陰虛內(nèi)熱證紅斑狼瘡?fù)庵苎獑我缓思?xì)胞BCL2基因家族動(dòng)態(tài)研究

1、陰虛內(nèi)熱證紅斑狼瘡?fù)庵苎獑我缓思?xì)胞BCL-2基因家族動(dòng)態(tài)研究【摘要】目的研究激素滋陰清熱方治療前、中、后陰虛內(nèi)熱證紅斑狼瘡SLE外周血單一核細(xì)胞PB凋亡相關(guān)BL-2基因家族的動(dòng)態(tài)表達(dá)。方法陰虛內(nèi)熱證SLE患者治療前、中、后三次及安康對(duì)照組外周血單一核細(xì)胞基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)，對(duì)BL-2基因家族成員數(shù)據(jù)進(jìn)展分析。結(jié)果找到BL-2基因家族基因16個(gè)，其中BL-2、BAG3治療前、中、后均明顯下調(diào)，而B(niǎo)AG1、BL6、BLA21治療后表達(dá)均上調(diào)。結(jié)論陰虛內(nèi)熱證SLE患者PB存在BL-2基因家族凋亡基因的異常，激素與滋陰清熱方治療后抑制/促進(jìn)凋亡的BL-2基因比例發(fā)生明顯改變，細(xì)胞凋亡減少。BL6可能是

2、中醫(yī)藥等治療SLE的靶基因之一。提示研究不同證型SLE治療前后T、B淋巴細(xì)胞亞型的凋亡情況及凋亡機(jī)制，是合理評(píng)價(jià)凋亡在SLE發(fā)病及診治中的作用的關(guān)鍵。凋亡基因的調(diào)控可能是滋陰清熱方實(shí)現(xiàn)陰平陽(yáng)秘的內(nèi)在機(jī)制之一，有待深化研究?！娟P(guān)鍵詞】陰虛內(nèi)熱證；系統(tǒng)性紅斑狼瘡SLE；BL-2；細(xì)胞凋亡Abstrat：bjetiveTstudythedynaiexpressinftheapptsis-assiatedBL-2genefailyintheperipheralbldnnulearells(PB)ftheheatdefiienypatientsithlupuserytheatsus(SLE)befre,

3、duringandaftertreatentithhrneandZiyinQingrefrula.ethdsBefre,duringandaftertreatent,peripheralbldnnulearellsftheSLEpatientsith“Yinastheniageneratingintrinsiheatereseparated,thenDNAirarrayhipasusedtanalyzeandpardithahealthyntrlgrup,inthispart,thedatafBL-2genefailyebersereseletedutandanalyzed.Results16

4、BL-2failygeneerefund.TheexpressinfBL-2andBAG3eresignifiantlyreduedbefre,duringandaftertreatent,hiletheexpressinfBAG1,BL6andBLA21asinreasedaftertreatent.nlusinAbnralitiesfBL-2failygeneinPBfSLEpatientsith“Yindefiienyheaterebserved.ApptsissuppressinandprtingenefBL-2failyerehangedbythehrnesandZiyinQingr

5、efrulatreatenthihledtreduingapptsis.BL6aybenefthetargetgenehihasaffetedbythetreatentfhineseediine.TstudythedifferentsubtypesapptsisandapptsisehanissfTandBlyphytefSLEithdifferentsyndrepatternbefreandaftertreatentisveryiprtantfrestiatinntherlefapptsisinSLEpathgenesis,diagnsisandtreatent.Regulatinfappt

6、tigenesaybeneftheehanissfZiyinQingrefrulatahieveYinandYanginarelativeequilibriu.Keyrds：Yinastheniageneratingintrinsiheat;Systeatilupuserytheatsus(SLE);BL-2;ApptsisSLE是多基因相關(guān)的自身免疫性系統(tǒng)性疾病，發(fā)病與細(xì)胞異常凋亡親密相關(guān)。BL-2/Bax是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的通路之一。Bax是BL-2癌基因家族中可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白，BL-2是可以抑制細(xì)胞凋亡的蛋白，兩者的比值決定細(xì)胞凋亡與否，當(dāng)Bax多時(shí)，細(xì)胞凋亡，否那么凋亡延緩1。BL基

7、因家族中其它基因也與細(xì)胞凋亡親密相關(guān)。陰虛內(nèi)熱證是SLE的最常見(jiàn)最根本的證型。廣東省中醫(yī)院皮膚科多年應(yīng)用滋陰清熱方治療陰虛內(nèi)熱證SLE獲得良好效果，我們研究陰虛內(nèi)熱證SLE中醫(yī)藥治療后BL基因家族表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，試圖從基因程度討論其現(xiàn)代分子機(jī)制。1臨床資料2研究方法2.1治療方法2.1.1中藥治療滋陰清熱方(狼瘡號(hào))，5粒/次，3次/d口服。局部病人陰虛內(nèi)熱癥候比擬明顯時(shí)，短期配合使用滋陰清熱方湯劑，加強(qiáng)滋陰清熱成效。2.1.2一般治療及對(duì)癥處理保護(hù)胃粘膜、補(bǔ)鉀、補(bǔ)鈣、抗感染。西醫(yī)藥除激素外，只根據(jù)患者激素用量配合使用泰胃美、雷尼替丁保護(hù)胃粘膜。2.1.3激素治療所有病例均維持納入時(shí)的激素用量

8、，最高不超過(guò)25g。療程3個(gè)月。2.2表達(dá)譜基因芯片實(shí)驗(yàn)方法分別于治療前、治療中6周和治療后12周采靜脈血?jiǎng)e離提取淋巴細(xì)胞，然后按基因芯片技術(shù)要求提取總RNA，70保存?zhèn)溆?，按完?個(gè)月療程的先后順序送檢9例患者的27個(gè)樣本和10例正常人樣本，其中4例患者至少有一次樣本不符合基因芯片實(shí)驗(yàn)要求，最后選擇了3次樣本均合格的5例患者的15個(gè)樣本及正常對(duì)照組10個(gè)樣本，首先對(duì)樣品進(jìn)展體外擴(kuò)增處理，隨后對(duì)擴(kuò)增后的RNA樣品采用反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記方法摻入Y3熒光分子，每個(gè)樣品完成一張GS芯片人類基因表達(dá)譜芯片由微芯生物公司采用DNA直接點(diǎn)樣消費(fèi)，共點(diǎn)有8064個(gè)基因點(diǎn)，其中7458個(gè)為表達(dá)基因片段實(shí)驗(yàn)。2.3數(shù)據(jù)

9、處理與統(tǒng)計(jì)分析比值Rati表示熒光信號(hào)通過(guò)LESS方法歸一化后，基因表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組和對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組間的變化倍數(shù)大于1的數(shù)值代表相應(yīng)基因表達(dá)量上調(diào)的倍數(shù)，小于1的數(shù)值那么代表相應(yīng)基因表達(dá)量下調(diào)，其倍數(shù)那么用1除以該數(shù)值后的負(fù)數(shù)來(lái)表示。按兩個(gè)樣品信號(hào)強(qiáng)度間的比值Rati大于2或小于0.5的數(shù)據(jù)作為表達(dá)有顯著性差異的基因數(shù)據(jù)。用SPSS13.0軟件將16個(gè)BL基因家族成員基因前、中、后3次表達(dá)與正常人的表達(dá)的比值Rati進(jìn)展重復(fù)測(cè)量方差分析和多元方差分析，兩兩比擬用SNK法。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3結(jié)果BL基因家族與細(xì)胞凋亡等親密相關(guān)，我們對(duì)16個(gè)BL相關(guān)基因進(jìn)展分析，總體3次表達(dá)無(wú)差異P=0.

10、560，而不同基因間有顯著性差異P=0.000，測(cè)量時(shí)間與不同基因間存在交互作用P=0.014，說(shuō)明不同基因在不同時(shí)間有差異表達(dá)。從圖1可以看到BL2、BAG3治療前、中、后均明顯下調(diào)，而B(niǎo)AG1、BL6、BLA21治療后表達(dá)均上調(diào)，兩類基因間表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P0.05，但同一基因間兩兩比擬差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05，與孫保東等3的研究類似。4討論細(xì)胞凋亡與SLE發(fā)病親密相關(guān)，細(xì)胞凋亡在SLE發(fā)病中的作用研究觀點(diǎn)不一，淋巴細(xì)胞異常凋亡導(dǎo)致自身抗原的產(chǎn)生或者細(xì)胞凋亡可去除自身反響性細(xì)胞的觀點(diǎn)不一。本研究中發(fā)現(xiàn)許多凋亡相關(guān)基因表達(dá)與正常人有差異，治療前后都有抗凋亡與促凋亡基因表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)。BL

11、-2基因家族在凋亡的調(diào)控中有重要作用，其中抗凋亡的有：BL-2，A1，BL-xl，BL-，l-1，促進(jìn)凋亡的有Bax，Bak，Bad，Bid，Bi，Bik，BNIP34。研究證實(shí)BL-2通過(guò)與Bax結(jié)合抑制凋亡,Bad通過(guò)與Bl-2的結(jié)合置換Bax,bax/BL-2比例可調(diào)控凋亡的發(fā)生：BL-2程度高于Bax時(shí)，細(xì)胞對(duì)凋亡不敏感，反之細(xì)胞易于凋亡。Bax在安康細(xì)胞中以單體形式存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)受到相關(guān)的凋亡信號(hào)刺激時(shí)會(huì)轉(zhuǎn)移到線粒體上，直接或間接地與線粒體通道蛋白作用，引起細(xì)胞色素的釋放。Bad的BH3域可以與BL-2家族在線粒外膜結(jié)合而使之滅活，從而促進(jìn)凋亡的發(fā)生。我們的研究發(fā)現(xiàn)抑制凋亡的BL

12、-2基因表達(dá)程度治療前、中、后均顯著低于正常人的表達(dá)，而B(niǎo)AG1基因也是抗凋亡基因，治療前接近正常人，治療3個(gè)月后升高，BL2A1也是抗凋亡基因，治療后顯著升高。而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因BAX、BAK1治療前高于正常人，治療后接近正常人?？梢?jiàn)治療前Bl-2/Bax比值顯著低于正常，提示SLE通過(guò)BL-2/Bax細(xì)胞凋亡途徑促進(jìn)外周單一核細(xì)胞的凋亡，與張麗霞5的研究發(fā)現(xiàn)相一致。治療后BL-2/Bax升高，提示治療后外周單一核細(xì)胞的凋亡減少，與溫成平等觀察到解毒祛瘀滋陰藥治療后的BL-2/Bax比值升高相一致6。原癌基因BL6編碼一種DNA結(jié)合蛋白，為一核轉(zhuǎn)錄因子，其功能是調(diào)節(jié)淋巴結(jié)生發(fā)中中心B細(xì)胞的

13、分化與發(fā)育成熟，生發(fā)中心B細(xì)胞表達(dá)BL6，分開(kāi)生發(fā)中心后停頓表達(dá)。BL6可抑制P53在生發(fā)中心B淋巴細(xì)胞的組成型表達(dá)而保護(hù)因DNA損害誘導(dǎo)的凋亡7。有研究認(rèn)為，缺乏BL6表達(dá)的B細(xì)胞雖可以在脾臟中分化成Ig和IgG1記憶B細(xì)胞，但很少在骨髓中分化成長(zhǎng)壽的能分泌IgG1抗體的B細(xì)胞8。BL6治療3個(gè)月后表達(dá)顯著上調(diào)，提示治療后B細(xì)胞較多從淋巴結(jié)生發(fā)中心釋放到外周血中，這可能與治療后外周異常克隆B淋巴細(xì)胞被去除，而生發(fā)中心的正常B淋巴細(xì)胞因BL6表達(dá)的進(jìn)步而凋亡減少且分化發(fā)育成熟加快，從而轉(zhuǎn)移到外周血中以發(fā)揮正常的功能。提示BL6可能是中醫(yī)藥等治療SLE的靶基因之一，有待進(jìn)一步深化研究。眾多研究發(fā)

14、現(xiàn)SLE患者常常同時(shí)有抑制凋亡和促進(jìn)凋亡的基因的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，治療前細(xì)胞凋亡增多，為什么反而有大量異常B淋巴細(xì)胞克隆增殖，產(chǎn)生大量自身抗體，而治療后，外周單一核細(xì)胞凋亡減少，而不是促進(jìn)異常B淋巴細(xì)胞的凋亡，令人費(fèi)解。對(duì)于這一困境的思索，我們認(rèn)為很可能不同類型的T、B淋巴細(xì)胞在SLE發(fā)病的不同階段、治療前后其凋亡率有很大的差異，這種差異可能來(lái)自不同細(xì)胞的凋亡機(jī)制存在差異，這與從這些看似矛盾的研究結(jié)果來(lái)看，可能并不矛盾，而是我們對(duì)細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究仍不夠深化。SLE外周血淋巴細(xì)胞抗凋亡的基因表達(dá)降低而促進(jìn)凋亡的基因表達(dá)增加，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的異常凋亡，進(jìn)而釋放更多的自身抗原入血，驅(qū)動(dòng)B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗

15、體。治療后BL相關(guān)基因家族中抗細(xì)胞凋亡基因上調(diào)與促凋亡基因下調(diào)，外周單一核細(xì)胞凋亡減少，可能與治療后異常T、B淋巴細(xì)胞已被漸漸去除，正常B細(xì)胞較多從淋巴結(jié)生發(fā)中心釋放到外周血中，且正常T、B淋巴細(xì)胞的凋亡減少。我們認(rèn)為，分析研究不同證型SLE治療前后T、B淋巴細(xì)胞亞型的凋亡情況及凋亡機(jī)制，是合理評(píng)價(jià)凋亡在SLE發(fā)病及診治中的作用的關(guān)鍵。中醫(yī)藥治療似乎在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡方面有著獨(dú)特的作用，可以使各種細(xì)胞的凋亡到達(dá)新的平衡，這也許是中醫(yī)辨治到達(dá)陰平陽(yáng)秘的現(xiàn)代機(jī)理之一?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1TaXJ,TillyKI,aravEiDV,etal.Differentialexpressinfebersfthebl-

16、2genefailyinprliferativeandseretryhuanendetriu:glandularepithelialellapptsisisassiatedithinreasedexpressinfbaxJ.JlinEndrinletab,1997,82:2738.2賴梅生滋陰清熱方對(duì)陰虛內(nèi)熱證SLE淋巴細(xì)胞基因及蛋白表達(dá)譜的動(dòng)態(tài)影響D廣州中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文，2022：6.3孫保東，沈南，裴軍，等SLE病人外周血白細(xì)胞Bl22和Bl2XRNA表達(dá)研究J上海免疫學(xué)雜志，2000，204：239.4周桔，羅榮保，湯長(zhǎng)發(fā)，等Bl-2蛋白家族和p53基因在細(xì)胞凋亡中的調(diào)控效應(yīng)J中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2022，1110：1950.5張麗霞，鄭京，洪江淮熱毒熾盛型SLE與腎小球Fas、BL-2、Bax蛋白表達(dá)J中醫(yī)藥學(xué)刊，2022，21(9):1518.6溫成平，曹靈勇，王新昌，等解毒祛瘀滋陰藥對(duì)SLE患者Bax/Bl22基因RNA表達(dá)的影響J浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2022，176：333.7F