PCR引物設(shè)計(jì)及相關(guān)軟件的應(yīng)用-超實(shí)用課件

1、PCR引物設(shè)計(jì)及相關(guān)軟件使用主要內(nèi)容背景PCR引物設(shè)計(jì)原則常用PCR引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0 介紹Oligo 6.22 介紹在線Primer3 介紹PCR聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測(cè)鑒定。 PCR引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)是PCR 技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)

2、。使用不合適的PCR 引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失?。罕憩F(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等。現(xiàn)在PCR 引物設(shè)計(jì)大都通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行?？梢灾苯犹峤荒０逍蛄械教囟ňW(wǎng)頁(yè)，得到設(shè)計(jì)好的引物，也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專業(yè)軟件。引物設(shè)計(jì)的原則引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。 一般原則引物的長(zhǎng)度一般為15-30 bp，常用的是18-24 bp，但不應(yīng)大于38。引物過(guò)短又同時(shí)會(huì)引起錯(cuò)配現(xiàn)象，一般來(lái)說(shuō)引物長(zhǎng)度大于16bp是必要的（不容易引起錯(cuò)配）。例如：一個(gè)長(zhǎng)度為12bp的引

3、物在人類基因組上存在200個(gè)潛在的退火位點(diǎn)(3 x 109/412=200 ).而一個(gè)長(zhǎng)度為20bp的引物在人基因組上存在的退火位點(diǎn)只有1/400個(gè).較長(zhǎng)的引物（28-35bp)一般是用來(lái)區(qū)分同源性較高的模板序列或者使用于產(chǎn)生一些突變位點(diǎn)Tm值的計(jì)算一般的公式Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 對(duì)于長(zhǎng)一些的引物可用更為準(zhǔn)確的nearest-neighbor （Frier et al. (1986) ）一般原則3，引物3端的末位堿基對(duì)Taq 酶的DNA 合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A 的錯(cuò)配效率明顯高于其他3 個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3

4、端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR 反應(yīng)失敗。5端序列對(duì)PCR 影響不太大，因此常用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。一般原則4. 引物序列的GC 含量一般為40-60%，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。不同的算法推薦45-55%或50-60%一般原則5. G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3端G 值較低（絕對(duì)值不超過(guò)9），而5端和中間G 值相對(duì)較高的引物。引物的3端的G 值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)。（能值越高越容易結(jié)合） 一般原則7. 引物二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)PCR反應(yīng)的影響

5、。盡可能少的引物二聚體。 常用的引物設(shè)計(jì)軟件Oligo 6 （引物評(píng)價(jià)）*Primer Premier （自動(dòng)搜索）*Vector NTI SuitDnasisOmigaDnastarPrimer3 （在線服務(wù)）*簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)根據(jù)氨基酸序列來(lái)設(shè)計(jì)引物DNA引物Premier Primer 5提供了8種生物遺傳密碼使用的偏好選擇1、纖毛蟲大核（Ciliate Macronuclear）2、無(wú)脊椎動(dòng)物線粒體（Invertebrate Mitochondrion）3、支原體（Mycoplasma）4、植物線粒體（Plant Mitochondrion）5、原生動(dòng)物線粒體（Protozoan Mito

6、chondrion）6、一般標(biāo)準(zhǔn)（Standard）7、脊椎動(dòng)物線粒體（Vertebrate Mitochondrion）8、酵母線粒體（Yeast Mitochondrion）Primer Premier 5.0使用介紹(1)Preimer Premier 啟動(dòng)界面Load sequence基本信息Sequence nameOriginal sequenceUse these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8種密碼子偏好Choose a function 引

7、物設(shè)計(jì)界面First you can design the primer manuallySense strand or anti-sense strandUseful information of the primer引物搜索選項(xiàng)設(shè)定引物類型搜索模式5引物位置范圍3引物位置范圍產(chǎn)物大小范圍引物長(zhǎng)度搜索結(jié)果28對(duì)引物引物分值100分為滿分每對(duì)引物的信息雙擊選中一對(duì)引物一對(duì)理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有But 引物編輯Some other useful function of PP5EnzymeMelting temperature graphPer 2

8、5-merGC% graphPer 25-merStability Per 5-merOligo 6.44 使用說(shuō)明主要功能：專門的引物設(shè)計(jì)軟件Oligo 6.44 啟動(dòng)界面Open sequence file3個(gè)彈出窗口Melting temperatureG Internal StabilityFrq為鄰近6至7 個(gè)堿基組成的亞單位在一個(gè)指定數(shù)據(jù)庫(kù)文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯(cuò)誤引發(fā)的可能性。用Oligo 設(shè)計(jì)引物時(shí)的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)Tm 值曲線以選取5到3的下降形狀有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。Frq 曲線宜選用3端Frq 值相對(duì)較低的片段。G 值在5端和中間值比較高，而在3端相對(duì)低選中引物上游引物下游引物只是示意圖引物分析首先檢查引物二聚體尤其是3端二聚體形成的可能性。引物分析二項(xiàng)檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin）；與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。引物分析第三項(xiàng)檢查為GC 含量，以45-55為宜。第四False priming 檢查引物分析Key information of primerHairpinDim