干擾設(shè)計(jì)方法

1、siRNA設(shè)計(jì)指南使用來(lái)實(shí)現(xiàn)基因沉默是在分子生物學(xué)方面進(jìn)展迅速的方法有幾種制備的方法比如化學(xué)合成體外轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體和表達(dá)盒不管用那種方法設(shè)計(jì)的第一步是選擇的目的位點(diǎn)下面選擇目的位點(diǎn)的指南是基于當(dāng)前文獻(xiàn)和在的科學(xué)家們的觀察經(jīng)驗(yàn)用這些指南設(shè)計(jì)出的所有干擾片段中其中大約有半數(shù)可以產(chǎn)生目的基因轉(zhuǎn)錄水平大于50的%下降.當(dāng)前已與在研究領(lǐng)域的領(lǐng)頭人一合伙已經(jīng)提出了一個(gè)具有專利權(quán)的設(shè)計(jì)運(yùn)算法則當(dāng)與按照下面的設(shè)計(jì)路線設(shè)計(jì)的相比可以產(chǎn)生更高的有效比例對(duì)于運(yùn)算法則的信息可以參看設(shè)計(jì)更好部分你可以從訂購(gòu)你提前設(shè)計(jì)好的，根據(jù)運(yùn)算法則用化學(xué)法合成的當(dāng)前對(duì)于在數(shù)據(jù)庫(kù)中的人類，小鼠和大鼠基因，超過(guò)的是可以設(shè)計(jì)出來(lái)的想得到更多

2、信息，可以參看提前設(shè)計(jì)的目錄頁(yè)而且，提供對(duì)許多重要的人類基因行之有效的沉默子這些被實(shí)際測(cè)試核實(shí)后，發(fā)現(xiàn)可以致使目的基因水平大于70的%下降.一總體的設(shè)計(jì)指導(dǎo)方針如果你喜歡自己設(shè)計(jì)，你可以根據(jù)下面的指導(dǎo)方針，在許多不同的生物體中選擇目的位點(diǎn)相應(yīng)的可以被化學(xué)合成，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，從載體中表達(dá)或者用擴(kuò)增在目的mRNA中找出以AA二核苷酸開(kāi)頭的21個(gè)核苷酸序列.從轉(zhuǎn)錄起始密碼子開(kāi)始，尋找二核苷酸序列將每個(gè)二核苷酸和它的3端的1個(gè)核苷酸序列記錄下來(lái)，作為可能的目的位點(diǎn).這種選擇目的位點(diǎn)的策略是基于的觀察報(bào)告.（1）3端有的二核苷酸是最有效的這也同用聚合酶轉(zhuǎn)錄發(fā)夾是相一致的，因?yàn)榫酆厦甘窃谟袀€(gè)聚合的位置

3、終止轉(zhuǎn)錄的，從而產(chǎn)生帶有短的聚合尾巴的分子.在的和隨后的出版物中，3端帶有其它末端二核苷酸的也可以有效的介導(dǎo)如果你愿意的話，你可以更改這種目的位點(diǎn)的選擇策略，使設(shè)計(jì)的帶有其它的末端二核苷酸，但有一點(diǎn)，我們推薦你盡量避免末端為殘基，因?yàn)檫@樣的話，就極有可能被酶在單鏈上殘基的位點(diǎn)將切斷.選擇2-4個(gè)目的序列.在的研究發(fā)現(xiàn)，一般超過(guò)半數(shù)的隨機(jī)設(shè)計(jì)的可以致使目的的轉(zhuǎn)錄水平至少降低，并且大約有四分之一的能使目的的轉(zhuǎn)錄水平下降根據(jù)下面的指導(dǎo)方針，從第一步中記錄的序列中選擇目的位點(diǎn)：的研究者們發(fā)現(xiàn)含量在3的比有更高含量的更具有活性.既然對(duì)于聚合酶來(lái)說(shuō)，個(gè)核苷酸聚合的位點(diǎn)是作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄的終止信號(hào)，所以在設(shè)計(jì)要

4、從聚合酶啟動(dòng)子處表達(dá)的時(shí)，要避免含有延伸超過(guò)個(gè)或的目的序列.既然的某些區(qū)域可能被調(diào)控蛋白質(zhì)高度組裝或結(jié)合,我們一般沿著基因序列，在不同的位置來(lái)選擇目的位點(diǎn)我們迄今為止，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在上的目的位點(diǎn)的位置與能力有任何相關(guān)性.比較可能的目的位點(diǎn)與合適的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（人類，小鼠，大鼠,等等）以及排除帶有超過(guò)16-個(gè)17鄰近堿基的目的序列與其他編碼序列的同源性的考慮，我們建議用軟件，這個(gè)可以在服務(wù)器上找到設(shè)計(jì)合適的控制.一個(gè)完整的實(shí)驗(yàn)應(yīng)該包含有許多控制來(lái)確保數(shù)據(jù)的正確性自然細(xì)胞生物學(xué)的編輯推薦了幾個(gè)控制.其中的兩個(gè)表述如下：一種是負(fù)控制的，它跟你設(shè)計(jì)的有著相同的核苷酸組成，但是與基因組序列缺少大的序列同源

5、性.要設(shè)計(jì)一種負(fù)控制的R先打亂特異性基因的的核苷酸序列，然后在基因組序列中進(jìn)行搜索來(lái)確保它缺少同任何其它基因的同源性.額外的針對(duì)相同的的序列也許進(jìn)行實(shí)驗(yàn)是確定數(shù)據(jù)有效的最好的方式，在某次用一種時(shí)，連同針對(duì)同一個(gè)基因的兩個(gè)或者更多的不同的一同使用在進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)之前，應(yīng)該測(cè)試每一個(gè)，確保它能在相當(dāng)高的水平上可以降低目的基因的表達(dá)二Ambion的siRNA目標(biāo)位置尋找程序使用我們的在線目標(biāo)位置尋找軟件來(lái)找出可能的序列，是基于上面的設(shè)計(jì)指南只用簡(jiǎn)單地把你的序列粘貼到窗口中，這個(gè)程序就會(huì)掃描你的序列來(lái)找出二核苷酸并且產(chǎn)生出一個(gè)報(bào)告，顯示二核苷酸的位置，個(gè)目的堿基,相應(yīng)的有義和反義寡核苷酸鏈然后目的可以被

6、直接提交到我們的特異設(shè)計(jì)工具中，或者通過(guò)點(diǎn)擊目的下感興趣的相應(yīng)鏈接，來(lái)進(jìn)行搜索.另一個(gè)可供選擇的是，位于（麻省理工學(xué)院）的生物醫(yī)學(xué)研究學(xué)院有一個(gè)公開(kāi)可用的設(shè)計(jì)工具，可以進(jìn)行額外參數(shù)選定，并且整合有人類和小鼠基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索參看：（需要注冊(cè)）三對(duì)于設(shè)計(jì)siRNA表達(dá)載體和siRNA表達(dá)盒編碼的siRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)的詳細(xì)指南最初報(bào)道的用表達(dá)載體來(lái)誘導(dǎo)的研究者們?cè)趯?duì)于編碼表達(dá)的插入序列有各不相同的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)絕大多數(shù)的設(shè)計(jì)中都含有被用一小段間隔序列分開(kāi)的兩段反向重復(fù)序列，并且以一系列的作為轉(zhuǎn)錄終止位置的來(lái)結(jié)束這些設(shè)計(jì)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄，被認(rèn)為會(huì)折疊成如圖一所示的一段短的呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的但諸如，目的序列的選擇，編碼推

7、定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)莖的反向重復(fù)序列的長(zhǎng)度，反向重復(fù)序列的前后次序，編碼發(fā)夾結(jié)構(gòu)環(huán)的間隔序列的長(zhǎng)度和組成，5突-出末端的存在和缺失，在不同的報(bào)道中都是有所差異的(3-11)圖一表達(dá)載體或者表達(dá)盒產(chǎn)生的典型發(fā)夾的示意圖及它同目的序列的關(guān)系四Ambion推薦的設(shè)計(jì)siRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)的程序下面的介紹的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)和克隆策略是基于的科學(xué)家們的研究結(jié)果.設(shè)計(jì)合適的插入序列的第一步是按照上面表述的總體的設(shè)計(jì)指導(dǎo)方針的步驟來(lái)選擇目的位點(diǎn)為了篩選，我們一般對(duì)每個(gè)目的基因測(cè)試四個(gè)序列，并且讓這幾個(gè)序列沿著基因序列間隔排布，目的是為了減少目地區(qū)域正好與調(diào)控蛋白質(zhì)組合或結(jié)合的機(jī)會(huì)因?yàn)閷?duì)每個(gè)目的基因都組裝并且檢測(cè)四個(gè)表達(dá)質(zhì)

8、粒是很費(fèi)時(shí)間的，我們發(fā)現(xiàn)用源于表達(dá)盒的產(chǎn)物法來(lái)篩選可能的序列是容易多了是指包含有啟動(dòng)子和終止子序列，并連接有發(fā)夾結(jié)構(gòu)模板的產(chǎn)物，可以被制備成的沉默子的表達(dá)工具這種篩選策略也可以對(duì)在實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的啟動(dòng)子和序列的最好結(jié)合進(jìn)行快速的鑒定被發(fā)現(xiàn)可以有效使得基因沉默的可以被很容易地被克隆進(jìn)一個(gè)載體,從而進(jìn)行長(zhǎng)期的研究的科學(xué)家們已經(jīng)確定那些作為轉(zhuǎn)染有很好功能的序列在作為中表達(dá)的時(shí)一樣有很好的功能唯一的差別是在中表達(dá)的序列不應(yīng)該含有一系列的四個(gè)或五個(gè)或，因?yàn)檫@些能作為聚合酶識(shí)別的終止位點(diǎn)對(duì)于傳統(tǒng)的克隆進(jìn)載體的方法，編碼選定的序列的兩條寡聚核苷酸鏈被設(shè)計(jì)插入到載體中(圖和圖)一般而言，寡聚核苷酸鏈?zhǔn)怯蓚€(gè)有義s序

9、列靠一段短的間隔子與它的顛倒的互補(bǔ)的反義序列相連構(gòu)成的科學(xué)傢們已經(jīng)成功使用了個(gè)核苷的間隔子，盡管其它的間隔子也能被設(shè)計(jì)5個(gè)被加到寡聚核苷酸的3端而且，為了克隆到ener載體中，o和限制性酶切位點(diǎn)被分別加入到寡聚核苷酸鏈的5和3末端（圖）與此相對(duì)的是，為了克隆進(jìn)ener3載體中，ao和3n限制性酶切位點(diǎn)被分別加入到寡聚核苷酸鏈的5和3末端（圖3）預(yù)期的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物將會(huì)向后折疊，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖由組成，環(huán)由個(gè)核苷酸組成，并且在3末端有2載3（體圖1）.圖對(duì)于載體ener的插入部分的設(shè)計(jì)這個(gè)插入部分對(duì)于ener載體是特異性的，并且包含有適當(dāng)?shù)?overhangs，為了能按一定方向克隆進(jìn)這個(gè)載體.環(huán)的序列

10、和長(zhǎng)度能按照希望的進(jìn)行改變.圖3對(duì)于載體ener和eher插入部分的設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)的插入序列對(duì)于ener和3表達(dá)載體是特異性的，并且包含有適當(dāng)?shù)?突出末端，是為了按方向克隆進(jìn)這些質(zhì)粒中對(duì)于在圖中顯示的ener載體，早期有跡象表明，在環(huán)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)中，有大量的區(qū)域都可用；這里我們提供了我們發(fā)現(xiàn)很好的一個(gè)環(huán)的序列為了克隆進(jìn)eneraeno載體，為此設(shè)計(jì)的帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸鏈與上面表述的克隆進(jìn)ene和3載體的結(jié)構(gòu)很相似盡管如此，對(duì)于基于的載體的寡聚核苷酸鏈的一個(gè)顯著的差別是它的3末端5個(gè)的缺失，因?yàn)閷?duì)于基于的載體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)是由聚合終止子提供的而且，為了克隆進(jìn)enceeno載體，ho和e限制性內(nèi)

11、切酶酶切位點(diǎn)被分別加入到寡聚核苷酸鏈的5和3末端（圖）盡管如此，為了克隆進(jìn)ener載體，包含有a和n限制性酶酶切位點(diǎn)的核苷被分別加到寡聚核苷酸鏈的5和3末端（圖5）圖對(duì)于eneraeno載體插入部分的設(shè)計(jì)插入部分的設(shè)計(jì)對(duì)于載體是特異性的，并且包含有合適的突出末端，為了可以按方向克隆進(jìn)這個(gè)載體.環(huán)的序列和長(zhǎng)度可以按需要進(jìn)行改變.圖對(duì)于載體插入部分的設(shè)計(jì)插入部分的設(shè)計(jì)對(duì)于載體是特異性的，并且包含有合適的突出末端，為了可以按方向克隆進(jìn)這個(gè)載體.環(huán)的序列和長(zhǎng)度可以按需要進(jìn)行改變.通過(guò)沉默子表達(dá)工具用方法制備包含有或者啟動(dòng)子的，（）一個(gè)或兩個(gè)編碼序列的寡聚核苷酸鏈被設(shè)計(jì)和訂購(gòu)，（）寡聚核苷酸鏈在一個(gè)或多

12、個(gè)中用做引物，中包含有含有啟動(dòng)子的來(lái)自于現(xiàn)成工具的模板，（）產(chǎn)物經(jīng)過(guò)柱層析純化盡管其它的環(huán)序列也可以被設(shè)計(jì)，但的科學(xué)家們一般用環(huán)結(jié)構(gòu)來(lái)進(jìn)行他們的對(duì)于載體插入部分的設(shè)計(jì)中，作為聚合酶終止子的一段個(gè)終止序列被加入為了隨后克隆的便利，和限制性酶切位點(diǎn)也加入引物序列中用沉默子表達(dá)工具來(lái)設(shè)計(jì)寡聚核苷酸鏈引物的詳細(xì)設(shè)計(jì)參數(shù)可以被在工具的操作工序說(shuō)明書(shū)中找到.為了將源于的功能性沉默子表達(dá)工具克隆進(jìn)載體，和目的載體都需要用和進(jìn)行酶切制備被稱作載體，即帶有新霉素，潮霉素，嘌呤霉素抗性基因的線性化的目的載體，是可行的.五siRNA目標(biāo)的選擇除了改進(jìn)的運(yùn)算法則和我們建議的程序，通過(guò)掃描序列中的二核苷酸并記錄下緊挨著

13、的個(gè)核苷酸，依此來(lái)作為的目標(biāo)位置外，其它兩種方法已經(jīng)被其它的研究者所采用在第一個(gè)方法中，目標(biāo)序列的選擇純粹是由經(jīng)驗(yàn)決定的（），只要目標(biāo)序列以開(kāi)頭，并且通過(guò)分析同其它基因沒(méi)有很大的序列同源性.在第二個(gè)報(bào)道中，又一個(gè)精心設(shè)計(jì)的方法被采用來(lái)選擇目標(biāo)序列這個(gè)程序采用了觀察方法，即在內(nèi)在的中，能被合成的寡脫氧核糖核苷酸酶降解的目標(biāo)位置，就是可以被利用的位置（）在這種方式中鑒定出的任何可利用的位點(diǎn)被用作在含有啟動(dòng)子的中結(jié)構(gòu)的插入序列相關(guān)信息.參看在設(shè)計(jì)運(yùn)算法則中的設(shè)計(jì)一個(gè)更好的的相關(guān)信息六在發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNAs中的有義鏈和反義鏈的次序一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)表達(dá)盒經(jīng)常被構(gòu)建成包含有目標(biāo)基因的有義鏈，緊跟著一小段間隔子

14、，然后是目標(biāo)基因的反義鏈的這樣一種次序.一組研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)顛倒在表達(dá)結(jié)構(gòu)中的有義鏈與無(wú)義鏈次序并沒(méi)有影響發(fā)夾結(jié)構(gòu)（）的基因沉默活性與此相反的是，另一組研究者發(fā)現(xiàn)在另一個(gè)表達(dá)盒中相似的次序顛倒則造成了發(fā)夾結(jié)構(gòu)（）在導(dǎo)致基因沉默活性方面的部分下降.對(duì)于究竟是什么原因致使出現(xiàn)這種差別還并不清楚.在當(dāng)前，仍然被認(rèn)為合理的表達(dá)盒的構(gòu)建次序依次為，有義鏈，短的間隔子，反義鏈七siRNA莖的長(zhǎng)度在用做表達(dá)盒莖結(jié)構(gòu)的核苷酸序列的長(zhǎng)度選擇上，有著不同程度的差異一些包括的研究組織用個(gè)核苷長(zhǎng)度的序列作為表達(dá)盒的莖結(jié)構(gòu)（）與此相對(duì)的是，其它的研究組織所用的莖長(zhǎng)度，從個(gè)核苷長(zhǎng)度（4-）5到25-個(gè)2核9苷長(zhǎng)度（1）1不

15、等.但發(fā)現(xiàn)這些有不同莖長(zhǎng)度的發(fā)夾在基因沉默研究中都有很好的功能八在發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA中連接有義鏈與反義鏈的環(huán)的長(zhǎng)度和序列不同的研究組織已經(jīng)成功報(bào)道了用帶有從個(gè)核苷環(huán)的發(fā)夾實(shí)現(xiàn)基因沉默的結(jié)果（4，6-，結(jié)構(gòu)所做的總結(jié)：91）1.下面是對(duì)被不同研究組織使用的環(huán)長(zhǎng)度和序列環(huán)長(zhǎng)度（核苷）特異環(huán)序列使用的科研組織數(shù)3AUG43CCC74UUCG55CCACC7CTCGAGAAGCUUTOC o 1-5 h z7CCACACC79UUCAAGAGA623沒(méi)有報(bào)道9九在發(fā)夾siRNAs中5突出末端的出現(xiàn)絕大多數(shù)研究組織在他們的發(fā)夾結(jié)構(gòu)中沒(méi)有加入5突出末端（-）盡管如此，一個(gè)研究組織在發(fā)夾結(jié)構(gòu)（）中加入了包含

16、有個(gè)核苷的5突出末端這些含有5突出末端的發(fā)夾在基因沉默中也是有功能的.十siRNA的化學(xué)合成合成顧客設(shè)計(jì)的和用運(yùn)算法則提前設(shè)計(jì)的為了訂購(gòu)用化學(xué)合成的，你已經(jīng)設(shè)計(jì)好的，你可以提供：序列上的個(gè)堿基（以二核苷酸開(kāi)始），依次來(lái)指導(dǎo)的合成.或者每個(gè)鏈的序列（如果你想讓你的具有除了或著的3末端，我們推薦你用這個(gè).）將根據(jù)你提供的序列，來(lái)合成寡聚核苷酸鏈互補(bǔ)序列默認(rèn)情況下，你只提供目標(biāo)序列的話，相應(yīng)的帶有3突出末端的將被合成如果你愿意的話，你可以選擇或者其它的突出末端我們的科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)帶有或者突出末端的在功能方面并沒(méi)有差異（注意：有義鏈3不必非得跟目標(biāo)基因互補(bǔ)）當(dāng)前，設(shè)計(jì)的，對(duì)于保存在上數(shù)據(jù)庫(kù)中的大于的全人類，小鼠和大鼠基因組序列，都是可用的.為了訂購(gòu)一個(gè)提前設(shè)計(jì)的,首先在我們的數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索你感興趣的基因，然后選擇你想要支付的設(shè)計(jì)