合后不易解離，未結(jié)合及其降解產(chǎn)物易清除；熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合仍保持較高的效率；熒光的顏色與背景組織的顏色對(duì)比鮮明結(jié)合蛋白質(zhì)后，不影響其活性標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存；安全無(wú)毒，不具有附加的抗原性。熒光色素應(yīng)具備的條件78能與蛋白質(zhì)分子形成共價(jià)鍵，結(jié)合后不易解離，未結(jié)合及其降解產(chǎn)物 異硫氰酸熒光素（黃），F(xiàn)ITC，應(yīng)用最廣泛,呈黃綠色熒光，分子量為389.4。四乙基羅丹明，RB200，熒光效率低，多用于FITC的襯比染色或雙標(biāo)記，橙色熒光四甲基異硫氰酸羅丹明，TRITC，發(fā)橙紅色熒光 。藻紅蛋白，PE，發(fā)橙色熒光 ，熒光強(qiáng)度比FITC強(qiáng)19倍。常用熒光色素79

35、異硫氰酸熒光素（黃），F(xiàn)ITC，應(yīng)用最廣泛,呈黃綠 熒光的標(biāo)記1. Marsshall方法 依據(jù)欲標(biāo)記的蛋白總量(溶于生理鹽水或碳酸鹽緩沖液 )，按每毫克蛋白加0.01mgFITC。邊攪拌邊將稱取的FITC粉末逐漸加入球蛋白溶液中（510min內(nèi)加完），加完后4持續(xù)攪拌1218h。結(jié)合完畢后，將球蛋白溶液2500r/min 離心20min，取上清裝入透析袋中，用pH8.0緩沖鹽水透析（04）過(guò)夜。取透析過(guò)夜的標(biāo)記物，過(guò)葡聚糖凝膠G-25或G-50柱，分離游離FITC，。80 熒光的標(biāo)記1. Marsshall方法 80 熒光的標(biāo)記2. Chadwick方法 用04 pH8.0 PBS溶液將球蛋

36、白溶液稀釋至濃度為3040mg/ml，后冰浴。按每毫克蛋白加入FITC 0.01mg，用3%重碳酸鈉水溶液溶解。將準(zhǔn)備的抗體與FITC等量混合，充分?jǐn)噭蚝?，?4冰浴結(jié)合1824h。透析和層析同Marshall方法。81 熒光的標(biāo)記2. Chadwick方法 81免疫熒光技術(shù)反應(yīng)類型82免疫熒光技術(shù)反應(yīng)類型82 直接法滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液，保溫30min。取出玻片，先用PBS沖洗后，再按順序過(guò)PBS溶液三缸浸泡，每缸3-5 min，不時(shí)振蕩。取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，緩沖甘油封固，熒光顯微鏡觀察 。AgYFluorochromeLabeled AbTissue

37、Section83 直接法滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液，保溫30m 直接法需設(shè)置的對(duì)照標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照：標(biāo)本加12滴0.01mol/L pH7.4的PBS。特異性對(duì)照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。陽(yáng)性對(duì)照：已知的陽(yáng)性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。 84 直接法需設(shè)置的對(duì)照標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照：標(biāo)本加12 間接法滴加適當(dāng)稀釋的抗體，37保溫30min。取出玻片，先用PBS沖洗12次，然后按順序過(guò)PBS三缸浸泡，每缸5min，不時(shí)振蕩 。取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴一定稀釋度熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體。 37保溫30min。重復(fù)操作2。取出玻片，用濾紙吸去

38、多余水分，緩沖甘油封固，熒光顯微鏡觀察 。AgYYFluorochromeLabeled Anti-IgTissue Section85 間接法滴加適當(dāng)稀釋的抗體，37保溫30min。A 間接法需設(shè)置的對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性血清+熒光標(biāo)記物。陰性對(duì)照：陰性血清+熒光標(biāo)記物。熒光標(biāo)記物對(duì)照：PBS+熒光標(biāo)記物。 陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照86 間接法需設(shè)置的對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性血清+熒光標(biāo)記物 補(bǔ)體法吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清及補(bǔ)體等量混合液滴于切片上，37作用30min。用緩沖鹽水洗2次，每次5min，吸干標(biāo)本周圍水液。滴加經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的抗補(bǔ)體熒光抗體，37作用30min，水洗同上。蒸餾水洗1min，緩沖甘油封

39、固，熒光顯微鏡視野下觀察 。87 補(bǔ)體法吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清及補(bǔ)體等量混合液滴于 補(bǔ)體法需設(shè)置的對(duì)照陽(yáng)性血清對(duì)照正常陰性血清對(duì)照滅活補(bǔ)體對(duì)照：將補(bǔ)體經(jīng)56 處理30min后，進(jìn)行補(bǔ)體法染色。88 補(bǔ)體法需設(shè)置的對(duì)照陽(yáng)性血清對(duì)照88 雙重染色法 一步法雙染色 先將兩種標(biāo)記抗體按適當(dāng)比例混合（A+B），按直接法進(jìn)行染色。二步法雙染色 先用RB200標(biāo)記的B抗體染色，不必洗去，再用FITC標(biāo)記的A抗體染色，按間接法進(jìn)行。89 雙重染色法 一步法雙染色 89“一”： 無(wú)或可見(jiàn)微弱熒光；“+”： 僅能見(jiàn)明確可見(jiàn)的熒光；“+”： 可見(jiàn)有明亮的熒光；“+”：可見(jiàn)耀眼的熒光。結(jié)果判定90“一”： 無(wú)或可見(jiàn)

40、微弱熒光；結(jié)果判定909191應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后，點(diǎn)燃超高壓汞燈515min，待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)定后，眼睛完全適應(yīng)暗室，再開(kāi)始觀察標(biāo)本。防止紫外線對(duì)眼睛的損害，在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。檢查時(shí)間每次以12h為宜，超過(guò)90min超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱。免疫熒光技術(shù)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 92應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后，點(diǎn)燃超高壓汞燈515min熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間，保護(hù)光源，避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。標(biāo)本染色后應(yīng)立即觀察，標(biāo)本受紫外線照射35min后，熒光也明顯減弱，若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4保存，可延緩熒光減弱時(shí)間。免疫熒光技術(shù)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 93熒光

41、顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間，保護(hù)光源細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)方面病毒學(xué)檢驗(yàn)方面寄生蟲(chóng)學(xué)檢驗(yàn)方面自身抗體的檢測(cè)細(xì)胞免疫學(xué)方面免疫熒光技術(shù)應(yīng)用94免疫熒光技術(shù)應(yīng)用94標(biāo)本不能永久保存，熒光有自然消退現(xiàn)象，需及時(shí)觀察及照相；有非特異性熒光的干擾；對(duì)組織細(xì)胞進(jìn)行微細(xì)結(jié)構(gòu)的觀察做不到；用熒光顯微鏡觀察；需用經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員。免疫熒光技術(shù)的缺點(diǎn)95免疫熒光技術(shù)的缺點(diǎn)95流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM) 流式細(xì)胞術(shù)是將免疫熒光技術(shù)應(yīng)用于流式細(xì)胞儀，對(duì)單個(gè)細(xì)胞的表面標(biāo)志（抗原或受體）進(jìn)行快速、精確的分析和自動(dòng)檢測(cè)，并可將不同類型的細(xì)胞分選收集。Green Fluorescence

42、IntensityNumber of CellsUnstained cellsFITC-labeled cellsOne Parameter Histogram96流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM) TRFIA是用鑭系稀土元素螯合物標(biāo)記抗體或抗原，檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原或抗體，用時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)儀測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物中的熒光強(qiáng)度。根據(jù)產(chǎn)物熒光強(qiáng)度和相對(duì)熒光強(qiáng)度的比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，從而達(dá)到定量分析。四、時(shí)間分辨熒光免疫分析（time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA）97 TRFIA是用鑭系稀土元素螯合物標(biāo)記抗體或抗原，檢測(cè)TRFI

43、A中使用的鑭系元素包括：銪(Eu)、釤（Sm)、 锝(Tb) 、鏑(Dy) 等。銪(Eu)最為常用。：標(biāo)記物為稀土金屬-鑭系元素98TRFIA中使用的鑭系元素包括：銪(Eu)、釤（Sm)、 锝鑭系元素?zé)晒馓攸c(diǎn)：熒光壽命極長(zhǎng)鑭系元素螯合物（600-900 us) 銪：714us普通熒光免疫中熒光團(tuán)：1-100us 樣本中蛋白質(zhì)熒光：1-10us，易猝滅。Stokes位移大（大約290nm） 銪：發(fā)射光613nm、激發(fā)光340nm， 熒光素的Stokes位移為28nm 。熒光特異性強(qiáng)。（發(fā)射光譜帶很窄：613 5nm）解離-增強(qiáng)技術(shù)可使其熒光性提高100萬(wàn)倍 。99鑭系元素?zé)晒馓攸c(diǎn)：熒光壽命極長(zhǎng)S

44、tokes位移大（大約290的技術(shù)特點(diǎn)（一）：時(shí)間分辨時(shí)間分辨：利用鑭系元素?zé)晒馕锢硖匦?，熒光激發(fā)后在固定時(shí)間段檢測(cè)特異性熒光，而在此時(shí)間之前，非特異性熒光已完全衰減為0。100的技術(shù)特點(diǎn)（一）：時(shí)間分辨時(shí)間分辨：利用鑭系元素的技術(shù)特點(diǎn)（二）：波長(zhǎng)分辨波長(zhǎng)分辨：發(fā)射光譜與激發(fā)光譜間存在的巨大Stokes位移?？梢酝ㄟ^(guò)干涉濾光片將發(fā)射光譜與激發(fā)光譜完全分離。101的技術(shù)特點(diǎn)（二）：波長(zhǎng)分辨波長(zhǎng)分辨：發(fā)射光譜與激發(fā)的技術(shù)特點(diǎn)（三）：多標(biāo)記102的技術(shù)特點(diǎn)（三）：多標(biāo)記102的技術(shù)特點(diǎn)（四）： 解離增強(qiáng)技術(shù)增強(qiáng)液作用機(jī)理：加入增強(qiáng)液后，可以使Eu3+從反應(yīng)復(fù)合物中解離下來(lái)，游離的Eu3+同增強(qiáng)液中的

45、另一種螯合劑形成一種膠態(tài)分子團(tuán)，這種分子團(tuán)在激發(fā)光的激發(fā)下能夠發(fā)出強(qiáng)烈熒光，信號(hào)可以增強(qiáng)100萬(wàn)倍。 增強(qiáng)液是提高檢測(cè)靈敏度的一個(gè)關(guān)鍵因素。103的技術(shù)特點(diǎn)（四）： 解離增強(qiáng)Wallac AutoDELFIA 1235DR-M6601104Wallac AutoDELFIA 1235DR-M6601五、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（CLEIA）化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析(CLIA)電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)105五、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（CLEIA）105步驟與酶免疫測(cè)定相同，僅最后一步酶反應(yīng)所用底物為發(fā)光劑，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)所發(fā)出的光在特定的儀器上進(jìn) 行測(cè)定。標(biāo)記酶：HRP、

46、AP發(fā)光劑：魯米諾及衍生物、螺旋金剛烷環(huán)氧化物苯磷酸酯等化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA）106步驟與酶免疫測(cè)定相同，僅最后一步酶反應(yīng)所用底物為發(fā)光劑，通過(guò)AbAgEH2O2H2O2光信號(hào)檢測(cè)器魯米諾CLEIA原理107AbAgEH2O2H2O2光信號(hào)檢測(cè)器魯米諾CLEIA原理1AXSYM系統(tǒng)：美國(guó)雅培公司ACS系統(tǒng) ：德國(guó)拜耳公司 LIAISON系統(tǒng) ：德國(guó)Byk-Sangtec公司化學(xué)發(fā)光酶免疫分析 108AXSYM系統(tǒng)：美國(guó)雅培公司化學(xué)發(fā)光酶免疫分析 108用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體的一類免疫測(cè)定。發(fā)光劑：三價(jià)鐵

47、魯米諾、吖啶酯吖啶酯/ H2O2系統(tǒng)：即用吖啶酯標(biāo)記抗體或抗原，用H2O2和NaOH作發(fā)光啟動(dòng)試劑，固相載體為極細(xì)小的磁性顆粒。 化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析（chemiluminescence immunoassay,CLIA）109用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體的一類免疫測(cè)定。化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免+發(fā)光物標(biāo)記Ag固相抗體+AgCLIA原理110+發(fā)光物標(biāo)記Ag固相抗體+AgCLIA原理110Vitos ECI 系統(tǒng)：美國(guó)強(qiáng)生公司 Access系統(tǒng)：美國(guó)貝克曼公司 Immulite系統(tǒng)：美國(guó)DPC公司 化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析 111Vitos ECI 系統(tǒng)：美國(guó)強(qiáng)生公司 化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析Ru(bpy)3

48、2+為標(biāo)記物： 三聯(lián)吡啶釕為水溶性，高穩(wěn)定性的小分子，可以確保電化學(xué)發(fā)光的高效性及穩(wěn)定性，并且無(wú)噪音干擾。TPA：類似EIA中底物，是ECL中的電子供體，氧化后生成的中間產(chǎn)物是形成激發(fā)態(tài)Ru(bpy)32+的化學(xué)能來(lái)源電化學(xué)發(fā)光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay,ECLIA）112Ru(bpy)32+為標(biāo)記物：電化學(xué)發(fā)光免疫分析112 反應(yīng)在陽(yáng)電極表面進(jìn)行, 三聯(lián)吡啶釕和TPA可同時(shí)失去電子發(fā)生氧化反應(yīng)。二價(jià)的Ru(bpy)32+被氧化成Ru(bpy)33+，TPA被氧化成陽(yáng)離子自由基TPA+.，后者失去一個(gè)質(zhì)子，成為自由基TPA.，這是一個(gè)強(qiáng)還

49、原劑，可將一個(gè)電子遞給Ru(bpy)33+，使其成為激發(fā)態(tài)的Ru(bpy)32+*，而TPA自身被氧化成TPA氧化產(chǎn)物，激發(fā)態(tài)的Ru(bpy)32+* 在衰減時(shí)發(fā)射一個(gè)波長(zhǎng)為620nm的光子，重新生成基態(tài)的Ru(bpy)32+。這一過(guò)程在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行，產(chǎn)生許多光子，使光信號(hào)得以增強(qiáng)。電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定原理113 反應(yīng)在陽(yáng)電極表面進(jìn)行, 三聯(lián)吡啶釕和TPA可同時(shí)失去Ru2+alkaline stateRu3+TPATPAlTPA+lH+e-Platinum electrodeMagnet-+Ru2+acid state Capturing of microbeadson electro

50、de surface電化學(xué)發(fā)光的發(fā)光及檢測(cè)系統(tǒng)Ru2+Ru3+TPATPAlTPA+lH+e-Platin微珠以及表面的凸凹使包被面積極聯(lián)式放大。載體懸浮于反應(yīng)體系中，使異相反應(yīng)成類似均相反應(yīng)，大大加快反應(yīng)速度。磁性微珠方便吸引分離。獨(dú)特的磁性微粒子115微珠以及表面的凸凹使包被面積極聯(lián)式放大。獨(dú)特的磁性微粒子11Elecsys1010Elecsys2010E170電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)Elecsys2010116Elecsys1010Elecsys2010E170電化學(xué)發(fā)原理：以微孔濾膜為載體，包被已知抗原或抗體，加入待檢標(biāo)本后，經(jīng)濾膜的毛細(xì)管作用使標(biāo)本中的抗體或抗原與膜上包被的抗原或

51、抗體結(jié)合，再通過(guò)膠體金或超順磁性納米微粒結(jié)合物達(dá)到檢測(cè)目的。斑點(diǎn)金免疫滲濾技術(shù)（DIGFA或GIFA）金標(biāo)免疫層析技術(shù)（GICA）磁性免疫層析技術(shù)（MICT） 六、金標(biāo)和磁珠免疫層析技術(shù)117原理：以微孔濾膜為載體，包被已知抗原或抗體，加入待檢標(biāo)本后，斑點(diǎn)金免疫滲濾(Dot immunogold filtration, DIGFA)蓋微孔膜吸水墊料底118斑點(diǎn)金免疫滲濾(Dot immunogold filtra金標(biāo)免疫層析法(Gold Immunochromatography Aassay , GICA)119金標(biāo)免疫層析法(Gold Immunochromatogr吸水紙質(zhì)控線檢測(cè)線標(biāo)記單抗及樣品流動(dòng)方向吸水紙吸水紙吸水紙陽(yáng)性陰性失效膠體金免疫層析試紙條的檢測(cè)原理及結(jié)果判定120吸水紙質(zhì)控線檢測(cè)線標(biāo)記單抗及樣品流動(dòng)方向吸水紙吸水紙吸水紙陽(yáng)121121磁性免疫層析技術(shù)（Magnetic Immune Chroma