食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定 標準文本 （食品安全國家標準）

1、GB/T 2014 PAGE 3 PAGE 1食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定1 范圍本標準規(guī)定了食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2（以下簡稱AFT B1、AFT B2、AFT G1和AFT G2）的測定方法。本標準第一法為同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質譜法，適用于谷物及其制品、豆類及其制品、堅果及籽類、油脂及其制品、調味品和特殊膳食用食品中AFT B1、AFT B2、AFT G1和AFT G2的測定。本標準第二法為高效液相色譜法，適用于谷物及其制品、豆類及其制品、堅果及籽類、油脂及其制品、調味品和特殊膳食用食品中AFT B1、AFT B2、AFT G1和AFT G2的測定。

2、本標準第三法為薄層色譜法，適用于谷物及其制品、豆類及其制品、堅果及籽類、油脂及其制品、調味品和特殊膳食用食品中AFT B1的測定。第一法 同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質譜法2 原理試樣中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液的混合溶液提取，提取液用含1 %Triton X -100（或吐溫-20）的PBS溶液稀釋后，經免疫親和柱凈化，去除脂肪、蛋白質、色素及碳水化合物等干擾物質。凈化液經液相色譜分離，串聯(lián)質譜檢測，同位素內標法定量。3 試劑和材料注：除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。3.1 試劑3.1.1 乙腈（CH3CN）：色譜

3、純。3.1.2 甲醇（CH3OH）：色譜純。3.1.3 醋酸銨（CH3COONH4）。3.1.4 氯化鈉（NaCl）。3.1.5 磷酸氫二鈉（Na2HPO4）。3.1.6 磷酸二氫鉀（KH2PO4）。3.1.7 氯化鉀（KCl）。3.1.8 濃鹽酸（HCl）。3.1.9 Triton X - 100（C14H22O（C2H4O）n）（或吐溫-20，C58H114O26）。3.2 試劑配制3.2.1 5 mmol/L醋酸銨水溶液：稱取0.39 g醋酸銨固體，用水溶解后稀釋至1000 mL。3.2.2 乙腈-水溶液（84+16）：取840 mL乙腈加入160 mL水。3.2.3 甲醇-水溶液（70

4、+30）：取700mL甲醇加入300mL水。3.2.4 乙腈-水溶液（50+50）：取500 mL乙腈加入500 mL水。3.2.5 乙腈-甲醇溶液（50+50）：取500 mL乙腈加入500 mL甲醇。3.2.6 10 %鹽酸溶液：取濃鹽酸1mL，用純水稀釋至10 mL。3.2.7 磷酸鹽緩沖溶液（以下簡稱PBS）：稱取8.00 g氯化鈉，1.20 g磷酸氫二鈉（或2.92 g十二水磷酸氫二鈉），0.20 g磷酸二氫鉀，0.20 g氯化鉀，用900 mL水溶解，用鹽酸調節(jié)pH值至7.4，加水稀釋至1000 mL。3.2.8 1 % Triton X 100（或吐溫-20）的PBS：取10 m

5、L Triton X- 100（或吐溫-20），用PBS稀釋至1000 mL。3.3 標準品3.3.1 AFT B1標準品（C17H12O6 ，CAS：1162-65-8）：純度98 %。3.3.2 AFT B2標準品（C17H14O6 ，CAS：7220-81-7）：純度98 %。3.3.3 AFT G1標準品（C17H12O7 ，CAS：1165-39-5）：純度98 %。3.3.4 AFT G2標準品（C17H14O7 ，CAS：7241-98-7）：純度98 %。3.3.5 同位素內標13C17-AFT B1（C17H12O6 ，CAS：1217449-45-0）：純度98 %。3.3

6、.6 同位素內標13C17-AFT B2（C17H14O6 ，CAS：1217470-98-8）：純度98 %。3.3.7 同位素內標13C17-AFT G1（C17H12O7 ，CAS：1217444-07-9）：純度98 %。3.3.8 同位素內標13C17-AFT G2：（C17H14O7 ，CAS：1217462-49-7）：純度98 %。注：在檢測中可以只使用13C17-AFT B1一種同位素內標，但需要對被測定試樣基質進行加標實驗，評估和確定13C17-AFT B1與其他幾種被測黃曲霉毒素在同一基質中的離子化效率。3.4 標準溶液配制3.4.1 標準儲備溶液（10 g/mL）：分別

7、稱取AFT B1、AFT B2、AFT G1和AFT G2 1 mg（精確至0.01 mg），用乙腈溶解并定容至100 mL。此溶液濃度約為10 g/mL。溶液轉移至試劑瓶中后，在-20下避光保存，備用。臨用前進行濃度校準（校準方法參見附錄A.1）。3.4.2 混合標準儲備溶液（1.0 g/mL）：分別準確吸取10 g/mLAFT B1、AFT B2、AFT G1和AFT G2標準儲備液各1.00mL于同一10 mL容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，得到1.0 g/mL的混合標準液。此溶液密封后避光-20 保存，三個月有效。3.4.3 混合標準工作液（100 ng/mL）：準確移取混合標準儲備溶液（

8、1.0 g/mL）1.00mL至10 mL容量瓶中，乙腈定容。此溶液密封后避光-20 下保存，三個月有效。3.4.4 混合同位素內標工作液（100 ng/mL）：準確移取0.5 g/mL 13C17- AFT B1、13C17- AFT B2、13C17- AFT G1和13C17- AFT G2各2.00 mL，用乙腈定容至10 mL。在-20 下避光保存，備用。3.4.5 標準系列工作溶液：準確移取混合標準工作液（3.3.11）10 L、50 L、100 L、200 L、500 L、800 L、1000 L至10 mL容量瓶中，加入20 L 100 ng/mL的同位素內標工作液（3.3.1

9、2），用初始流動相定容至刻度，配制濃度點為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 ng/mL的系列標準溶液。 4 儀器和設備4.1 勻漿機。4.2 高速粉碎機。4.3 組織搗碎機。4.4 超聲波震蕩器。4.5 天平：感量0.01 g和0.00001 g。4.6 渦旋混合器。4.7 高速均質器：轉速6，500-24，000 轉/min。4.8 離心機：轉速6000 轉/min。4.9 真空泵。4.10 氮吹儀。4.11 液相色譜-串聯(lián)質譜儀：帶電噴霧離子源。4.12 液相色譜柱： C18柱（柱長100 mm，柱內徑2.1 mm；填料粒徑1.7 m），或相當者。4.13 50 m

10、L具塞PVC離心管。4.14 移液管：1.0 mL，5.0 mL，20.0 mL。4.15 50 mL一次性注射器（使用注射器筒部分）。4.16 免疫親和柱：柱容量 300 ng，其中AFT G2的交叉反應率 80 %。（柱容量驗證方法參見附錄A.2）注：對于每個批次的親和柱在使用前需質量驗證。4.17 多功能柱或功能相當?shù)墓滔噍腿≈簩碗s基質樣品測定時使用。4.18 帶刻度的磨口玻璃試管：10 mL。4.19 微孔濾頭：帶0.22 m微孔濾膜。4.20 篩網：20目。5 分析步驟使用不同廠商的免疫親和柱，在樣品上樣、淋洗和洗脫的操作方面可能會略有不同，應該按照供應商所提供的操作說明書要求進

11、行操作。5.1 樣品制備5.1.1 液體樣品（植物油、醬油、醋等）采樣量需大于1 kg，對于袋裝、瓶裝等包裝樣品需至少采集3個包裝（同一批次或號），將所有液體樣品在一個容器中用勻漿機混勻后，任意抽取其中的100 g樣品進行檢測。5.1.2 固體樣品（谷物及其制品、堅果及籽類、嬰幼兒米粉等）采樣量需大于1 kg，用高速粉碎機將其粉碎，過篩，使其粒徑小于20目，混合均勻后縮分至100g，儲存于樣品瓶中，密封保存，供檢測用。5.1.3 半固體（腐乳、豆豉等）采樣量需大于1 kg，對于袋裝、瓶裝等包裝樣品需至少采集3個包裝（同一批次或號），用組織搗碎機搗碎混勻后，儲存于樣品瓶中，密封保存，供檢測用。5

12、.2 樣品提取5.2.1 液體樣品5.2.1.1 植物油脂在50 mL離心管中稱取5 g經混合均勻的試樣（精確至0.01 g），加入100 L同位素內標工作液（3.3.11）振蕩混合后靜置30min。加入20 mL乙腈-水溶液（3.3.2）或甲醇-水溶液提?。?.3.3），渦旋混勻，置于超聲波震蕩器中震蕩20分鐘，在6000 轉/min 下離心10分鐘，取上清液備用。5.2.1.2 醬油、醋在50 mL離心管中稱取5 g經混合均勻的試樣（精確至0.01 g），加入100 L同位素內標工作液振蕩混合后靜置30min。用乙腈或甲醇定容至25 mL（精確至0.1 mL），渦旋混勻，置于超聲波震蕩器中

13、震蕩20分鐘，在6000 轉/分下離心10分鐘，取上清液備用。5.2.2 固體樣品5.2.2.1 一般固體樣品在50 mL離心管中稱取5 g已磨細、過20目圓孔篩混勻的試樣（精確至0.01g），加入100 L同位素內標工作液振蕩混合后靜置30min。加入20.0 mL乙腈-水溶液（3.3.2）或甲醇-水溶液，渦旋混勻，用均質器均質3分鐘，置于超聲波震蕩器中震蕩20分鐘，在6000 轉/分下離心10分鐘，取上清液備用。5.2.2.2 嬰幼兒配方米粉 在50 mL離心管中稱取5 g已磨細、過20目圓孔篩混勻的試樣（精確至0.01g），加入100 L同位素內標工作液振蕩混合后靜置30min。加入20

14、.0 mL乙腈-水溶液（3.3.4）或甲醇-水溶液，渦旋混勻，置于超聲波震蕩器中震蕩20分鐘，在6000 轉/min 下離心10分鐘，取上清液備用。5.2.3 半固體樣品在50 mL離心管中稱取5 g經勻漿后的試樣（精確至0.01g），加入100 L同位素內標工作液振蕩混合后靜置30min。加入20.0mL乙腈-水溶液（3.3.2）或甲醇-水溶液，置于超聲波震蕩器中震蕩20分鐘，在6000 轉/分下離心10分鐘，取上清液備用。5.3 凈化5.3.1 免疫親和柱凈化5.3.1.1 上樣液的準備準確移取4 mL上清液，46 mL 1 %Trition X -100（或吐溫-20）的PBS（使用甲醇

15、-水溶液提取時可減半加入），混勻。5.3.1.2 免疫親和柱的準備將50 mL注射器筒與親和柱的頂部相連。5.3.1.3 試樣的凈化免疫親和柱內的液體放棄后，將上述樣液移至50 mL注射器筒中，調節(jié)下滴速度，控制樣液以1-3 mL/min的速度穩(wěn)定下滴。待樣液滴完后，往注射器筒內加入10 mL 水，以穩(wěn)定流速淋洗免疫親和柱。待水滴完后，用真空泵抽干親和柱。脫離真空系統(tǒng)，在親和柱下部放置10 mL刻度試管，取下50 mL的注射器筒，加入21 mL甲醇洗脫親和柱，控制1-3 mL/min的下滴速度，收集全部洗脫液至試管中，繼續(xù)用真空泵抽干親和柱。在50 下用氮氣緩緩地將洗脫液吹至近干，加入1.0

16、mL初始流動相，渦旋30 s溶解殘留物，0.22 m濾膜過濾，收集濾液于進樣瓶中以備進樣。注：全自動（在線）或半自動（離線）的固相萃取儀器可優(yōu)化操作參數(shù)后對批量樣品檢測使用.5.3.2 多功能柱和免疫親和柱同時使用（對花椒、胡椒和辣椒等復雜基質）5.3.2.1 多功能柱凈化移取8 mL上清液，按多功能柱操作說明進行凈化，收集全部凈化液。5.3.2.2 免疫親和柱凈化 用刻度移液管準確吸取上述凈化液4 mL，加入46 mL 1 %Trition X -100（或吐溫-20）的PBS（使用甲醇-水溶液提取時可減半加入），混勻。按5.3.1.2和5.3.1.3處理。5.4 液相色譜參考條件流動相：A

17、相：5mmol/L醋酸銨水溶液（3.3.1）；B相：乙腈-甲醇溶液（3.3.5）。梯度洗脫：32 % B（0-0.5 min），45 % B（3-4 min），100 % B（4.2-4.8 min），32 % B（5 min）。流 速：0.3 mL/min柱 溫：40 。進樣體積：10 L。5.5 質譜參考條件檢測方式：多離子反應監(jiān)測（MRM）。離子源控制條件：參見附錄A.3中的表A.3-1。離子選擇參數(shù)參見附錄A.3中的表A.3-2。子離子掃描圖參見附錄A.4中的圖A.4-1至圖A.4-8。液相色譜-質譜圖見附錄A.4中的圖A.4-9。5.6 定性試樣中目標化合物色譜峰的保留時間與相應標準

18、色譜峰的保留時間相比較，變化范圍應在2.5 之內。待測化合物的定性離子的重構離子色譜峰的信噪比應大于等于3（S/N 3），定量離子的重構離子色譜峰的信噪比應大于等于10（S/N 10）。每種化合物的質譜定性離子必須出現(xiàn)，至少應包括一個母離子和兩個子離子，而且同一檢測批次，對同一化合物，樣品中目標化合物的兩個子離子的相對豐度比與濃度相當?shù)臉藴嗜芤合啾龋湓试S偏差不超過表1規(guī)定的范圍。表1 定性時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度 50 % 20 %至50 % 10 %至20 % 10 %允許相對偏差 20 % 25 % 30 % 50 %各檢測目標化合物以保留時間和兩對離子的（特征離子對/定

19、量離子對）所對應的LC-MS/MS色譜峰面積相對豐度進行定性。要求被測試樣中目標化合物的保留時間與標準溶液中目標化合物的保留時間一致（一致的條件是偏差小于20 %），同時要求被測試樣中目標化合物的兩對離子對應LC-MS/MS色譜峰面積比與標準溶液中目標化合物的面積比一致。5.7 定量測定在5.4、5.5項液相色譜-三重四極桿質譜聯(lián)用分析條件下，將標準系列溶液（3.3.12）由低到高濃度進樣檢測，以AFT B1、AFT B2、AFT G1和AFT G2色譜峰與內標色譜峰的峰面積比值-濃度作圖，得到標準曲線回歸方程，其線性相關系數(shù)應大于0.99。取5.3項下處理得到的待測溶液進樣，內標法計算待測液

20、中目標物質的質量濃度，按6項計算樣品中待測物的含量。待測樣液中的響應值應在標準曲線線性范圍內，超過線性范圍則應適當減少取樣量重新測定。5.8 空白試驗不稱取試樣，按5.2和5.3的步驟做空白實驗。應確認不含有干擾待測組分的物質。6 結果計算 按式（1）計算AFT B1、AFT B2、AFT G1和AFT G2的殘留量。 （1）式中：X試樣中AFT B1、AFT B2、AFT G1或AFT G2的含量，單位為微克每千克，gkg-1；A根據(jù)試樣中AFT B1、AFT B2、AFT G1或AFT G2的色譜峰與對應內標色譜峰的峰面積關系，經計算所得的濃度，單位為納克每毫升，ngmL-1；V1試樣提取

21、液體積（植物油脂、固體、半固體按加入的提取液體積；醬油、醋按定容總體積），單位毫升，mL；V2用于過免疫親和柱的分取體積，單位毫升，mL；V3樣品洗脫液的最終定容體積，單位毫升，mL；m試樣的稱樣量，單位克，g；以重復性條件下獲得的兩次獨立測XX果的算術平均值表示。計算結果保留三位有效數(shù)字。7 精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測XX果的絕對差值不得超過算術平均值的15%。8 其他本方法的檢出限：AFT B1：0.03 g/kg、AFT B2：0.03 g/kg、AFT G1：0.03 g/kg、AFT G2：0.03 g/kg。本方法的定量限：AFT B1：0.1 g/kg、AFT B2：0

22、.1 g/kg、AFT G1：0.1 g/kg、AFT G2：0.1 g/kg。第二法 高效液相色譜法9 多功能柱凈化TFA柱前衍生法9.1 原理試樣中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液的混合溶液提取，提取液經多功能柱凈化去除脂肪、蛋白質、色素及碳水化合物等干擾物質，凈化液用三氟乙酸柱前衍生，液相色譜分離，熒光檢測器檢測，外標法定量。9.2 試劑和材料注：除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。9.2.1 試劑9.2.1.1 乙腈（CH3CN）：色譜純。9.2.1.2 甲醇（CH3OH）：色譜純。9.2.1.3 正己烷（C6H1

23、4）：色譜純。9.2.1.4 三氟乙酸（CF3COOH）。9.2.1.5 氮氣（N2）：純度 99.9 %。9.2.2 試劑配制9.2.2.1 乙腈-水溶液（84+16）：取840 mL乙腈加入160 mL水。9.2.2.2 甲醇-水溶液（70+30）：取700 mL甲醇加入300 mL水。9.2.2.3 乙腈-水溶液（50+50）：取500 mL乙腈加入500 mL水。9.2.2.4 乙腈-甲醇溶液（50+50）：取500 mL乙腈加入500 mL甲醇。9.2.3 標準品9.2.3.1 AFT B1標準品（C17H12O6 ，CAS：1162-65-8）：純度98 %。9.2.3.2 AFT

24、 B2標準品（C17H14O6 ，CAS：7220-81-7）：純度98 %。9.2.3.3 AFT G1標準品（C17H12O7 ，CAS：1165-39-5）：純度98 %。9.2.3.4 AFT G2標準品（C17H14O7 ，CAS：7241-98-7）：純度98 %。9.2.4 標準溶液配制9.2.4.1 標準儲備溶液（10 g/mL）：分別稱取AFT B1、AFT B2、AFT G1和AFT G2 1 mg（精確至0.01 mg），用乙腈溶解并定容至100 mL。此溶液濃度約為10 g/mL。溶液轉移至試劑瓶中后，在-20下避光保存，備用。臨用前進行濃度校準（校準方法參見附錄A.1

25、）。9.2.4.2 混合標準儲備溶液（1.0 g/mL）：分別準確吸取10 g/mLAFT B1、AFT B2、AFT G1和AFT G2標準儲備液各1.00mL于同一10 mL容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，得到1.0 g/mL的混合標準液。此溶液密封后避光-20 保存，三個月有效。9.2.4.3 混合標準工作液（AFT B1和AFT G1：100 ng/mL，AFT B2和AFT G2：30 ng/mL）：準確移取AFT B1和AFT G1標準儲備溶液各1 mL，AFT B2和AFT G2標準儲備溶液各300 L至10 mL容量瓶中，乙腈定容。密封后避光4 下保存，三個月內有效。9.2.4.4

26、 標準系列工作溶液：分別準確移取混合標準工作液（9.2.4.3）10 L、50 L、200 L、500 L、1000 L、2000 L、4000 L至10 mL容量瓶中，用初始流動相定容至刻度（含AFT B1和AFT G1濃度為0.1、0.5、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 ng/mL，AFT B2和AFT G2濃度為0.03、0.15、0.6、1.5、3.0、6.0、12 ng/mL的系列標準溶液）。9.3 儀器和設備9.3.1 勻漿機。9.3.2 高速粉碎機。9.3.3 組織搗碎機。9.3.4 超聲波震蕩器9.3.5 天平：感量0.01 g和0.00001 g。9.3.6 渦

27、旋混合器。9.3.7 高速均質器：轉速6，50024，000 轉/min。9.3.8 離心機：轉速 6000 轉/min。9.3.9 氮吹儀。9.3.10 液相色譜儀：配熒光檢測器。9.3.11 色譜分離柱：C18柱（柱長150 mm，柱內徑4.6 mm，填料粒徑5.0 m），或相當者。9.3.12 50 mL具塞PVC離心管。9.3.13 定量移液管：1.0，5.0 mL，20.0mL。9.3.14 多功能柱，或相當者。9.3.15 帶刻度的磨口玻璃試管：10 mL。9.3.16 一次性微孔濾頭：帶0.22 m微孔濾膜。9.3.17 篩網：20目。9.4 分析步驟9.4.1 樣品制備9.4.

28、1.1 液體樣品（植物油、醬油、醋等）采樣量需大于1 kg，對于袋裝、瓶裝等包裝樣品需至少采集3包裝（同一批次或號），將所有液體在一個容器中，用勻漿機（9.3.1）混勻后，取其中任意的100 g樣品進行檢測。9.4.1.2 固體樣品（谷物及其制品、堅果及籽類、嬰幼兒米粉等）采樣量需大于1 kg，用高速粉碎機（9.3.2）將其粉碎（粒徑小于20目），混合均勻后取樣品100 g用于檢測。9.4.1.3 半固體（腐乳、豆豉等）采樣量需大于1 kg，對于袋裝、瓶裝等包裝樣品需至少采集3包裝（同一批次或號），在搗碎機（9.3.3）中搗碎混勻后，取樣品100 g用于檢測。9.4.2 樣品提取9.4.2.1

29、 液體樣品9.4.2.1.1 植物油脂在50 mL離心管中稱取5 g經混合均勻的試樣（精確至0.01 g），加入20 mL乙腈-水溶液（9.2.2.1）或甲醇-水溶液提?。?.2.2.2），渦旋混勻，置于超聲波震蕩器中震蕩20分鐘，在6000 轉/min 下離心10分鐘，取上清液備用。9.4.2.1.2 醬油、醋在50 mL離心管中稱取5 g經混合均勻的試樣（精確至0.01 g），用乙腈（9.2.1.1）或甲醇（9.2.1.2）定容至25 mL（精確至0.1 mL），渦旋混勻，置于超聲波震蕩器中震蕩20分鐘，在6000 轉/分下離心10分鐘，取上清液備用。9.4.2.2 固體樣品9.4.2.2

30、.1 一般固體樣品在50 mL離心管中稱取5 g已磨細、過20目圓孔篩混勻的試樣（精確至0.01g），加入20.0 mL乙腈-水溶液（9.2.2.1）或甲醇-水溶液，渦旋混勻，用均質器均質3分鐘，置于超聲波震蕩器中震蕩20分鐘，在6000 轉/分下離心10分鐘，取上清液備用。9.4.2.2.2 嬰幼兒配方米粉 在50 mL離心管中稱取5 g已磨細、過20目圓孔篩混勻的試樣（精確至0.01g），加入20.0 mL乙腈-水溶液（9.2.2.3）或甲醇-水溶液，渦旋混勻，置于超聲波震蕩器中震蕩20分鐘，在6000 轉/min 下離心10分鐘，取上清液備用。9.4.2.2.3 半固體樣品在50 mL離

31、心管中稱取5 g經勻漿后的試樣（精確至0.01g），加入20.0mL乙腈-水溶液（9.2.2.1）或甲醇-水溶液，置于超聲波震蕩器中震蕩20分鐘，在6000 轉/分下離心10分鐘，取上清液備用。9.4.3 多功能柱凈化移取8 mL上清液，按多功能凈化柱操作說明進行凈化，收集全部凈化液。9.4.4 衍生用移液管準確吸取4 mL凈化液在50 下用氮氣緩緩地吹至近干，分別加入200 L正己烷和100 L三氟乙酸，渦旋30 s，在40 1 的恒溫箱中衍生15 min，衍生結束后，在50 下用氮氣緩緩地將凈化液吹至近干，用初始流動相定容至1.0 mL，渦旋30 s溶解殘留物，過0.22 m濾膜，收集濾液

32、于進樣瓶中以備進樣。9.4.5 色譜參考條件流動相：A相：水，B相：乙腈-甲醇溶液（9.2.2.4）。梯度洗脫條件：24 % B（06 min），35 % B（8.010.0 min），100 % B（10.211.2 min），24 % B（11.5 min）。流速：1.0 mL/min。色譜柱柱溫：40 。進樣量：50 L。熒光檢測器：激發(fā)波長360 nm；發(fā)射波長440 nm。液相色譜圖參見附錄B中的圖B-1。9.4.6 測定9.4.6.1 標準曲線繪制 系列標準工作溶液由低到高濃度依次進樣檢測，以峰面積為縱坐標-濃度為橫坐標作圖，得到標準曲線回歸方程。9.4.6.2 定量測定待測樣液中

33、待測化合物的響應值應在標準曲線線性范圍內，濃度超過線性范圍的樣品則應重新按9.4.2、9.4.3和9.4.4進行處理后再進樣分析。9.4.6.3 空白試驗不稱取試樣，按9.4.2、9.4.3和9.4.4的步驟做空白實驗。應確認不含有干擾待測組分的物質。9.5 計算結果按式（2）計算AFT B1、AFT B2、AFT G1和AFT G2的殘留量。 （2）式中：X試樣中AFT B1、AFT B2、AFT G1或AFT G2的含量，單位為微克每千克，gkg-1；A試樣中AFT B1、AFT B2、AFT G1或AFT G2的色譜峰的峰面積對應的濃度，單位為納克每毫升，ngmL-1；V1試樣提取液體積

34、（植物油脂、固體、半固體按加入的提取液體積；醬油、醋按定容總體積），單位毫升，mL；V2多功能柱后的取樣液體積，單位毫升，mL；V3樣品凈化液的最終定容體積，單位毫升，mL；m試樣的稱樣量，單位克，g；以重復性條件下獲得的兩次獨立測XX果的算術平均值表示。計算結果保留三位有效數(shù)字。10 免疫親和柱-柱后衍生法10.1 原理試樣中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液的混合溶液提取，提取液經免疫親和柱凈化凈化去除脂肪、蛋白質、色素及碳水化合物等干擾物質，凈化液經液相色譜分離，柱后衍生（碘或溴試劑衍生、光化學衍生、電化學衍生等），經熒光檢測器檢測，外標法定量。10.2 試

35、劑和材料注：除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。10.2.1 試劑10.2.1.1 乙腈（CH3CN）：色譜純。10.2.1.2 甲醇（CH3OH）：色譜純。10.2.1.3 氯化鈉（NaCl）。10.2.1.4 磷酸氫二鈉（Na2HPO4）。10.2.1.5 磷酸二氫鉀（KH2PO4）。10.2.1.6 氯化鉀（KCl）。10.2.1.7 濃鹽酸（HCl）。10.2.1.8 Triton X -100（C14H22O（C2H4O）n）（或吐溫-20，C58H114O26）。10.2.1.9 碘（I2）。10.2.1.10 三溴化吡啶（C5H6Br3N2

36、）。10.2.1.11 溴化鉀（KBr）。10.2.1.12 濃硝酸（HNO3）。10.2.1.13 氮氣：純度 99.9 %。10.2.2. 試劑配制10.2.2.1 乙腈-水溶液（84+16）：取840 mL乙腈加入160 mL水。10.2.2.2 甲醇-水溶液（70+30）：取700 mL甲醇加入300 mL水10.2.2.3 乙腈-水溶液（50+50）：取500 mL乙腈加入500 mL水。10.2.2.4 乙腈-水溶液（10+90）：取100 mL乙腈加入900 mL水。10.2.2.5 乙腈-甲醇溶液（50+50）：取500 mL乙腈加入500 mL甲醇。10.2.2.6 磷酸鹽緩

37、沖溶液（以下簡稱PBS）：稱取8.00 g氯化鈉，1.20 g磷酸氫二鈉（或2.92 g十二水磷酸氫二鈉），0.20 g磷酸二氫鉀，0.20 g氯化鉀，用900 mL水溶解，用鹽酸調節(jié)pH值至7.4，用水定容至1000 mL。10.2.2.7 1 %Triton X -100（或吐溫-20）的PBS：取10 mLTriton X -100，用PBS定容至1000 mL。10.2.2.8 0.05 %碘溶液：稱取0.1g碘，用20 mL甲醇溶解，加水定容至200mL，用0.45 m的濾膜過濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。（碘柱后衍生法使用）。10.2.2.9 5 mg/L三溴化吡啶水溶液：稱取5 mg三溴化吡啶溶

38、于1 L水中，用0.45 m的濾膜過濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。（溴柱后衍生法使用）。10.2.3 標準品10.2.3.1 AFT B1標準品（C17H12O6 ，CAS：1162-65-8 ）：純度98 %。10.2.3.2 AFT B2標準品（C17H14O6 ，CAS：7220-81-7 ）：純度98 %。10.2.3.3 AFT G1標準品（C17H12O7 ，CAS：1165-39-5 ）：純度98 %。10.2.3.4 AFT G2標準品C17H14O7 ，CAS：7241-98-7 ）：純度98 %。10.2.4 標準溶液配制10.2.4.1 標準儲備溶液（10 g/mL）：分別稱取AFT B

39、1、AFT B2、AFT G1和AFT G2 1 mg（精確至0.01 mg），用乙腈溶解并定容至100 mL。此溶液濃度約為10 g/mL。溶液轉移至試劑瓶中后，在-20下避光保存，備用。臨用前進行濃度校準（校準方法參見附錄A.1）。10.2.4.2 混合標準儲備溶液（1.0 g/mL）：分別準確吸取10 g/mLAFT B1、AFT B2、AFT G1和AFT G2標準儲備液各1.00mL于同一10 mL容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，得到1.0 g/mL的混合標準液。此溶液密封后避光-20 保存，三個月有效。10.2.4.3 混合標準工作液（AFT B1和AFT G1：100 ng/mL，A

40、FT B2和AFT G2：30 ng/mL）：準確移取AFT B1和AFT G1標準儲備溶液各1 mL，AFT B2和AFT G2標準儲備溶液各300 L至10 mL容量瓶中，乙腈定容。密封后避光4 下保存，三個月內有效。10.2.4.4 標準系列工作溶液：分別準確移取混合標準工作液（10.2.4.3）10 L、50 L、200 L、500 L、1000 L、2000 L、4000 L至10 mL容量瓶中，用初始流動相定容至刻度（含AFT B1和AFT G1濃度為0.1、0.5、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 ng/mL，AFT B2和AFT G2濃度為0.03、0.15、0.6

41、、1.5、3.0、6.0、12 ng/mL的系列標準溶液）。10.3 儀器和設備10.3.1 勻漿機。10.3.2 高速粉碎機。10.3.3 組織搗碎機。10.3.4 超聲波震蕩器10.3.5 天平：感量0.01 g和0.00001 g。10.3.6 渦旋混合器。10.3.7 高速均質器：轉速6，500-24，000 轉/min。10.3.8 離心機：轉速6000 轉/min。10.3.9 真空泵。10.3.10 氮吹儀。10.3.11 液相色譜儀：配熒光檢測器（帶一般體積流動池或者大體積流通池）。注：當帶大體積流通池時不需要再使用任何型號或任何方式的柱后衍生器。10.3.12 液相色譜柱：C

42、18柱（柱長150 mm，柱內徑4.6 mm；填料粒徑5 m），或相當者。（柱后衍生方法使用）C18柱（柱長100 mm，柱內徑2.1 mm；填料粒徑1.7 m），或相當者。（大流通池檢測使用）10.3.13 光化學柱后衍生器。10.3.14 溶劑柱后衍生裝置。10.3.15 電化學柱后衍生器。10.3.16 50 mL具塞PVC離心管。10.3.17 移液管：1.0 mL，5.0 mL，20.0 mL。10.3.18 50 mL一次性注射器（使用注射器筒部分）。10.3.19 免疫親和柱：柱容量 300 ng，其中AFT G2的交叉反應率 80 %。（柱容量驗證方法參見附錄A.2）注：對于每

43、個批次的親和柱使用前需質量驗證。10.3.20 多功能柱或功能相當?shù)墓滔噍腿≈簩碗s基質樣品測定時使用。10.3.21 一次性微孔濾頭：帶0.22 m微孔濾膜。10.3.22 篩網：20目。10.3.23 帶刻度的磨口玻璃試管：10 mL。10.4 分析步驟使用不同廠商的免疫親和柱，在樣品的上樣、淋洗和洗脫的操作方面可能略有不同，應該按照供應商所提供的操作說明書要求進行操作。10.4.1 樣品制備同9.4.1 10.4.2 樣品提取同9.4.2 10.4.3 凈化10.4.3.1 上樣液的準備準確移取4 mL上述上清液，加入46 mL 1 %Triton X -100（或吐溫-20）的PBS

44、（10.2.2.7）（使用甲醇-水溶液提取時可減半加入），混勻。10.4.3.2 免疫親和柱的準備將50 mL注射器筒與親和柱的頂部相連。10.4.3.3 試樣的凈化免疫親和柱內的液體放棄后，將上述樣液移至50 mL注射器筒中，調節(jié)下滴速度，控制樣液以1-3 mL/min的速度穩(wěn)定下滴。待樣液滴完后，往注射器筒內加入10 mL水，以穩(wěn)定流速淋洗免疫親和柱。待水滴完后，用真空泵抽干親和柱。脫離真空系統(tǒng)，在親和柱下部放置10 mL刻度試管，取下50 mL的注射器筒，21 mL甲醇洗脫親和柱，控制1-3 mL/min的下滴速度，收集全部洗脫液至刻度試管中，繼續(xù)用真空泵抽干親和柱。在50 下用氮氣緩緩

45、地將洗脫液吹至近干，用初始流動相定容至1.0 mL，渦旋30 s溶解殘留物，0.22 m濾膜過濾，收集濾液于進樣瓶中以備進樣。注：全自動（在線）或半自動（離線）的固相萃取儀器可優(yōu)化操作參數(shù)后使用.10.4.3.4 多功能柱和免疫親和柱同時使用（對花椒、胡椒和辣椒等復雜基質）10.4.3.4.1 多功能柱凈化移取8 mL上清液，按多功能柱操作說明進行凈化，收集全部凈化液。10.4.3.4.2 免疫親和柱凈化 用刻度移液管準確吸取上部凈化液4 mL，加入46 mL 1% Triton X -100（或吐溫-20）的PBS（使用甲醇-水溶液提取時可減半加入），混勻。按10.4.3.2和10.4.3.

46、3處理。10.4.4 液相色譜條件10.4.4.1 無衍生器法（大流通池直接檢測）流動相：A相：水，B相：乙腈-甲醇（10.2.2.5）。 等梯度洗脫條件：A：65 %，B：35 %。流 速：0.3 mL/min。柱 溫：40 。進樣量：10 L。激發(fā)波長：365 nm，發(fā)射波長：436 nm（AFT B1、AFT B2），463nm（AFT G1、AFT G2）。液相色譜圖見附錄B中的圖B-2。10.4.4.2 柱后光化學衍生法流動相：A相：水，B相：乙腈-甲醇。等梯度洗脫條件：A：68 %，B：32 %。流 速：1.0 mL/min。柱 溫：40 。進樣量：50 L。光化學柱后衍生器。激發(fā)

47、波長：360 nm；發(fā)射波長：440 nm。液相色譜圖見附錄B中的圖B-3。10.4.4.3 柱后碘或溴試劑衍生法10.4.4.3.1 柱后碘衍生法流動相：A相：水，B相：乙腈-甲醇。等梯度洗脫條件：A：68 %，B：32 %。流 速：1.0 mL/min。柱 溫：40 。進樣量：50 L。柱后衍生化系統(tǒng)。衍生溶液：0.05 %碘溶液（10.2.2.8）。衍生溶液流速：0.2 mL/min。衍生反應管溫度：70 。激發(fā)波長：360 nm；發(fā)射波長：440 nm。液相色譜圖見附錄B中的圖B-4。10.4.4.3.2 柱后溴衍生法流動相：A相：水，B相：乙腈-甲醇。等梯度洗脫條件：A：68 %，B

48、：32 %。流速：1.0 mL/min。色譜柱柱溫：40 。進樣量：50 L。柱后衍生系統(tǒng)。衍生溶液：5 mg/L三溴化吡啶水溶液（10.2.2.9）。衍生溶液流速：0.2 mL/min。衍生反應管溫度：70 。激發(fā)波長：360 nm；發(fā)射波長：440 nm。液相色譜圖見附錄B中的圖B-5。10.4.4.4 柱后電化學衍生法流動相：A相：水（1L水中含119 mg 溴化鉀，350 L 4mol/L硝酸）；B相：甲醇柱 溫：40 。流 速：1.0 mL/min。進樣量：50 L。電化學柱后衍生器。激發(fā)波長：360 nm；發(fā)射波長：440 nm。液相色譜圖見附錄B中的圖B-6。10.4.5 測定1

49、0.4.5.1 標準曲線繪制將標準系列溶液（10.2.4.4）由低到高濃度依次進樣檢測，以峰面積-濃度作圖，得到標準曲線回歸方程。10.4.5.2 定量測定待測樣液中的目標化合物響應值應在標準曲線線性范圍內，若有含量濃度超過線性范圍的待測樣品則應重新按10.4.2和10.4.3進行處理后進樣分析。10.4.5.3 空白試驗不稱取試樣，按10.4.2和10.4.3的步驟做空白實驗。應確認不含有干擾待測組分的物質。10.5 分析結果的表述按式（3）計算AFT B1、AFT B2、AFT G1和AFT G2的殘留量。 （3）式中：X試樣中AFT B1、AFT B2、AFT G1或AFT G2 的含量

50、，單位為微克每千克，gkg-1；A試樣中AFT B1、AFT B2、AFT G1或AFT G2的色譜峰的峰面積相對應的濃度，單位為納克每毫升，ngmL-1；V1試樣提取液體積（植物油脂、固體、半固體按加入的提取液體積；醬油、醋按定容總體積），單位毫升，mL； V2用于免疫親和柱凈化的上清液體積，單位毫升，mL；V3樣品洗脫液的最終定容體積，單位毫升，mL；m試樣的稱樣量，單位克，g；以重復性條件下獲得的兩次獨立測XX果的算術平均值表示。計算結果保留三位有效數(shù)字。11 其他本方法的定量限：柱后光化學衍生法、柱后溴衍生法、柱后碘衍生法、柱后電化學衍生法檢出限為AFT B1：0.03 g/kg、AF

51、T B2：0.01 g/kg、AFT G1：0.03 g/kg、AFT G2：0.01 g/kg，定量限為AFT B1：0.1 g/kg、AFT B2：0.03 g/kg、AFT G1：0.1 g/kg、AFT G2：0.03 g/kg； 無衍生器法檢出限為：AFT B1：0.017 g/kg、AFT B2：0.003 g/kg、AFT G1：0.017 g/kg、AFT G2：0.003 g/kg；定量限為AFT B1：0.05 g/kg、AFT B2：0.01 g/kg、AFT G1：0.05 g/kg、AFT G2：0.01 g/kg。第三法 薄層色譜法11 范圍本標準規(guī)定了應用薄層色譜

52、法測定食品中AFT B1的測定方法。 本標準適用于GB2761-2011中規(guī)定的各類食品（谷物及其制品、豆類及其制品、堅果及籽類、油脂及其制品、調味品和特殊膳食用食品等）中AFT B1含量的測定。 12 原理樣品經提取、濃縮、薄層分離后，AFT B1在紫外光（波長365 nm）下產生藍紫色熒光，根據(jù)其在薄層上顯示熒光的最低檢出量來測定含量。13 試劑和材料 注：除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。13.1 試劑13.1.1 甲醇（CH3OH）。13.1.2 正己烷或石油醚（沸程30 -60 或60 -90 ）。 13.1.3 三氯甲烷（CHCl3）。13

53、.1.4 苯（C6H6）。13.1.5 乙腈（CH3CN）。13.1.6 無水乙醚（C2H6O）。13.1.7 丙酮（C3H6O）。以上試劑在試驗時先進行一次試劑空白試驗，如不干擾測定即可使用，否則需逐一進行重蒸。13.1.8 硅膠G：層析用。13.1.9 三氟乙酸（CF3COOH）。13.1.10 無水硫酸鈉（NaSO4）。13.1.11 氯化鈉（NaCl）。13.2 試劑配制13.2.1 苯-乙腈混合液：量取98 mL苯，加2 mL乙腈，混勻。 13.2.2 甲醇水溶液：55+45。取550 mL甲醇加入450 mL水。13.2.3 次氯酸鈉溶液（消毒用）：取100 g漂白粉，加入500

54、mL水，攪拌均勻.另將80 g工業(yè)用碳酸鈉 （Na2CO310H2O）溶于500 mL溫水中，再將兩液混合、攪拌，澄清后過濾。此濾液含次氯酸濃度約為25 g/L。若用漂粉精制備，則碳酸鈉的量可以加倍。所得溶液的濃度約為50 g/L。污染的玻璃儀器用10 g/L氯酸鈉溶液浸泡半天或用50 g/L次氯酸鈉溶液浸泡片刻后，即可達到去毒效果。13.3 標準品AFT B1標準品（C17H12O6 ，CAS：1162-65-8 ）：純度98 %。13.4 標準溶液配制13.4.1 黃曲霉霉素B1標準儲備溶液：準確稱取1 mg-1.2 mg AFT B1標準品，先加入2 mL乙腈溶解后，再用苯稀釋至100

55、mL，避光，置于4 冰箱保存，此溶液濃度約10 g/mL。 純度的測定：取5 L 10 g/mLAFT B1標準溶液，滴加于涂層厚度0.25 mm的硅膠G 薄層板上，用甲醇，三氯甲烷（4+96）與丙酮-三氯甲烷（8+92）展開劑展開，在紫外光燈下觀察熒光的產生，應符合以下條件： 在展開后，只有單一的熒光點，無其他雜質熒光點。 原點上沒有任何殘留的熒光物質。13.4.2 AFT B1標準工作液：準確吸取1 mL標準溶液（10 g/mL）于10 mL容量瓶中，加苯-乙腈混合被至刻度，混勻。此溶液每毫升相當于1.0 g AFT B1。吸取1.0 mL此稀釋液，置于5 mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀

56、釋至刻度，此溶液每毫升相當于0.2 g AFT B1。再吸取AFT Bl標準榕液（0.2 g/mL）l.0 mL置于5 mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀釋至刻度.此溶液每毫升相當于0.04 g AFT B1。14 儀器和設備14.1 10目圓孔篩。14.2 小型粉碎機。14.3 電動振蕩器。14.4 全玻璃濃縮器。14.5 玻璃板：5 cm20 cm。 14.6 薄層板涂布器。14.7 展開槽：長25 cm，寬6 cm，高4 cm。 14.8 紫外光燈：100 W125 W，帶365 nm濾光片。14.9 微量注射器或血色素吸管。15 分析步驟 整個操作需在暗室條件下進行。15.1 樣品提取

57、15.1.1 玉米、大米、小麥、面粉、薯干、豆類、花生、花生醬等15.1.1.1 甲法：稱取20.00 g粉碎過篩試試樣（面粉、花生醬不需粉碎），置于250 mL具塞錐形瓶中，加30 mL正己烷或石油醚和100 mL甲醇水溶液，在瓶塞上涂上一層水，蓋嚴防漏。振蕩30 min，靜置片 刻，以疊成折疊式的快速定性濾紙過濾于分液漏斗中，待下層甲醇水帶被分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞錐形瓶內。取20.00 mL甲醇水溶液（相當于4g試樣）置于另一125 mL分液漏斗中，加20 mL三氯甲烷，振搖2 min，靜置分層，如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象可滴加甲醇促使分層。放出三氯甲烷層，經盛有約10 g預先用三氯甲烷濕潤

58、的無水硫酸鈉的定量慢速濾紙過濾于50 mL蒸發(fā)皿中，再加5 mL三氯甲烷于分液漏斗中，重復振搖提取，三氯甲烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，最后用少量三氯甲烷洗過濾器，洗液并于蒸發(fā)皿中。將蒸發(fā)血放在通風柜于65 水浴上通風揮干，然后放在冰盒上冷卻2 min-3 min后，準確加入1 mL苯-乙腈混合液（或將三氯甲烷用濃縮蒸餾器減壓吹氣蒸干后，準確加入1 mL苯-乙臘混合液）。用帶橡皮頭的滴管的管尖將殘渣充分混合，若有苯的結晶析出，將蒸發(fā)皿從冰盒上取出，繼續(xù)溶解、混合，晶體即消失，再用此滴管吸取上清液轉移于2 mL具塞試管中。15.1.1.2 乙法（限于玉米、大米、小麥及其制品）：稱取20.00 g粉碎過篩

59、試樣于250 mL具塞錐形瓶中，用滴管滴如約6 mL水，使試樣濕潤，準確加入60 mL三氯甲烷，振蕩30 min，加12 g無水硫酸鈉，振搖后，靜置30 min，用疊成折疊式的快速定性濾紙過濾于100 mL具塞錐形瓶中。取12 mL濾液（相當4g試樣）于蒸發(fā)皿中，在65水浴鍋上通風揮干，準確加入1 mL苯-乙腈混合液，以下按15.1.1.1自用帶橡皮頭的滴管的管尖將殘渣充分混合起依法操作。15.1.2 花生油、香油、菜油等稱取4.00 g試樣置于小燒杯中，用20 mL正己烷或石油醚將試樣移于125 mL分液漏斗中。用20 mL甲醇水溶液分次洗燒杯，洗液一并移入分液漏斗中，振搖2 min，靜置分

60、層后，將下層甲醇水溶液移入第二個分液漏斗中，再用5 mL甲醇水溶液重復振搖提取一次，提取液一并移入第二個分液漏斗中，在第二個分液漏斗中加入20 mL三氯甲烷，以下按15.1.1.1自振搖2 min，靜置分層起依法操作。15.1.3 醬油、醋稱取10.00 g試樣于小燒杯中，為防止提取時乳化，加0.4 g氯化鈉，移入分液漏斗中，用15 mL三氯甲烷分次洗滌燒杯，挽液井人洗液并入分液漏斗中。以下按15.1.1.1自振搖2 min，靜置分層起依法操作，最后加入2.5 mL苯-乙腈混合液，此溶液每毫升相當于4 g試樣?；蚍Q取10.00 g試樣，置于分液漏斗中，再加12 mL甲醇（以醬油體積代替水，故甲