表面等離子體共振傳感器

1、表面等離子體共振傳感器程玉培1433591摘要:表面等離子體子共振(SPR)技術(shù)是一種簡單、直接的傳感技術(shù)。它通過測 量金屬表面附近折射率的變化，來研究物質(zhì)的性質(zhì)。表面等離子體子共振傳感器 已經(jīng)成為生物傳感器研究領(lǐng)域的熱點。關(guān)鍵詞表面等離子體子共振傳感器生物分子間相互作用前言生物化學(xué)是運用化學(xué)的理論和方法研究生命物質(zhì)的邊緣學(xué)科。其任務(wù)主要 是了解生物的化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)及生命過程中各種化學(xué)變化。化學(xué)的核心是化學(xué)鍵， 即分子間的相互作用，而要研究生命過程中的各種化學(xué)變化，歸根到底就是要研 究生物分子之間的相互作用。生物分子之間的相互作用是生命現(xiàn)象發(fā)生的基礎(chǔ)， 研究生物分子之間的相互作用可以闡明生物反

2、應(yīng)的機理，揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)。 近年來，研究生物分子之間相互作用的技術(shù)不斷出現(xiàn)，其中表面等離子體共振 (Surface Plasmon Resonance， SPR)在生物學(xué)以及相關(guān)領(lǐng)域的研究應(yīng)用取得了 很大進(jìn)展，SPR技術(shù)可以現(xiàn)場，實時地測定生物分子間的相互作用而無需標(biāo)記， 可以連續(xù)監(jiān)測吸附和解離過程，并可以進(jìn)行多種成分相互作用的研究。1表面等離子體共振傳感器概述1.1表面等離子體共振傳感器簡介表面等離子體子共振(surface plasmon resonance , SPR)是一種物理光 學(xué)現(xiàn)象。利用光在玻璃界面處發(fā)生全內(nèi)反射時的消失波，可以引發(fā)金屬表面的自 由電子產(chǎn)生表面等離子體子。在入

3、射角或波長為某一適當(dāng)值的條件下，表面等離 子體子與消失波的頻率和波數(shù)相等,二者將發(fā)生共振，入射光被吸收，使反射光 能量急劇下降，在反射光譜上出現(xiàn)共振峰(即反射強度最低值)。當(dāng)緊靠在金屬 薄膜表面的介質(zhì)折射率不同時，共振峰位置將不同。1.2表面等離子體共振傳感器研究背景及現(xiàn)狀表面等離了體共振效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)可以追溯到上世紀(jì)初。關(guān)于SPR效應(yīng)的最早記 載是源于1902年Wood發(fā)現(xiàn)光波通過光柵后，光頻譜出現(xiàn)小區(qū)域內(nèi)的能量損失現(xiàn) 象。1941年，F(xiàn)ano針對這一現(xiàn)象根據(jù)金屬和空氣界面上表面的電磁波理論和邊 界條件進(jìn)行了詳盡的解釋。1957年，當(dāng)高能電了通過金屬薄膜時，Ritchie發(fā)現(xiàn) 能量損耗不僅發(fā)生在

4、體積等離了體頻率處，在更低頻率處也發(fā)生了，于是認(rèn)為這 與金屬薄膜界面特性有關(guān)。1958年，Turbader為了觀察SPR現(xiàn)象，對金屬薄膜 采用光的全反射激勵的方法。1960年，Stern和Farrell首次提出了表面等離 了體波(Surface Plasmon Wave, SPW)的概念，并對這種諧振模式產(chǎn)生的條件 進(jìn)行研究。同年Raether又專門詳盡描述了 SPR共振效應(yīng)在不同表面上的激勵特 性。1968年，經(jīng)過多年的研究德國物理學(xué)者Otto認(rèn)為表面等離了體共振效應(yīng)的 實質(zhì)就是一種光學(xué)全反射的現(xiàn)象，既衰減全反射(ATR)，并據(jù)此設(shè)計了以棱鏡為 基體的Otto模型同時給出SPR激發(fā)條件。19

5、70年，另一位德國的物理學(xué)者 Kretschmann提出一種新的粗糙表面擾動理論，設(shè)計了一種新的Kretschmann模 型，與Otto模型相等價。該模型較之Otto模型具有加工更方便、準(zhǔn)確度更高的 優(yōu)勢，之后很多學(xué)者的改進(jìn)和應(yīng)用都在該模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。表面等離了體波 傳感器的生產(chǎn)與應(yīng)用能擁有如此廣闊的前景也是由于該模型的出現(xiàn)。20世紀(jì)70年代到80年代，隨著Kretschmann模型的廣泛和深入研究，它 的潛在價值逐漸發(fā)揮出來。棱鏡SPR傳感器作為一個基于此模型的新生產(chǎn)物，具 有靈敏性高、特異性好、免標(biāo)記的特點。1982年，Nylander和Lieberg首次將 棱鏡SPR傳感器作為化學(xué)傳

6、感器用于氣體的檢測。1983年，作為生物傳感器瑞 典學(xué)者Liedberg首次成功檢測了 IgG蛋白質(zhì)與其抗原的相互作用的反應(yīng)過程錯誤！ 未找到引用源。1987年，Cullen等人首先將光柵激發(fā)表面等離子體技術(shù)應(yīng)用于傳感。1990 年，瑞典的Biacore AB公司開發(fā)出第一款商用化SPR儀器。1993年，美國華盛 頓大學(xué)Jorgenson首先提出了在線傳輸式和終端反射式這兩種光纖SPR傳感器。 此后，SPR傳感器的研究和應(yīng)用開始全面展開，相關(guān)的文獻(xiàn)報道每年成倍地增長。 1995年關(guān)于SPR研究的文獻(xiàn)只有30多篇，1998年則增長到近300篇，1998至 2000年的二年時間里，應(yīng)用SPR技術(shù)發(fā)

7、表的文章已經(jīng)超過1500篇，直至目前為 止，利用該技術(shù)發(fā)表的文章已經(jīng)超過了 5000篇，可見SPR傳感器已經(jīng)成為目前 國際上光化學(xué)傳感器研究領(lǐng)域的前沿1。隨著SPR技術(shù)在不同領(lǐng)域應(yīng)用研究的開展，形成了一系列新的熱點方向。光 纖SPR傳感器具有結(jié)構(gòu)靈活、體積小、可集成、可遠(yuǎn)程在線實時監(jiān)測、易于實現(xiàn) 分布式傳感等優(yōu)點，在活體探測，野外環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域的應(yīng)用具有獨特的優(yōu)勢， 不斷有文獻(xiàn)報道各種新型的光纖SPR傳感器，如通過對光纖進(jìn)行拉錐、側(cè)面拋磨、 出射端幾何結(jié)構(gòu)改造和利用光纖光柵等手段制作而成的光纖SPR傳感器。利用金 屬光柵、納米金屬粒子陣列等金屬微納結(jié)構(gòu)局域表面等離子體共振產(chǎn)生的高場局 域性，可

8、以有效提高SPR傳感器的靈敏度、選擇性、空間分辨率、可集成性，成 為近年來探測傳感領(lǐng)域研究和應(yīng)用的又一個重要方向。通過將金屬微納結(jié)構(gòu)與傳 統(tǒng)SPR結(jié)構(gòu)結(jié)合起來，利用LSPs與SPs的相互作用，可以有效增強探測信號。 另外，將金屬微納結(jié)構(gòu)與光纖、平面波導(dǎo)技術(shù)相結(jié)合，易于實現(xiàn)集成化，可大大 擴展金屬微納結(jié)構(gòu)表面等離子體共振傳感器的應(yīng)用范圍?，F(xiàn)代生物技術(shù)的研究發(fā) 展，對發(fā)展高通量、多組分、實時快速檢測和分析的需求日益迫切。表面等離子 體共振成像技術(shù)（surface plasmon resonance imaging, SPRI）,不僅能有效提 高SPR傳感器的測量速度，還能更為直觀、實時地監(jiān)測分子相

9、互作用動力學(xué)過程， 是目前SPR傳感器研究的又一熱點。最新文獻(xiàn)還報道了利用金屬光柵結(jié)構(gòu)制作的 表面等離子體共振成像芯片進(jìn)行生物分子相互作用檢測的實驗。1.3表面等離子體共振傳感器的原理錯誤! 未找到引用源。1.3.1消逝波從菲涅爾定理（nin。1=n2sin0 2）可以看出，光從光密介質(zhì)入射到光疏介 質(zhì)時（nn）就會產(chǎn)生全反射現(xiàn)象。但從波動光學(xué)的角度來分析，全反射的光波 會透過光疏介質(zhì)約為光波波長的一個深度，再沿界面流動約半個波長再返回光密 介質(zhì)。光的總能量沒有發(fā)生改變。透入光疏介質(zhì)的光波稱為消逝波。消逝波在界 面的傳播如圖1-1所示。圖1-1消失波在界面的傳播1.3.2表面等離子體波當(dāng)金屬受

10、到電磁干擾時，金屬中的電子密度分布就會變得不均勻。設(shè)想在某 一區(qū)域電子密度低于平均密度，那么就會形成局部的正電荷過剩。這時由于庫侖 引力作用，會把近鄰的電子吸引到該區(qū)域，而被吸引的電子由于獲得附加的動量， 又會使該區(qū)域聚集過多的負(fù)電荷，然而，由于電子間的排斥作用，使電子再度離 開該區(qū)域，從而形成價電子相對于正電荷背景的起伏振蕩。由于庫侖力的長程作 用，這種局部的電子密度振蕩將形成整個電子系統(tǒng)的集體振蕩，并以密度起伏的 波的形式來表現(xiàn)。我們把當(dāng)金屬表面存在的自由振動的電子與入射光的光子相互 作用時，產(chǎn)生的沿著金屬表面?zhèn)鞑サ碾娮邮杳懿ǚQ為表面等離子體波。表面等離 子體波存在于兩種界面附近，在金屬和

11、介質(zhì)界面產(chǎn)生的表面等離子體波示意圖如 圖1-2所示。Surface plasmon waveMetal圖1-2表面等離子體波1.3.3表面等離子體共振傳感器表面等離子體共振是一種由光入射金屬表面引起的物理光電現(xiàn)象。光在兩相 界面處發(fā)生全內(nèi)反射時的消逝波，可以引發(fā)金屬表面的自由電子產(chǎn)生表面等離子 體。當(dāng)消失波和表面等離子體波發(fā)生共振時，全內(nèi)反射將被破壞，使反射光強度 出現(xiàn)最小值。由此原理所構(gòu)建的傳感器基本結(jié)構(gòu)如圖1-3所示。該傳感器包括一個鍍有薄金屬鍍層的的玻璃棱鏡，其中金屬層成為棱鏡和絕 緣體之間的界面。利用P偏振光在一定的角度范圍內(nèi)照射棱鏡，在棱鏡與金屬薄 膜（一般是金或銀）界面處將會發(fā)生全

12、內(nèi)反射。將一層薄膜（如生物膜）沉淀在 金屬層上，絕緣物質(zhì)的折射率會發(fā)生改變。折射率依賴于絕緣物質(zhì)和沉淀膜的厚 度和密度的大小。折射率發(fā)生變化將會引起響應(yīng)信號的變化。這就是SPR傳感器 對物質(zhì)結(jié)合檢測的基本原理。SPR的實驗方法一般為首先在傳感片表面固定一個反應(yīng)物，使其形成分子傳 感膜，然后，含待測物的樣品以恒定的流速通過傳感片，傳感片上分子間相互作 用的情況可由SPR信號的改變反映出來。SPR傳感器檢測原理如圖1-4所示。廢液 樣品| I |計算機| CCD圖1-4 SPR傳感器檢測原理應(yīng)用于SPR傳感器的傳感芯片有兩個基本特征：首先是傳感芯片玻璃表面覆 蓋有薄薄的金層，這是產(chǎn)生SPR信號所必

13、需的條件，是探測生物分子之間相互作 用的基礎(chǔ);另外一個特征是，在金層的上面又有一種覆層，這種覆層能夠連接配 體并為所要研究的分子相互作用提供適宜的環(huán)境。為方便起見通常我們把連接在 傳感芯片上的分子稱為配位體，把待測的分子稱為分析物。傳感芯片表面的金層 和其上的覆層是很穩(wěn)定的，它能夠耐受極端pH和許多中等濃度的有機試劑。一 旦配體被固定在傳感芯片上之后，傳感芯片對于各種試劑和條件的耐受程度就主 要取決于所連配體的性質(zhì)。1.4 SPR傳感器的技術(shù)特點 錯誤！未找到引用源?；赟PR技術(shù)研制而成的SPR傳感器，主要用于生物化學(xué)領(lǐng)域的研究，特別 是對生物分子相互作用動態(tài)實時過程的研究。在檢測過程中，先

14、將其中一個反應(yīng) 物（配體）固定于傳感芯片表面，含分析物的樣品溶液以恒定的速率通過傳感芯 片，在傳感芯片上的生物分子間相互作用導(dǎo)致SPR信號的改變，再通過計算機系 統(tǒng)對SPR信號進(jìn)行實時處理并將整個反應(yīng)過程顯示出來。與傳統(tǒng)的生化分析方法相比，SPR傳感器具有以下技術(shù)特點：（1）待測物不需純化。由于生物分子的相互作用具有很強的反應(yīng)特異性（或 稱專一性），當(dāng)待測溶液流經(jīng)傳感芯片表面時，只有能與傳感芯片表面的配體分 子相互配對的分子才被選擇性的結(jié)合，其它的分子則不被結(jié)合而隨著流動相離開 傳感區(qū)域。利用SPR傳感技術(shù)分析生物樣品，可直接將待測溶液注入流通池（或 稱反應(yīng)池），而不需要對待測溶液進(jìn)行預(yù)處理和

15、純化。許多生物樣品如血清、組 織培養(yǎng)液、細(xì)胞或細(xì)胞抽提液等均不需要預(yù)先作任何純化處理。（2）樣品無需標(biāo)記。在現(xiàn)有的各種生物組織分析方法中，大多數(shù)分析方法 需要對樣品進(jìn)行標(biāo)記。如酶聯(lián)免疫吸附試驗、放射免疫法、免疫熒光技術(shù)。這些 分析方法基本都是通過標(biāo)記物質(zhì)產(chǎn)生的信號系統(tǒng)變化來確定物質(zhì)的種類和數(shù)量。 標(biāo)記一般需要引入放射性兀素或熒光物質(zhì)，可能對生物分子活性有相當(dāng)?shù)挠绊懀?而且標(biāo)記手段通常比較復(fù)雜。SPR方法則不需要對樣品進(jìn)行標(biāo)記，可直接檢測樣 品生化指標(biāo)的變化。因為當(dāng)待測溶液流經(jīng)傳感層時，只要樣品分子與配體分子發(fā) 生了相互作用，就可以引起傳感層的折射率變化，導(dǎo)致SPR光譜發(fā)生變化，通過 對SPR光

16、譜進(jìn)行分析就可以獲得樣品分子與配體相互作用的情況，進(jìn)一步分析還 可獲取分子結(jié)合的強度和速度、解離的快慢、結(jié)合的位點以及樣品的濃度及質(zhì)量 等重要信息。（3）實時監(jiān)測反應(yīng)的動態(tài)過程:生物化學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的主要 研究目的地是獲取細(xì)胞內(nèi)兩個分子（特別是蛋白質(zhì)、核酸等分子）的相互作用情 況。由于細(xì)胞內(nèi)生物分子的相互作用是一個動態(tài)的、連續(xù)過程，而監(jiān)測與分析這 個動態(tài)過程是相當(dāng)困難的。傳統(tǒng)的分析方法只適合于靜態(tài)檢測，也就是對生物分 子相互作用反應(yīng)過程中平衡態(tài)進(jìn)行檢測，而不適合于反應(yīng)過程的實時動態(tài)監(jiān)測反 應(yīng)。SPR傳感技術(shù)則可以方便地實時動態(tài)監(jiān)測生物分子相互作用的情形。SPR傳 感技術(shù)響應(yīng)迅速，通

17、過計算機實時采集處理，可以同時獲取所需要的化學(xué)與生物 信息。（4）靈敏度高、背景干擾小。SPR傳感技術(shù)是通過衰減全內(nèi)反射所產(chǎn)生的 消逝波來激SPR，根據(jù)衰減全內(nèi)反射原理，消逝波的電場在界面處被放大，其電 場強度是入射光的2n/n倍（其中n為棱鏡折射率，n為介質(zhì)的折射率），因而0202提高了 SPR方法的靈敏度。由于消逝波的有效穿透深度只有200 nm左右，超過 消逝波有效深度的溶液不會干擾測定。（5）響應(yīng)速度快，檢測時間短。由于與計算機技術(shù)相結(jié)合，SPR傳感器可 以做到實到采集信號、實時處理數(shù)據(jù)，大大縮短了檢測時間，提高了檢測效率。 實踐證明，許多以前采用傳統(tǒng)技術(shù)需要數(shù)小時甚至數(shù)天的分析過程，

18、如果采用基 于SPR的生化分析技術(shù)在數(shù)分鐘內(nèi)就可以完成。1 SPR傳感器應(yīng)用由于SPR技術(shù)具有能實時監(jiān)測反應(yīng)動態(tài)過程、分析樣品不需要純化、生物樣品 無需標(biāo)記、靈敏度較高、無背景干擾等特點，在生物科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用中取得了長足 進(jìn)展，目前已成功地研制出各種類型的SPR免疫傳感器。在蛋白質(zhì)分子相互作 用分析、DNA雜交條件和配體受體相互作用分析、小分子藥物設(shè)計等方面人們也 做了大量工作SPR技術(shù)也可用于研究核酸間相互作用，實時追蹤核酸反應(yīng)全過 程，這是其它技術(shù)無法比擬的。2.1蛋白質(zhì)間相互作用基因組測序、生物信息學(xué)及分析儀器的迅猛發(fā)展開創(chuàng)了蛋白組學(xué)這一領(lǐng)域。 目前為止主要采用二維電泳來分離復(fù)雜的蛋白質(zhì)并

19、采用質(zhì)譜法鑒定蛋白質(zhì)。這些 研究獲得了豐富的數(shù)據(jù)，同時也給進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提出了許 多問題。要解決這些問題需要有能研究生物分子識別及相互作用的高特異性方 法。在過去的五年中，SPR-BIA 技術(shù)和 MALDI-TOS-MS（matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry）技術(shù)己成為公認(rèn) 的分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能特性的主要手段。Soulages等對蛋白激酶C和類脂化 合物的相互作用進(jìn)行了詳細(xì)的研究，通過分析大量的SPR光譜數(shù)據(jù)，得到類脂層 和蛋白質(zhì)通過兩步鍵合，形成了類脂-蛋白

20、質(zhì)的大分子化合物的反應(yīng)機理。Stoop錯誤!未找到引用源。利用SPR技術(shù)篩選和定蛋白質(zhì)結(jié)合功能決定簇的氨基酸位點，通過深 入研究血纖維蛋白溶酶原活性抑制劑PAI-I的突變體結(jié)構(gòu)功能區(qū)域，發(fā)現(xiàn)PAI-IE 的3個表面抗原決定簇是其不同生物活性的分子基礎(chǔ)。Salamon等人錯誤!未找到引用源。 對細(xì)胞色素C (Cyt C)的作用機理進(jìn)行了深入地研究，得到了 Cyt C與類脂膜鍵 合的等溫曲線，并計算得到了周圍類脂膜層的厚度、質(zhì)量等結(jié)構(gòu)參數(shù)信息。在用 SPR進(jìn)行蛋白質(zhì)的配體-受體相互作用的研究方面，人們做了大量的工作。Bartley等人完成一個快速鑒定、篩選未知受體和配體。在蛋白質(zhì)折迭機理的 研究方

21、面，Hartl等人錯誤!未找到引用源。用SPR技術(shù)也取得了極有價值的研究成果。在 造血細(xì)胞因子白細(xì)胞介素11(L-11)和其受體的分子識別模式研究中，Karin錯誤！ 未找到引用源。成功地應(yīng)用BIA技術(shù)證明L-11R的胞外區(qū)D3為介導(dǎo)配體結(jié)合活性的主要 功能區(qū)域，而胞外區(qū)D2則在激活配體信號傳導(dǎo)方面起重要作用，為正確理解 L-11/L-11R/gp130分子作用機制提供了必需的數(shù)據(jù)。DNA分子間的相互作用實時追蹤DNA反應(yīng)的全過程，包括基因裝配、DNA合成延伸、內(nèi)切酶對雙鏈 DNA的特異切割等。Nilsson”等將一個69bp的雙鏈DNA在傳感片上裝配，并在 69bp的DNA裝配并形成單鏈后進(jìn)

22、一步進(jìn)行引物主導(dǎo)的合成。Jordan等人用SPR 表征了金膜表面DNA的雜交吸附及DNA表面上鏈親和素的固定，用SPR監(jiān)測了在 金膜表面單鏈DNA和生物素標(biāo)記的寡核苷酸互補序列的雜交反應(yīng)，表面固定DNA 的絕對覆蓋量為3 X 1012分子/cm2。Okahata等人成功地研究了固定在SPR傳感 器表面的10-30個堿基的寡核苷酸與互補DNA雜交反應(yīng)的動力學(xué)，得到的結(jié)果與 石英晶微天平的結(jié)果一致。Corn等人也詳細(xì)報道了用SPR技術(shù)研究DNA雜交反 應(yīng)及測定DNA序列的結(jié)果。DNA與蛋白質(zhì)相互作用DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用，特別是反應(yīng)動力學(xué)的研究一直沒有簡便快捷 的方法。以前需要用同位素標(biāo)記，

23、并且無法測定動力學(xué)常數(shù)。若采用SPR技術(shù)， 將含乳糖操縱子的DNA片段偶聯(lián)于傳感片表面上，使不同濃度的抑制蛋白流經(jīng)傳 感片表面，從SPR譜就可以精確地計算出反應(yīng)的動力學(xué)常數(shù)和結(jié)合親和力10。 Babic等11利用BIAcore儀器研究大腸桿菌的DNA修復(fù)機理。在大腸桿菌中，大 約有10種不同的蛋白質(zhì)參與了修復(fù)過程。他們的研究表明，Muts蛋白在結(jié)合錯 配區(qū)以啟動修復(fù)時，與單鏈DNA結(jié)合松散，與同源雙鏈DNA結(jié)合與解離迅速。通 過比較Muts與8種可能的堿基錯配序列的相互作用，證明Muts與DNA的結(jié)合是 堿基特異性的，對G-G錯配的親和力最大。ETS1癌基因蛋白能和一些基因的DNA 調(diào)控區(qū)結(jié)合

24、，從而調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)12。以前的研究已確定能和ETS1結(jié)合的 DNA序列。利用BIAcore儀器，F(xiàn)isher博士等m揭示了 ETS1蛋白和偶聯(lián)在傳感 片上結(jié)合ETS1的DNA的結(jié)合，并用合成的含37個氨基酸的多肽K37N (從蛋白 質(zhì)序列363-400)，證明了 ETS1蛋白的結(jié)合區(qū)域。2.4抗體-抗原分子相互作用免疫反應(yīng)是抗體與相應(yīng)抗原之間一種選擇性的特異結(jié)合反應(yīng)。在抗體分子上 有其相應(yīng)抗原的特異結(jié)合部位，該部位是與抗原形狀相對應(yīng)的分子空間。由于這 種特異性結(jié)合，決定了免疫反應(yīng)是一種高靈敏度、高選擇性的反應(yīng)。通過SPR 技術(shù)進(jìn)行免疫分析，可以識別抗原的種類、測定抗原的濃度、獲得抗原-抗

25、體結(jié) 合的動力學(xué)常數(shù)?？乖?抗體親和力和結(jié)合過程中的動態(tài)參數(shù)不僅可研究結(jié)構(gòu)與 功能的關(guān)系，對選擇不同抗體用于不同用途，如治療、檢測、診斷等都具有非常 實用的價值。SPR技術(shù)用于化學(xué)、生物化學(xué)傳感器領(lǐng)域研究誕生的第一個傳感器就是免疫 傳感器。1983年，Liedberg錯誤!未找到引用源。等人將IgG抗體吸附在金膜上，從而發(fā) 現(xiàn)了一種靈敏、簡便地檢測IgG的方法。Vandernoot14等人用SPR法測定人抗 IgG，己獲得定量檢測下限低達(dá)2X 10-12mol的結(jié)果。Hutchinsons等人表征了部 分牛胚胎中的碳水化合物，結(jié)果表明，在1.4g的牛胚胎中，用SPR免疫傳感器 可鑒別N-低聚糖

26、和O-低聚糖Seversu6等人將凝膠顆粒加入到免疫反應(yīng)體系中， 從而增強測定抗原的靈敏度，此法稱為增強SPR阻滯測試(Enhanced Surface Plasmon Resonance Inhibition Test, ESPRIT。Indykw等利用生物傳感器分 析技術(shù)進(jìn)行非內(nèi)源性R-蛋白結(jié)合測試，自動檢測出牛奶、肉類、肝臟等一系列 食物中的維生素B12的含量。Rassooly18使用Biacore 3000生物傳感器快速檢 測出了食物中葡萄球菌腸毒素B(SEB)的濃度。Bergwerffw等使用SPR，利用抗 體的結(jié)合檢測大腸桿菌，檢測限為107cfu/ml，具有100%的特異性。Me

27、din20等 將SPR與免疫化學(xué)技術(shù)相結(jié)合檢測E.Coli O157:H7，采用夾心法增強響應(yīng)信號， 檢測限為106cfu/ml。SPR免疫傳感器還被成功地運用于性激素球蛋白21和梅毒 22的鑒別。Attridge等人將熒光標(biāo)記與SPR相結(jié)合，成功地制備了測定血清中人絨毛 膜促性腺素(hCG)含量的SPR熒光免疫傳感器。Ravanat等人研制出了一步檢測 血漿中S蛋白抗原的SPR免疫傳感器。Corr等人的工作集中在目前免疫學(xué)研究 的熱點一T細(xì)胞的抗原識別，文獻(xiàn)報道了采用動力學(xué)方法研究了免疫抗原AK和 抗體之間的相互作用機理，并提出了數(shù)學(xué)模型。2.5藥物篩選及鑒定SPR技術(shù)在藥物篩選，藥物分子靶

28、點鑒定及先導(dǎo)藥物化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化方面 有著廣泛的應(yīng)用。當(dāng)前發(fā)展中的藥物篩選生物傳感器的測試包括兩方面內(nèi)容，一 是從文庫中篩選與靶蛋白結(jié)合的化合物；二是進(jìn)行一般的吸收、分布、代謝和排 泄 (ADME )試驗。SPR傳感技術(shù)與常規(guī)的免疫分析技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸附分析 (ELISA)和放射免疫分析(RIA)相比，其優(yōu)越性不僅在于該方法不需要標(biāo)記，而且 測定是在實時條件下進(jìn)行的，可以監(jiān)測反應(yīng)的整個過程，并且可以使用未經(jīng)提純 的混合物進(jìn)行測定。篩選過程實際上就是測定是否有物質(zhì)分子可以與傳感表面上 的靶分子結(jié)合，因此選擇合適的靶分子和實驗條件對粗體混合物進(jìn)行分析，只要 觀察到傳感信號的增加，就證明在樣品中存

29、在目標(biāo)分子。結(jié)合其它的分離和鑒定 方法，可以對目標(biāo)物進(jìn)行性質(zhì)和結(jié)構(gòu)鑒定。這樣做的好處是可以免去對一些不含 有靶分子結(jié)合物的樣品的進(jìn)一步分離檢測，避免了繁瑣的分析工作。Myszka等將Fc的片段特異性抗體固定在傳感片表面，未經(jīng)提純的雜交瘤細(xì) 胞培養(yǎng)上清液加入其上，抗體就被捕獲到傳感片上。這種方法可以從未知濃度的 抗體培養(yǎng)液中純化和定量抗體。由于是通過Fc部分將抗體捕獲，抗原結(jié)合部位 具有較均一的朝向，并且具有相對獨立的結(jié)合性質(zhì)，避免了交聯(lián)反應(yīng)的影響。 Markgren等利用SPR生物傳感技術(shù)研究了 HIV-1蛋白酶抑制劑與蛋白酶結(jié)合的 動力學(xué)性質(zhì)與抑制劑結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。SPR技術(shù)也應(yīng)用到了抗癌膚

30、類藥物的研發(fā) 中，利用SPR技術(shù)可以動力分析顯示類肽與原癌基因人類表皮生長因子受體2 基因(HER2)的親和力結(jié)合強弱。2.6臨床診斷作為傳統(tǒng)的臨床監(jiān)控裝置的一種補充儀器，SPR光學(xué)生物傳感器發(fā)揮了越來 越大的作用。利用生物傳感器鑒定和評價潛在的疫苗組分，監(jiān)測和定量測定病人 血清中的生物藥劑和抗體滴度的可行性，跟蹤檢測動物模型，人類臨床試驗和多 種臺式應(yīng)用中的生物反應(yīng)物。Van Regenmortel利用生物傳感器鑒定和評價潛在 的疫苗組分。Ohlson等證明了運用生物傳感器監(jiān)測和定量測定病人血清中的生 物藥劑和抗體滴度的可行性，這項研究展示了生物傳感器獨特地適用于監(jiān)控微弱 的相互作用(10-

31、1000 mol/l)，而且能夠在無需膜表面再生的情況下連續(xù)地工 作。生物傳感器提供了一種在線讀取病人血清中的特異分析物水平的方法，也可 用來跟蹤檢測動物模型、人類臨床試驗和多種臺式應(yīng)用中的生物反應(yīng)物。2.7食物檢測與環(huán)境監(jiān)控食品、乳品工業(yè)和環(huán)境保護(hù)工程中的質(zhì)量控制、污染物檢測、濃度分析是生 物傳感器飛速擴大的應(yīng)用領(lǐng)域之一。例如，生物傳感器已經(jīng)用于測定食物中營養(yǎng)物和抗生素的水平，食品中的細(xì)菌和真菌污染量，以及空氣或水傳播的毒素，殺 蟲劑和除草劑Indyk等利用生物傳感器分析技術(shù)進(jìn)行非內(nèi)源性R蛋白結(jié)合測試， 自動檢測出牛奶、肉類、肝臟等一系列食物中的維生素B12的含量。Rasooly使 用Bia

32、core 3000生物傳感器快速檢測出了食物中葡萄球菌腸毒素B(SEB)的濃 度。生物傳感器的在線分析能力和高靈敏度、微量樣品需求的特點，使得這種儀 器成為食品及環(huán)境安全監(jiān)控的理想工具。大氣環(huán)境監(jiān)測中，SO2是酸雨酸霧形成 的主要原因，傳統(tǒng)的檢測方法很復(fù)雜，Marty等人將亞細(xì)胞類脂類固定在醋酸纖 維膜上，和氧電極制成安培型生物傳感器，可對酸雨和酸霧樣品溶液進(jìn)行檢測。2 SPR傳感器發(fā)展展望如今，SPR技術(shù)己被廣泛地用來分析生物分子如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，藥物-蛋白 質(zhì)，蛋白質(zhì)-核酸，核酸-核酸之間相互作用的反應(yīng)動力學(xué)，結(jié)合位點和反應(yīng)物濃 度等信息，所涉及的研究領(lǐng)域包括免疫識別，信號傳導(dǎo)，藥物篩選，

33、抗體定性以 及蛋白質(zhì)構(gòu)象變化等。SPR技術(shù)在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中應(yīng)用的范圍非常廣，在 研究基因工程載體與質(zhì)粒DNA之間的相互作用，以及評價載體效率，DNA序列特 異性抗體的性質(zhì)鑒定等方面發(fā)揮了重要作用。SPR技術(shù)與其他分析技術(shù)的聯(lián)合應(yīng) 用，必將加速分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，使我們對生命現(xiàn)象的了解更加深入。近幾十年來，發(fā)展生命科學(xué)的重要性已經(jīng)越來越引起全世界人們的重視。世 界大多數(shù)國家都將發(fā)展生命科學(xué)作為科技發(fā)展的優(yōu)先領(lǐng)域，而與分析儀器的研究 是與生命科學(xué)研究最為相關(guān)研究領(lǐng)域，因而也成為了人們研究的重點和熱點。生 命技術(shù)、食品和藥物分析，環(huán)境監(jiān)測等一些與人類生存發(fā)展密切相關(guān)的重要領(lǐng)域 都急需大量簡便

34、、快速、高靈敏度的檢測儀器。已獲得各類研究產(chǎn)物的具體信息。 由于SPR傳感技術(shù)所具備的一些特點，正好可以滿足大多數(shù)檢測的需要，可對蛋 白質(zhì)、核酸等生物大分子的組織、結(jié)構(gòu)和功能間的關(guān)系的研究提供大量有價值的 數(shù)據(jù)。因此，將SPR技術(shù)作為一種研究各類生物分子間或其他大分子間相互作用 的有利的分析系統(tǒng)，必將隨著生命科學(xué)的迅速發(fā)展而得到更多的發(fā)展空間和取得 更多的研究價值。參考文獻(xiàn)金冶光.波長檢測型SPR分析儀的研制與應(yīng)用D.長春：吉林大學(xué),2012.林開群.表面等離子體共振傳感器的新現(xiàn)象、新方法及其溫度特性研究D. 合肥：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué),2009.陶磊.納米粒子的制備及其在波長檢測型表面等離子體共

35、振傳感器中的應(yīng)用 研究D.長春：吉林大學(xué),2009.J.L. Soulages,乙 Salamon, M. Wells, G Tollin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92: 5650.D. Bartley, Nature, 1994, 368: 558.P. Nilsson, B. Persson, M. Uhlen, Anal. Biochem., 1995, 224: 400.C.E. Jordan, A.G Frutos, A.J. Thiel, R.M. Cron, Anal. Chem., 1997, 69, 4939.Y. Okahata

36、, M. Kawase, K. Nikura, F. Ohtake, H. Furusawa, Y. Ebara, Anal. Chem., 1998, 70, 1288.A.G. Frutos, R.M. Corn, Anal. Chem. News & Features, 1998, 7, 449.牟穎，張寒琦，金欽漢.現(xiàn)代科學(xué)儀器J, 2001, 2, 27.I. Babic, S.E. Andrew, E.R. Jiril, Mutation Res, 1996, 372, 87.I.C. Ho, N.K.L. Gottschalk, Science, 1990, 250, 814.R

37、.J. Fisher, A.D. Baxevanis, G. Mavrothalassitis, BIAsympoisum, 1992, 2, 44.V.A. Vandernoot, E. P. C. Lai, Spear., 1991, 6: 28.A.M. Hutchinson, Anal. Biochem., 1994, 220: 303.A. Severs, R. Schasfoort, Biosens. Bioelectron, 1991, 6: 201.Indyk H E,Persson B S,Caselunghe M C,et a1.Determination of vitam

38、in B12 in milk products and selected foods by optical biosensor protein-binding assay :method comparison.J AOAC Int, 2002, 85(1): 72-81.Rasooly A.Surface plasmon analysis of sraphylococcal enterotoxin B in food.J Food Prot,2001 64(1):37-43.Bergwerff, A.A., G.C.A.M. Bokken, R.J. Corbee, and F.V Knapen. 2003. Immunochemical detection of salmonella group B, D and E using an optical surface plasmon resonance biosensor. FEMS microbiology letters. 222:75-82.Medina,