土壤脲酶、蔗糖酶、磷酸酶活性的測(cè)定_第1頁(yè)
土壤脲酶、蔗糖酶、磷酸酶活性的測(cè)定_第2頁(yè)
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1、土壤酶活性的測(cè)定方法及部分樣品配制詳細(xì)請(qǐng)參考土壤微生物分析方法手冊(cè),土壤酶及其研究法土壤樣品采集與制備土壤樣品取樣后混勻,用于土壤酶活性測(cè)定的土壤磨細(xì)過(guò) 2mm 篩后,置于 4 C冰箱內(nèi)保存?zhèn)錅y(cè)。1. 土壤酶活性的測(cè)定方法脲酶采用靛酚藍(lán)比色法方法原理:本法基于以尿素為基質(zhì),酶促水解生成的氨與酚類化合物起反應(yīng) 生成藍(lán)色的靛酚,顏色深度與氨含量相關(guān),用于尿酶活性的測(cè)定。操作步驟:取10g風(fēng)干土,置于100ml三角瓶中,加2ml甲苯,15min后加 10ml 10%尿素液和20ml pH6.7檸檬酸鹽緩沖液。搖勻后在37 C恒溫箱中培養(yǎng)3h。 按此操作,進(jìn)行以水代替基質(zhì),及無(wú)土壤的基質(zhì)對(duì)照測(cè)定,過(guò)濾

2、后取0 . 5ml 濾液 于 50ml 比色管中,然后按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線顯色方法進(jìn)行比色測(cè)定。氮的標(biāo)液:精確稱取0.4717g硫酸按溶于水并稀釋至1000ml,則得1ml含 0.1mg 氮的標(biāo)準(zhǔn)液。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí),可將此液稀釋 10 倍供用。pH6.7 檸檬酸鹽緩沖液:用 368g 檸檬酸溶于 600ml 水,另取 295g 氫氧化鉀 溶于水,再將二種溶液混合,然后用1M的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到6.7,定容到2L。苯 酚 溶 液 : 稱 取 苯 酚 ( C6H5OH ) 10g 和 硝 基 鐵 氰 化 鈉 Na2Fe(CN)5NO2H2O100mg稀釋至1L。此試劑不穩(wěn)定,須貯于棕色瓶中,在4C 冰箱

3、中保存。次氯酸鈉堿性溶液: 稱 取 氫 氧 化 鈉 ( 化 學(xué) 純 ) 10g 、 磷 酸 氫 二 鈉 (Na2HPO4 7H2O,化學(xué)純)7.06g、磷酸鈉(Na3PO4 12H2O,化學(xué)純)31.8g 和52.5g L-1次氯酸鈉(NaOCl,化學(xué)純,即含5%有效氯的漂白粉溶液)10mL 溶于水中,稀釋至1L,貯于棕色瓶中,在4C冰箱中保存。標(biāo)線繪制:取稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液0、l、2、4、6、8、10ml,移于50rnl容量瓶中, 然后加入蒸餾水至20mL。再加4mL苯酸鈉溶液和4mL次氯酸鈉溶液,隨加隨 搖勻。 30min 后顯色,定容。在分光光度計(jì)上于 578nm 處比色。根據(jù)光密度值與 溶液

4、濃度繪制標(biāo)線。蔗糖酶采用磷鉬酸比色法方法原理:本法基于蔗糖酶酶解所得還原糖具有的還原性,能使磷鉬酸絡(luò)合物 生成藍(lán)色化合物,顏色強(qiáng)度與還原糖量相關(guān),因而用比色測(cè)定還原糖量用于表示 酶的活性。操作步驟:稱5g 土,置于100ml三角瓶中,加入10ml水,1ml甲苯。搖勻 使土壤均有分散后,放置 15 分鐘,加入15 毫升5蔗糖-磷酸緩沖液,搖勻混合 物后,放入恒溫箱,在37C下培養(yǎng)24h。按此操作,用不加土壤的基質(zhì)和150 攝氏度干熱滅菌 1 小時(shí)的土壤進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn),吸取 0.5ml 濾液于 50ml 比色管中, 按標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟顯色測(cè)定,pH5.5磷酸緩沖液:1/15M磷酸氫二鈉(11.867g

5、Na2PO42H2O溶于1L蒸餾 水中)0.5ml加1/15M 磷酸二氫鉀(9.078KH2PO4溶于1L蒸餾水中)9.5ml即成。鉬酸銨溶液:a) 5%鉬酸銨溶液;b) 200ml濃硫酸加入800ml水,使用前按 1:1 將 a 與 b 混合5蔗糖溶液( pH5.5 磷酸緩沖液配制)銅試劑:a) 50gCuSO4 5H2O 溶于 500ml 水;b) 25gNa2CO3。25g 酒石酸鉀 鈉,20g NaHCO3和200gNa2S04溶于水并稀釋到1L,加幾滴甲苯防腐,使用前 按 1:25 將 a 與 b 混合。標(biāo)準(zhǔn)糖溶液:將 100 毫克葡萄糖和 100 毫克果糖溶于水,稀釋到 200ml

6、(1 毫克還原糖/1 毫升)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:取不同體積,由 0.5 至 50ml 標(biāo)準(zhǔn)糖溶液于 100ml 容量瓶 中,加入10ml醋酸緩沖液,用水稀釋到刻度,從每瓶中取2.5ml溶于50ml容量 瓶中,加入4ml銅試劑,搖勻,在烘箱內(nèi)與105攝氏度左右放置25分鐘,取出 冷卻至室溫,依次加入2ml 0.25M磷酸氫二鈉和5ml鉬酸銨試劑,隨加隨搖勻, 待二氧化碳逸出后,放置1小時(shí),搖勻,于578nm處比色測(cè)定。酸性磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法方法原理 本法基于以磷酸苯二鈉為基質(zhì),酶解釋放出的酚,使其與氯代溴 苯醌亞胺試劑反應(yīng)生色,用比色法測(cè)定出游離酚量,用其表示酶的活性操作步驟:稱 2.5g

7、風(fēng)干土置于 100mL 三角瓶中,加 1.25mL 甲苯,輕搖 15min 加入 10mL 0.5%磷酸苯二鈉(酸性磷酸酶用醋酸鹽緩沖液,中性磷酸酶用檸檬酸 鹽緩沖液,堿性磷酸酶用硼酸鹽緩沖液),仔細(xì)搖勻后放入恒溫箱,在37C下培 養(yǎng)2h。后于培養(yǎng)液中加50mL 0.3%硫酸鋁溶液并過(guò)濾,按此操作,進(jìn)行以水代 替基質(zhì),及無(wú)土壤的基質(zhì)對(duì)照測(cè)定,吸取 0.5mL 濾液于 50mL 容量瓶中,然后按 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方法顯色。于 660nm 處比色.酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液:(1)酚原液:取 1g 重蒸酚溶于蒸餾水中,稀釋至 1L 于棕色瓶中。(2)酚工作液一取 10ml 酚原液稀釋至 1L, (每毫升含 0.01mg 酚)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:取 0, l, 2, 4, 6, 8, 10mL 酚工作液,置于 50mL 容量瓶 中,每瓶加入 5ml 緩沖液和 4 滴

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