葛根素對子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞惡性行為調(diào)控機(jī)制研究

1、葛根素對子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞惡性行為調(diào)控機(jī)制研究【摘要】目的：觀察葛根素對子宮內(nèi)膜異位癥endetrisis，e血管形成的影響以及葛根素對e腫瘤相關(guān)基因的調(diào)控作用。方法：利用子宮內(nèi)膜細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)、雞胚絨毛尿囊膜(hikenhriallantiebrane，a)模型、基因芯片等方法，理解e腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的情況，觀察葛根素對e血管生成、腫瘤相關(guān)基因的調(diào)控作用。結(jié)果：葛根素可明顯抑制種植內(nèi)膜組織囊泡及周邊血管形成，其血管陽性面積顯著小于模型組p0.05?；蛐酒Y(jié)果顯示，增殖期e在位內(nèi)膜組織較之正常在位內(nèi)膜組織、e異位內(nèi)膜組織較之e在位內(nèi)膜組織，在癌基因，抑癌基因，細(xì)胞黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成

2、相關(guān)基因及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)方面有明顯不同。100l/l葛根素可明顯上調(diào)e在位基質(zhì)細(xì)胞凋亡基因bad、bax、asp8、asp9和tnfrsf6表達(dá)，并增強(qiáng)細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子dkn1b、dkn2a及ifna1、ifnb1基因表達(dá)；減少癌基因fs、hek2、sr和黏附侵襲基因itgb5、p9及生長、轉(zhuǎn)錄因子基因pdgfa、nfkbia表達(dá)。結(jié)論：葛根素可以抑制異位灶新生血管的形成，減少異位灶的血液供應(yīng)；通過調(diào)整e癌基因、抑癌基因、細(xì)胞周期相關(guān)因子基因表達(dá)，并通過影響凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而改變e內(nèi)膜細(xì)胞類似腫瘤細(xì)胞的惡性行為。【關(guān)鍵詞】子宮內(nèi)膜異位癥;葛根素;雞胚絨毛

3、尿囊膜模型;基因芯片;腫瘤相關(guān)基因reeivedjuly10,2021;aeptedsepteber12,2021;publishednlinejanuary15,2021.freefulltext(htlandpdf)isavailableat.frardlinkingandreferenelinkingviarssref.di:10.3736/ji20210106penaessregulatryehanisfalignantbehavirfendetrisisediatedbypuerarin1.departentftraditinalhineseediine,hanghaihspital

4、,sendilitaryedialuniversity,shanghai202233,hina2.departentfintegratedtraditinalhineseandesternediine,hspitalfgynelgyandbstetris,fudanuniversity,shanghai200011,hina3.departentftraditinalhineseediine,hangzhenghspital,sendilitaryedialuniversity,shanghai200003,hinakeyrds:endetrisis;puerarin;hikhriallant

5、iebrane;genearray;turrelatedgene子宮內(nèi)膜異位癥endetrisis,e是具有生長功能的子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)種植于子宮腔以外部位的一種雌激素依賴性疾玻它具有的侵襲性、廣泛種植、易復(fù)發(fā)的特性與惡性腫瘤非常相似。e異位灶的生長除依賴于卵巢產(chǎn)生的雌激素外，還依賴于異位灶自分泌的雌激素。研究說明，異位內(nèi)膜組織高表達(dá)細(xì)胞色素芳香化酶p450rna和蛋白1,2。細(xì)胞色素芳香化酶p450是雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的限速酶和關(guān)鍵酶。鑒于植物雌激素上述作用特點(diǎn)，我們認(rèn)為植物雌激素是治療e非常有潛力的藥物。但目前國內(nèi)外對植物雌激素的研究主要在心血管系統(tǒng)、抗腫瘤和改善更年期病癥骨質(zhì)疏松等方面，

6、而其治療e的研究至今國內(nèi)外尚未見報(bào)道。葛根是常用中藥，價(jià)格低廉。而葛根素是中藥葛根的主要有效成分，是一種植物雌激素，其化學(xué)成分為異黃酮化合物，因此葛根素可能是治療子宮內(nèi)膜異位癥的有效藥物。本研究利用子宮內(nèi)膜細(xì)胞原代培養(yǎng)、雞胚尿膜囊hikenhriallantiebrane,a模型、基因芯片等技術(shù)，討論葛根素對e血管形成的抑制作用及葛根素對e腫瘤相關(guān)基因的調(diào)控作用，為臨床上的應(yīng)用奠定基矗1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料38.132.78歲；所有患者均無內(nèi)科合并癥；月經(jīng)規(guī)律，術(shù)前3個(gè)月內(nèi)未用過激素類藥物治療。在剖腹行子宮或子宮及附件全切術(shù)后，無菌條件下別離子宮內(nèi)膜、巧克力囊腫內(nèi)皮以及盆腔異位灶，用于后續(xù)

7、實(shí)驗(yàn)。42.812.58歲；無內(nèi)科合并癥；術(shù)前3個(gè)月內(nèi)未用過激素類藥物治療。均在剖腹行子宮、附件全切術(shù)后，無菌條件下刮取子宮內(nèi)膜，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.3實(shí)驗(yàn)方法參加含與葛根素等量溶媒二甲基亞砜的100lpbs或100l0.1g/l葛根素。滅菌封口膠封住天窗后，置于恒溫孵化箱繼續(xù)孵化72h。用甲醇/丙酮等體積溶液固定尿囊膜，15in后剪下尿囊膜，拍照后用圖像分析軟件分析陽性血管面積，計(jì)算陽性血管面積與分析圖像總面積之比。2結(jié)果2.1葛根素對子宮內(nèi)膜組織黏附、侵襲和生長情況的影響正常在位內(nèi)膜組織、e異位內(nèi)膜組織空白組有較大的囊泡形成，周邊血管生成明顯，而葛根素可明顯抑制種植內(nèi)膜組織囊泡及周邊血管形成

8、。見圖1。圖1各組a種植內(nèi)膜組織囊泡及周邊血管形成情況figure1vesileandangipiesisiniplantedendetrialtissuefaindifferentgrups2.2葛根素對a模型邊緣血管形成情況的影響e異位內(nèi)膜葛根素組血管陽性面積比顯著低于模型組p0.05。見表1。表1各組a模型血管陽性面積比2.3e在位子宮內(nèi)膜組織與正常對照子宮內(nèi)膜組織比較表達(dá)上調(diào)基因與正常子宮內(nèi)膜組織比較，e在位子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)上調(diào)兩倍以上的基因有18個(gè)。見表2。2.4e在位子宮內(nèi)膜組織與正常對照子宮內(nèi)膜組織比較表達(dá)下調(diào)基因e在位子宮內(nèi)膜組織與正常對照子宮內(nèi)膜組織比較，表達(dá)下調(diào)兩倍以上的

9、基因有7個(gè)。見表3。2.5e異位內(nèi)膜組織與e在位內(nèi)膜組織比較上調(diào)基因e異位內(nèi)膜組織與e在位內(nèi)膜組織比較，表達(dá)上調(diào)兩倍以上的基因有10個(gè)。見表4。2.6e異位內(nèi)膜組織與e在位內(nèi)膜組織比較表達(dá)下調(diào)基因e異位內(nèi)膜組織與e在位內(nèi)膜組織比較，表達(dá)下調(diào)兩倍以上的基因有6個(gè)。見表5。表2e在位子宮內(nèi)膜組織與正常對照子宮內(nèi)膜組織比較表達(dá)上調(diào)基因兩倍以上表3e在位子宮內(nèi)膜組織與正常對照子宮內(nèi)膜組織比較表達(dá)下調(diào)基因兩倍以上表4e異位內(nèi)膜組織與e在位內(nèi)膜組織比較上調(diào)基因兩倍以上表5e異位內(nèi)膜組織與e在位內(nèi)膜組織比較表達(dá)下調(diào)基因兩倍以上2.7e在位基質(zhì)細(xì)胞葛根素組與e在位基質(zhì)細(xì)胞空白組比較上調(diào)基因e在位基質(zhì)細(xì)胞葛根素

10、組與空白組比較，表達(dá)上調(diào)兩倍以上的基因有10個(gè)。見表6。2.8e在位基質(zhì)細(xì)胞葛根素組與e在位基質(zhì)細(xì)胞空白組比較下調(diào)基因e在位基質(zhì)細(xì)胞葛根素組與e在位基質(zhì)細(xì)胞空白組比較，表達(dá)下調(diào)兩倍以上的基因有7個(gè)。見表7。表6e在位基質(zhì)細(xì)胞葛根素組與e在位基質(zhì)細(xì)胞空白組比較上調(diào)基因(兩倍以上)表7e在位基質(zhì)細(xì)胞葛根素組與e在位基質(zhì)細(xì)胞空白組比較下調(diào)基因(兩倍以上)3討論3.1a模型在e研究中的價(jià)值和葛根素對e在位、異位內(nèi)膜組織生長及血管形成的影響a模型常用于血管生成活性物質(zhì)或血管生成抑制性物質(zhì)的挑選6。近年來已有作者將其用于觀察腫瘤組織或細(xì)胞生長情況及相關(guān)藥物療效的研究。已有研究說明，e病灶血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因

11、子(vasularendthelialellgrthfatr,vegf)表達(dá)明顯增高，說明部分新生血管生成活潑7。為此，我們認(rèn)為a可能是藥物挑選的理想e模型。本研究將子宮內(nèi)膜在位或異位組織接種于尿囊膜兩條卵黃靜脈之間無血管區(qū)域，72h后內(nèi)膜組織均黏附生長，部分區(qū)域形成較大囊泡，周邊血管生成明顯。其中在位內(nèi)膜組織較之異位內(nèi)膜組織囊泡大、囊液多。這可能與在位內(nèi)膜組織腺上皮細(xì)胞豐富，而異位內(nèi)膜組織腺上皮細(xì)胞相對較少有關(guān)。無論正常在位內(nèi)膜種植組織、e在位內(nèi)膜種植組織和e異位內(nèi)膜種植組織，葛根素組囊泡孝囊液少；且葛根素組e異位內(nèi)膜組血管陽性面積比顯著低于模型組。說明100l/l葛根素可明顯抑制種植內(nèi)膜組

12、織囊泡及周邊血管形成，尤其是對e異位內(nèi)膜組織。3.2正常對照在位內(nèi)膜組織、e在位內(nèi)膜組織和e異位內(nèi)膜組織腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的異同及葛根素的調(diào)控作用e的發(fā)病機(jī)制目前尚不明晰。kninkx等8提出e的起病并不是由于隨經(jīng)血逆流的內(nèi)膜組織的種植或胚胎間質(zhì)細(xì)胞的化生，而是內(nèi)膜細(xì)胞呈現(xiàn)一種惡性的改變，從而異位的內(nèi)膜組織細(xì)胞得以逃開腹腔液的免疫監(jiān)視和調(diào)節(jié)因子的影響，最終由異位內(nèi)膜組織細(xì)胞開展成e。目前有學(xué)者提出子宮內(nèi)膜干細(xì)胞假說，隨經(jīng)血逆流的具有分化潛能和自我更新特征的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞促使最初異位病灶的產(chǎn)生，維持病灶的存在，并進(jìn)一步促使病灶的開展9。我們對e在位內(nèi)膜細(xì)胞與正常對照在位內(nèi)膜細(xì)胞的形態(tài)學(xué)進(jìn)展比較，發(fā)

13、現(xiàn)兩者形態(tài)學(xué)相似10，但在基因表達(dá)方面存在很大差異。增殖期e在位內(nèi)膜組織較之正常在位內(nèi)膜組織erbb2、ets2、fs、s100a4、tek、tert和nfkbia等癌基因表達(dá)明顯增強(qiáng)；與細(xì)胞黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成相關(guān)的基因dh1、d44、itga6、na1、p1、flt1及抑制細(xì)胞凋亡基因akt1、bl2l1、bir5表達(dá)明顯上調(diào)；而抑癌基因kai1、kiss1、serpinb5，促凋亡相關(guān)基因tnfrsf25、tnfrsf1a、tnfrsf6和抑制侵襲相關(guān)基因serpinb2表達(dá)明顯下降。說明e內(nèi)膜細(xì)胞黏附侵襲、增殖才能增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡相對減少，從而容易在腹腔內(nèi)種植、生長。另一方面，異位

14、內(nèi)膜組織細(xì)胞定居于腹腔后，在腹腔液浸潤的特殊微環(huán)境中，細(xì)胞形態(tài)也必定會(huì)有相應(yīng)的改變，基因也將出現(xiàn)有別于在位內(nèi)膜組織細(xì)胞的選擇性表達(dá)，合成和分泌一些特異蛋白11,12，對e病情的開展起著決定性的作用。我們的研究證實(shí)了此點(diǎn)，e異位基質(zhì)細(xì)胞的體積比正常對照細(xì)胞、e在位基質(zhì)細(xì)胞小，異染色質(zhì)增多，核增大，并且其胞膜外表有較多的微絨毛和胞漿突起，細(xì)胞胞漿內(nèi)存在不規(guī)那么線粒體10。這些形態(tài)學(xué)的改變與癌細(xì)胞根本相似，可能與e的惡性行為有關(guān)。e異位內(nèi)膜組織與e在位內(nèi)膜組織比較，基因表達(dá)亦有明顯不同，癌基因erbb2、ets2、fs，抑制凋亡基因bl2l1，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶dk4、d25a，生長因子及其受體hgf、fgfr2、tgfbr1基因表達(dá)均明顯增強(qiáng)；抑癌基因kai1、serpinb5，促凋亡基因bad、tnf，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子dkn2a基因顯著下調(diào)。根據(jù)植物雌激素作用特點(diǎn)，葛根素作為一個(gè)植物雌激素應(yīng)是治療e的有效藥物。我們的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)說明小劑量的葛根素