實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗課件

1、實驗九 酶聯(lián)免疫吸附試驗-ELISA實驗十 IgG的分離和純化程 燕2014年6月9日實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗1實驗九 酶聯(lián)免疫吸附試驗-ELISA實驗十 IgG的分離實驗九 酶聯(lián)免疫吸附試（ Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗2實驗九 酶聯(lián)免疫吸附試（ Enzyme linked i實驗?zāi)康?1.掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗的原理、種類和用途。 2.學(xué)習(xí)用酶聯(lián)免疫吸附試驗雙抗體夾心法檢測乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的方法。 3.了解HBsAg陽性的意義。實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗3實驗?zāi)康膶嶒灳攀嘎?lián)免疫吸附試驗3實驗原理 用酶來

2、標(biāo)記抗原或抗體的免疫分析分析技術(shù)。由于酶的高效生物催化作用，產(chǎn)生了放大作用，使得原來極其微乎其微的抗原或抗體在數(shù)分鐘后就可被識別出來，這種技術(shù)被稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗法。實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗4實驗原理 用酶來標(biāo)記抗原或抗體的免疫分析分析技術(shù)。由于酶的實驗原理 將已知抗體（或抗原）結(jié)合在某種固相載體上，并保持其免疫活性。 測定時將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體（或酶標(biāo)抗原）按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體（或抗原）發(fā)生反應(yīng)，用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離物成分，然后加入底物顯色，進(jìn)行定性或定量測定。 實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗5實驗原理 將已知抗體（或抗原）結(jié)合在實驗原理ELISA的基本原理有三條：

3、 （1）抗原或抗體能以物理性（疏水性）地吸附于固相載體表面，并保持其免疫學(xué)活性；（2）抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；（3）酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗結(jié)果。實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗6實驗原理ELISA的基本原理有三條： 實驗九十酶聯(lián)免疫吸附實驗原理常用酶聯(lián)免疫吸附試驗有間接法競爭法雙抗體夾心法 實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗7實驗原理常用酶聯(lián)免疫吸附試驗有實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗7ELISA-間接法

4、此法是檢測抗體最常用的方法。將已知抗原吸附于固相載體上，加入待測血清(抗體)與之結(jié)合，洗滌后，加酶標(biāo)抗體和底物進(jìn)行測定。其原理見圖。 酶標(biāo)抗體固相抗原待測抗體EEE ELISA間接法示意圖底物實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗8ELISA-間接法此法是檢測抗體最常用的方法。將已知抗原吸附用于抗原及半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，將特異性抗體吸附于固相載體上，加入待測抗原和一定量的已知酶標(biāo)抗原，使二者競爭地與固相抗體結(jié)合，經(jīng)過洗滌分離，最后結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原與待測抗原含量呈負(fù)相關(guān)。固相抗體EEE酶標(biāo)抗原待測抗原E底物E顯色反應(yīng)（弱）固相抗體EEE酶標(biāo)抗原底物顯色反應(yīng)（強(qiáng)）EEEEEE

5、ELISA-競爭法 實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗9用于抗原及半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。固相抗體EEEELISA-雙抗體夾心法雙抗體夾心法常用于檢測抗原。將已知抗體吸附于固相載體，加入待測標(biāo)本(含相應(yīng)抗原)與之結(jié)合，溫育后洗滌，加入酶標(biāo)抗體及底物溶液進(jìn)行測定。酶標(biāo)抗體固相抗體待測抗原EEE 雙抗體夾心法檢測抗原實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗10ELISA-雙抗體夾心法雙抗體夾心法常用于檢測抗原。酶標(biāo)抗體實驗材料1、乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒定性檢測人血清或血漿中的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg。包括：HBsAg特異性抗體（一抗）已包被于酶標(biāo)板上 HBsAg陰、陽性血清各1份、酶標(biāo)抗體（二抗）

6、1份，顯色劑A、B各1份，終止液1份，洗滌液1份，2、待檢血清5份3、微量加樣器（10-100ul）及匹配的槍頭4、廢液缸 注意：有污染性。實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗11實驗材料1、乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒實驗九十酶聯(lián)免疫吸夾心法檢測HBsAg方法 由于抗體1已包被在酶標(biāo)板上，故直接從加抗原開始。1、加樣：每組2條8孔，待檢8孔，陰性對照、陽性對照、空白對照各1孔。分別加75ul待測樣本和陰、陽性對照于相應(yīng)孔內(nèi)，蓋封板膜，置37恒溫箱溫育60分鐘。2、加酶標(biāo)抗體： 除空白對照孔外，每孔加1滴酶標(biāo)溶液，混勻后封板， 置37水浴箱溫育30分鐘。3、洗滌： 用洗滌液（按說明配制）注滿各孔，靜置2

7、0秒，甩去洗滌液，重復(fù)4次，最后一次在吸水紙上拍干。4、顯色： 每孔加底物液A 、B 各1滴（50ul），輕拍混勻，置37避光顯色30分鐘，肉眼觀察。5、終止：每孔加終止液1滴（50ul），輕拍混勻。在10分鐘內(nèi)酶標(biāo)6、測定：用酶標(biāo)儀（波長450nm）測定各孔吸光度OD值。 實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗12夾心法檢測HBsAg方法 由于抗體1已包被在酶標(biāo)板酶：辣根過氧化物酶(HRP)底物：3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）在辣根過氧化物酶催化下，TMB會產(chǎn)生可溶性藍(lán)色產(chǎn)物。使用2M H2SO4終止反應(yīng)，在450nm測定吸光度。實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗13酶：辣根過氧化物酶(HRP)實驗九十酶聯(lián)

8、免疫吸附試驗13結(jié)果判斷 1、定性：夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。2、P/N值2.1者判為HBsAg陽性；P/N值2.1者判為陰性。介于中間為可疑。S：待測樣本OD值COV： cut-off value =NCx+0.100NCx：陰性對照OD值的均值陽性判定值=S/COV1.0：陽性1.0：陰性實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗14結(jié)果判斷 1、定性：夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗15實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗15實驗報告1、計算5個待測樣本的S/COV，判斷結(jié)果2、本實驗中采用的酶、底物及反應(yīng)原理。實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗16實驗報告1、計算5個待測樣本的S

9、/COV，判斷結(jié)果實驗九十酶實驗十 IgG的分離和純化實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗17實驗十 IgG的分離和純化實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗17實驗?zāi)康膶嵺`IgG分離純化過程了解分離、純化抗體的原理比較成年牛血清與新生牛血清中IgG的含量（眼觀）實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗18實驗?zāi)康膶嵺`IgG分離純化過程實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗18實驗原理利用蛋白質(zhì)鹽析原理，分離血清中的IgG: 不同蛋白質(zhì)在同一濃度鹽溶液中的溶解度不同，因此，可利用不同濃度的鹽溶液使血清中的各個蛋白質(zhì)成分分別析出。實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗19實驗原理利用蛋白質(zhì)鹽析原理，分離血清中的IgG:實驗九十酶聯(lián)血清蛋白質(zhì)：復(fù)雜混合物。1、白蛋白

10、、a1、a2、球蛋白，纖維蛋白原，凝血酶原和其它凝血因子等均由肝細(xì)胞合成。2、球蛋白主要來自漿細(xì)胞。免疫球蛋白大多數(shù)存在于丙種球蛋白（-球蛋白）中。免疫球蛋白可以分為IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五類。實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗20血清蛋白質(zhì)：復(fù)雜混合物。實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗20一般pH7.0時，50硫酸銨飽和度可將所有的5種Ig（球蛋白）沉淀出來。33飽和度大部分IgG可沉淀出來。意義：制備出的純化IgG，可用于酶標(biāo)抗體或熒光抗體的制備。實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗21一般pH7.0時，50硫酸銨飽和度可將所有的5種Ig（球蛋實驗器材1動物抗血清：成年牛血清、新生牛血清2硫酸銨飽和溶液

11、、0.01mol/L的PBS 3冰箱、離心機(jī)、電磁攪拌器、天平、尼龍繩等。 實驗九十酶聯(lián)免疫吸附試驗22實驗器材1動物抗血清：成年牛血清、新生牛血清實驗九十酶聯(lián)免實驗步驟1.取xml血清（2ml），加等量0.01mol/L的PBS稀釋，攪拌下逐滴加入飽和(NH4)2SO4溶液2X ml（4ml），邊加邊攪拌，4靜置30分鐘以上，使其充分沉淀。2.離心：30004000r/min離心20min，棄上清。3.以0.01mol/L的PBS溶解沉淀至Xml（5ml），再逐滴加入飽和(NH4)2SO4 X/2ml（2.5ml)。置4，3060分鐘。4.再離心：3000r4000r/min離心20min，棄上清。5.重復(fù)上述第3、4步驟12次，可得到較純的IgG。6.透析除