乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)培訓(xùn)課件

1、乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)一、HBV耐藥的有關(guān)定義二、各種耐藥檢測(cè)技術(shù)的評(píng)價(jià)三、需要重視的幾個(gè)問題2乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)2乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)一、HBV耐藥的有關(guān)定義 病毒學(xué)突破（virologic breakthrough） 病毒反跳（viral rebound） 生化學(xué)突破（biochemical breakthrough） HBV基因型耐藥（genotypic resistance） HBV表型耐藥（phenotypic resistance） 臨床耐藥（clinical resistance） 3乙型肝炎病毒核苷酸類

2、似物耐藥的檢測(cè)一、HBV耐藥的有關(guān)定義 3乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢HBV耐藥的有關(guān)定義 病毒學(xué)突破（virologic breakthrough）指在核苷類藥物治療過程中，患者的血清HBV DNA水平一度被抑制，但在繼續(xù)治療中血清HBV DNA水平與最低值相比上升或超過1個(gè)log10（10倍）。4乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)HBV耐藥的有關(guān)定義4乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)HBV耐藥的有關(guān)定義 病毒反跳（viral rebound）指核苷類藥物治療過程中患者的血清HBV DNA水平一度被抑制，但在繼續(xù)治療中血清HBV DNA升高至2104IU/mL或高于治療前水平。 5乙型

3、肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)HBV耐藥的有關(guān)定義5乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)HBV耐藥的有關(guān)定義 生化學(xué)突破（biochemical breakthrough）指在核苷類藥物治療過程中血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平一度復(fù)常，但在繼續(xù)治療中血清ALT水平又再次升高。肝臟生活指標(biāo)很多，但是在此僅指ALT。6乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)HBV耐藥的有關(guān)定義 6乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)HBV耐藥的有關(guān)定義 HBV基因型耐藥（genotypic resistance）指HBV基因組中的某些位點(diǎn)發(fā)生改變，導(dǎo)致這種藥物對(duì)HBV的抑制作用下降或消失。這種HBV基因變異與HBV的耐

4、藥性有直接因果關(guān)系，通過這些變異位點(diǎn)的檢測(cè)可判斷HBV有無(wú)耐藥性。 7乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)HBV耐藥的有關(guān)定義7乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)HBV耐藥的有關(guān)定義 HBV表型耐藥（phenotypic resistance）通過體外細(xì)胞培養(yǎng)方法，直接測(cè)定HBV對(duì)某種藥物的敏感性，或者在體外直接測(cè)定HBV聚合酶的活性，敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐藥，即表型耐藥。通常以IC50來(lái)評(píng)估 IC505倍:敏感 IC50在510倍:部分耐藥 IC50 10倍:耐藥8乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)HBV耐藥的有關(guān)定義 HBV表型耐藥（phenotyHBV耐藥的有關(guān)定義 臨床耐藥

5、（clinical resistance）指臨床出現(xiàn)病毒復(fù)制不能被抑制，或HBV復(fù)制一度被抑制后又出現(xiàn)HBV DNA反跳，同時(shí)伴有ALT升高，或肝炎復(fù)發(fā)的其他臨床證據(jù)。 9乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)HBV耐藥的有關(guān)定義9乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)二、各種耐藥檢測(cè)技術(shù)及評(píng)價(jià)病毒學(xué)反跳或突破的監(jiān)測(cè)HBV基因型耐藥監(jiān)測(cè)HBV表型耐藥檢測(cè)臨床耐藥監(jiān)測(cè)10乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)二、各種耐藥檢測(cè)技術(shù)及評(píng)價(jià)10乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的病毒學(xué)反跳或突破的監(jiān)測(cè)基于對(duì)血清HBV DNA載量的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)需重視以下三點(diǎn)： 1. HBV DNA載量檢測(cè)手段的敏感性 2.檢測(cè)技術(shù)的可靠性和

6、穩(wěn)定性 3.監(jiān)測(cè)的間隔時(shí)間11乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)病毒學(xué)反跳或突破的監(jiān)測(cè)11乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)HBV基因型耐藥監(jiān)測(cè)時(shí)機(jī)非必須不主張常規(guī)、廣泛應(yīng)用12乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)HBV基因型耐藥監(jiān)測(cè)12乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)基因型耐藥相關(guān)變異的命名13乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)基因型耐藥相關(guān)變異的命名13乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢基因型耐藥相關(guān)變異在HBV多聚酶序列中的位置14乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)基因型耐藥相關(guān)變異在HBV多聚酶序列中的位置14乙型肝炎病HBV基因型耐藥的主要技術(shù)堿基序列分析法 直接測(cè)序 克隆測(cè)序聚合酶鏈

7、式反應(yīng)及限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)反向雜交分析技術(shù)（INNOLiPA）基因芯片技術(shù) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù) 探針定點(diǎn)突變PCR技術(shù) 引物末端堿基定點(diǎn)突變擴(kuò)增技術(shù) 熔解曲線法 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)15乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)HBV基因型耐藥的主要技術(shù)堿基序列分析法15乙型肝炎病毒核苷直接測(cè)序法末端終止法化學(xué)裂解法DNA測(cè)序自動(dòng)化使用特異性引物與單鏈模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)，用ddNTP終止，用PAGE區(qū)分長(zhǎng)度僅相差1個(gè)核苷酸的ssDNA，從而完成測(cè)序的方法。用化學(xué)試劑在A、G、C、T處特定的裂解DNA片段

8、，產(chǎn)生一簇各種長(zhǎng)度的短鏈，經(jīng)過PAGE放射自顯影可直讀DNA順序。類似末端終止法，所不同的是用熒光染料標(biāo)記，計(jì)算機(jī)自動(dòng)讀出。優(yōu)點(diǎn)簡(jiǎn)便、迅速、應(yīng)用廣泛。不需酶促反應(yīng)，可以對(duì)寡核苷酸測(cè)序。簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確可靠。安全、無(wú)放射性污染。模板用量大大減少。測(cè)序能力增強(qiáng)。 16乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)直接測(cè)序法末端終止法化學(xué)裂解法DNA測(cè)序自動(dòng)化使用特異性引物HBV YMDD變異直接測(cè)序結(jié)果圖譜17乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)HBV YMDD變異直接測(cè)序結(jié)果圖譜17乙型肝炎病毒核苷酸類直接DNA測(cè)序的局限性1. 設(shè)備貴、技術(shù)高、耗材、費(fèi)時(shí)。2.必須有充足目的基因片段。3.突變株比例小于20%

9、時(shí)，由于競(jìng)爭(zhēng)抑制作用不能被擴(kuò)增。直接測(cè)序法檢測(cè)HBV YMDD變異1.JPG18乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)直接DNA測(cè)序的局限性1. 設(shè)備貴、技術(shù)高、耗材、費(fèi)時(shí)。18克隆測(cè)序法19乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)克隆測(cè)序法19乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)克隆測(cè)序法優(yōu)點(diǎn)： 1.有助于發(fā)現(xiàn)混合株并可大致確定不同序列毒株 之間的相對(duì)比。 2.提高了檢測(cè)的靈敏度。局限性： 1.技術(shù)難度較高。 2.檢測(cè)周期更長(zhǎng)。 3.檢測(cè)的費(fèi)用大大增加。20乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)克隆測(cè)序法優(yōu)點(diǎn)：20乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè) 堿基變異可能導(dǎo)致： 原有位點(diǎn)消失 產(chǎn)生新的位點(diǎn) 識(shí)別位點(diǎn)移

10、位 利用錯(cuò)配引物使 PCR產(chǎn)物中產(chǎn)生 特異的酶切位點(diǎn)結(jié)果: 酶切片段長(zhǎng)、短變化和多、少變化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)21乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè) 堿基變異可能導(dǎo)致：結(jié)果: 酶切片段長(zhǎng)、短變化和多限制性內(nèi)切核酸酶的作用它們能識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別序列內(nèi)或其旁切割雙鏈DNA。如：Nde I限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)：CA TATGGTAT ACNla Ill限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)：CATG NNNGTAC NNN22乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)限制性內(nèi)切核酸酶的作用它們能識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別序PCR-RFLP檢測(cè)HBV YMD

11、D變異PCR錯(cuò)配引物設(shè)計(jì)23乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)PCR-RFLP檢測(cè)HBV YMDD變異PCR錯(cuò)配引物設(shè)計(jì)2PCR-RFLP檢測(cè)HBV YMDD變異24乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)PCR-RFLP檢測(cè)HBV YMDD變異24乙型肝炎病毒核苷PCR-RFLP檢測(cè)HBV YMDD變異25乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)PCR-RFLP檢測(cè)HBV YMDD變異25乙型肝炎病毒核苷PCR-RFLP技術(shù)的評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)： 簡(jiǎn)單、廣泛易開展。缺點(diǎn)： 1.限制性內(nèi)切酶種類有限。 2.錯(cuò)配引物將導(dǎo)致退火溫度降低、非特異條帶增多。 3.引物非完全匹配，可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低、檢測(cè) 敏感的下降。 2

12、6乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)PCR-RFLP技術(shù)的評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：26乙型肝炎病毒核苷酸類似物反向雜交分析技術(shù)（INNOLiPA）27乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)反向雜交分析技術(shù)（INNOLiPA）27乙型肝炎病毒核苷酸INNOLiPA診斷HBV YMDD變異28乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)INNOLiPA診斷HBV YMDD變異28乙型肝炎病毒核DNA芯片技術(shù)BiologicalSampleAnalyze dataScannermicroarray“Hybridize”arrayerMicroarray fabricationSample preparationMolecula

13、r hybridizationDetection and analysis29乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)DNA芯片技術(shù)BiologicalAnalyze dataSDNA芯片技術(shù)診斷HBV YMDD變異Detection of YMDD Motif Mutants by Oligonucleotide Chips in Lamivudine-Untreated Patients with Chronic Hepatitis B Virus Infection。J Korean Med Sci 2004; 19: 541-546.30乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)DNA芯片技術(shù)診斷H

14、BV YMDD變異Detection oDNA芯片技術(shù) 優(yōu)點(diǎn) 局限性 大通量 技術(shù)和設(shè)備的要求高 快速 檢測(cè)成本高 靈敏度高 可平行檢測(cè) 31乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)DNA芯片技術(shù) 優(yōu)點(diǎn) 局實(shí)時(shí)熒光定量PCR在基因變異中的應(yīng)用探針定點(diǎn)突變PCR技術(shù)Taqman-MGB探針引物末端堿基定點(diǎn)突變擴(kuò)增技術(shù)高分辨熔解曲線法32乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR在基因變異中的應(yīng)用探針定點(diǎn)突變PCR技術(shù)-Taqman-MGB探針定點(diǎn)突變PCR技術(shù)33乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)Taqman-MGB探針定點(diǎn)突變PCR技術(shù)33乙型肝炎病毒核Taqman-MGB探針技術(shù)檢測(cè)YM

15、DD變異HBV DNA105copies/mlW:M=1:1HBV DNA105copies/mlW:M=10:1HBV DNA探針定點(diǎn)突變PCR技術(shù) 優(yōu)點(diǎn) 不足 靈敏度高 需要相對(duì)較貴的熒光PCR儀 特異性好 需要多條熒光探針，成本高 費(fèi)時(shí)短 影響因素多，存在一定誤判35乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)探針定點(diǎn)突變PCR技術(shù)35乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)引物末端堿基定點(diǎn)突變擴(kuò)增技術(shù)36乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)引物末端堿基定點(diǎn)突變擴(kuò)增技術(shù)36乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥引物末端堿基定點(diǎn)突變擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)YMDD變異37乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)引物末端堿基定點(diǎn)突變擴(kuò)增

16、技術(shù)檢測(cè)YMDD變異37乙型肝炎病熔解曲線法檢測(cè)YMDD變異特異性探針，其Tm值不同溶解曲線分析38乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)熔解曲線法檢測(cè)YMDD變異特異性探針，其Tm值不同溶解曲線分基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)原理39乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)MALDI-TOF MS檢測(cè)HBV YMDD變異的原理酶切分子量.JPG40乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)MALDI-TOF MS檢測(cè)HBV YMDD變異的原理酶切基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD I-TOF MS)優(yōu)點(diǎn)： 高靈敏

17、度、準(zhǔn)確度、分辨率 能發(fā)現(xiàn)相對(duì)比例小于1%的變異株。局限性： 設(shè)備昂貴，目前國(guó)內(nèi)難以用于臨床檢測(cè)。41乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD I-TOF MSHBV耐藥不同檢測(cè)技術(shù)的比較Advances in Molecular Diagnosis of HBV Infection and Drug Resistance。Int. J. Med. Sci. 2005 2(1)：8-161Sensitivity here refers to the lowest level (%) at which an assay can detect mixtures

18、of mutant and wild-type virus. 2Information content is considered as a measure of a tests ability to provide broad, relevant information about possible new mutations. 3Updateability assesses the ease at which a test can be dapted to incorporate the detection of a new mutation. na, not applicable. nd

19、, not determined.42乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)HBV耐藥不同檢測(cè)技術(shù)的比較Advances in MoleHBV表型耐藥檢測(cè)有兩種途徑：1.細(xì)胞外HBV聚合酶活性分析。2.細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)。43乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)HBV表型耐藥檢測(cè)有兩種途徑：43乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)培訓(xùn)課件細(xì)胞外HBV聚合酶活性分析45乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)細(xì)胞外HBV聚合酶活性分析45乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)該方法類似于細(xì)菌藥物敏感試驗(yàn)。目前多采用病毒載體將含有被檢測(cè)的含HBV變異位點(diǎn)的全基因組導(dǎo)入肝細(xì)胞源

20、性細(xì)胞株，然后將各種濃度的核苷類藥物加入培養(yǎng)液，經(jīng)過一定時(shí)間培養(yǎng)后檢測(cè)細(xì)胞上清中的HBV DNA含量。 46乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)該方法類似于細(xì)菌藥物敏感試驗(yàn)。目前多采用病細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)47乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)47乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)該技術(shù)在操作上非常繁瑣，目前僅限于研究之需，主要用于藥物開發(fā)研究，尚不能用于常規(guī)臨床分析。 48乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)該技術(shù)在操作上非常繁瑣，目前僅限于研究之需臨床耐藥監(jiān)測(cè)YMDD變異前后病毒載量和ALT的變化49乙型肝炎病毒核苷酸類似物

21、耐藥的檢測(cè)臨床耐藥監(jiān)測(cè)YMDD變異前后病毒載量和ALT的變化49乙型肝HBV MDD變異與病毒學(xué)突破50乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)HBV MDD變異與病毒學(xué)突破50乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐判斷臨床耐藥時(shí)的建議1. 結(jié)合核苷類藥物的應(yīng)用史、起始病毒載量、是否合并其他肝病等。2.注意甄別依從性不良。3.結(jié)合基因變異位點(diǎn)。 51乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)判斷臨床耐藥時(shí)的建議1. 結(jié)合核苷類藥物的應(yīng)用史、起始病毒載三、需要重視的幾個(gè)問題慎重對(duì)待天然耐藥的結(jié)論。不要過分依基因型耐藥檢測(cè)技術(shù)。正確對(duì)待基因分型技術(shù)。 52乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測(cè)三、需要重視的幾個(gè)問題慎重對(duì)待天然耐藥的結(jié)論。52乙型肝炎病YMDD自然變異的幾組數(shù)據(jù)Akarsu M等采用InnoLipa 法檢測(cè)71例未經(jīng)抗病毒的成年慢性乙肝攜帶者，結(jié)果有13例檢測(cè)到Y(jié)MDD變異株。Lee CZ等采用引物末端堿基定點(diǎn)突變擴(kuò)增技術(shù)對(duì)28例拉米夫定治療前的CHB患