致病性大腸埃希氏菌及其檢驗(行業(yè)培訓(xùn))課件

1、致病性大腸埃希氏菌及其檢驗1特選課堂致病性大腸埃希氏菌及其檢驗1特選課堂大腸埃希氏菌,俗稱大腸桿菌,是人類和動物腸道中正常菌群的主要成員,每克糞便中約含109個.大腸埃希氏菌隨糞便排出后,廣泛分布于自然界.水、牛乳及其他食品一旦檢出大腸埃希氏菌，即意味著這些物品直接或間接被糞便污染。2特選課堂大腸埃希氏菌,俗稱大腸桿菌,是人類和動物腸道中正常菌群的主要正常情況下，大腸埃希氏菌不致病，而且還能合成維生素B和維生素K,生產(chǎn)大腸菌素，對機體有利。但當機體抵抗力下降或大腸埃希氏菌侵入腸外組織或器官時，可作為條件致病菌而引起腸道外感染。有些血清型可引起腸道感染。致病性大腸埃希氏菌屬主要分為五大類，首先根

2、據(jù)發(fā)病機理分為三大類，1、產(chǎn)毒素型大腸埃希氏菌(ETEC)，2、侵襲型大腸埃希氏菌(EIEC)3、腸道致病性大腸埃希氏菌(EPEC)近來又提出另外兩類4、出血性大腸埃希氏菌(EHEC) 5、腸粘附性大腸埃希氏菌(EAEC)3特選課堂正常情況下，大腸埃希氏菌不致病，而且還能合成維生素B和維生素致病性大腸埃希氏菌中，一般認為能產(chǎn)生耐熱ST)和不耐熱(LT)腸毒素的兩種菌株均可引起人的食物中毒。引起大腸埃希氏菌中毒的主要是一些動物性食品，如乳與乳制品、肉類、水產(chǎn)品等，牛和豬是傳播這種病菌、引起中毒的主要原因。 4特選課堂致病性大腸埃希氏菌中，一般認為能產(chǎn)生耐熱ST)和不耐熱(L1996年7月在日本就

3、發(fā)生了大腸桿菌0157型引起的食物中毒，造成9017多人中毒，10人死亡，其原因與生食蘿卜苗有關(guān)，其中92例并發(fā)出血性腸炎及出血性尿毒癥。2001年，再江蘇、安徽等地爆發(fā)的腸出血性大腸桿菌0157:H7食物中毒，造成177人死亡，中毒人數(shù)超過2萬人。 如仔豬黃、白痢、豬水腫病、牛腹瀉和敗血癥等均可由大腸桿菌引起。5特選課堂1996年7月在日本就發(fā)生了大腸桿菌0157型引起的食物中毒一、埃希氏菌屬生物學(xué)特性形態(tài)與染色 本屬細菌為革蘭氏陰性兩端鈍圓、中等大小的無芽孢桿菌，絕大多數(shù)周生鞭毛，能運動，周身還有菌毛，不產(chǎn)生莢膜，某些菌株有莢膜。 普通大腸埃希氏菌Escherichia Coli6特選課堂

4、一、埃希氏菌屬生物學(xué)特性形態(tài)與染色 普通大腸埃希氏菌Esch培養(yǎng)特性 1)需氧及兼性厭氧菌 2)對營養(yǎng)的要求不高，在普通瓊脂上就生長良好，在15C-45范圍內(nèi)均可生長，但最適生長溫度為37，最適pH為7.2-7.4。 3)在普通瓊脂平板上培養(yǎng)24小時，可形成圓形、凸起、光滑、濕潤、半透明、邊緣整齊、中等大小的菌落其菌落與沙門氏菌比較相似，但是，大腸桿菌菌落對光(45角折射)觀察可見熒光。 4)在肉湯培養(yǎng)基中生長18-24小時變?yōu)榫鶆驕啠蟮撞砍霈F(xiàn)粘性沉淀物，并伴有臭味。 一、埃希氏菌屬生物學(xué)特性7特選課堂培養(yǎng)特性 一、埃希氏菌屬生物學(xué)特性7特選課堂5）在鮮血瓊脂平板上生長，有些菌株可見溶血環(huán)

5、。 6）在遠藤瓊脂上長成帶金屬光澤的紅色菌落 7）在SS瓊脂平板上多不生長，少數(shù)生長的細菌，也因發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸而形成紅色菌落； 8）在伊紅美蘭瓊脂上形成紫黑色具有金屬光澤的菌落 9）在麥康凱瓊脂上培養(yǎng)24小時后孤立菌落呈紅色 8特選課堂5）在鮮血瓊脂平板上生長，有些菌株可見溶血環(huán)。 8特選課堂埃希氏菌在SS瓊脂平板上形成紅色菌落9特選課堂埃希氏菌在SS瓊脂平板上形成紅色菌落9特選課堂在麥康基培養(yǎng)基上培養(yǎng)的大腸埃希桿菌 大腸埃希桿菌產(chǎn)生粉紅色乳糖發(fā)酵菌落。麥康基培養(yǎng)基是腸道細菌的選擇培養(yǎng)基，含膽鹽、乳糖和pH指示劑中性紅。乳糖發(fā)酵菌落產(chǎn)生酸，將指示劑變紅。（麥康基瓊脂，18小時，37）10特選課堂

6、在麥康基培養(yǎng)基上培養(yǎng)的大腸埃希桿菌 大腸埃希桿菌產(chǎn)生粉紅色革蘭氏陰性桿菌 11特選課堂革蘭氏陰性桿菌 11特選課堂12特選課堂12特選課堂革蘭氏陽性桿菌13特選課堂革蘭氏陽性桿菌13特選課堂大腸桿菌掃描電鏡照片14特選課堂大腸桿菌掃描電鏡照片14特選課堂大腸桿菌透射電鏡照片15特選課堂大腸桿菌透射電鏡照片15特選課堂大腸桿菌革蘭氏染色照片 16特選課堂大腸桿菌革蘭氏染色照片 16特選課堂大腸桿菌平板菌落照片17特選課堂大腸桿菌平板菌落照片17特選課堂一、埃希氏菌屬生物學(xué)特性生化特性 1）可發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有些不典型的菌株不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵乳糖； 2）不同菌株對蔗糖，衛(wèi)矛

7、醇、水楊苷發(fā)酵結(jié)果不一致; 3）本菌可使賴氨酸脫鞍、不能使苯丙氨酸脫羧。 4）不產(chǎn)生H2S，不液化明膠，不分解尿素;18特選課堂一、埃希氏菌屬生物學(xué)特性生化特性 18特選課堂5）、不能在氰化鉀培養(yǎng)基上生長，靛基質(zhì)試驗陽性，V-P試驗陰性，不利用枸櫞酸鹽。后四項生化特性是典型的大腸埃希氏菌，與此不一致的即為非典型大腸埃希氏菌菌。 IMViC試驗：如IMViC試驗為+、+、-、-，且乳糖發(fā)酵，表明被檢物已有糞便污染，有發(fā)生腸道傳染病的危險，這是衛(wèi)生細菌中常用的檢測指標。（I：吲哚形成試驗，M：甲基紅試驗，Vi：V-P試驗，C：枸櫞酸鹽利用試驗） 19特選課堂5）、不能在氰化鉀培養(yǎng)基上生長，靛基質(zhì)試

8、驗陽性，V-P試驗陰I-吲哚（indol）試驗 色氨酸吲哚玫瑰吲哚 吲哚試劑 20特選課堂I-吲哚（indol）試驗 20特選課堂M-甲基紅（methyl red）實驗葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇 甲基紅 -葡萄糖丙酮酸 甲基紅 +21特選課堂M-甲基紅（methyl red）實驗葡萄糖丙酮酸乙酰V-VP（Voges-Proskauer）試驗 葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇二乙酰紅色化合物+ 胍基化合物 葡萄糖丙酮酸 乙酰甲基甲醇V-VP（Voges-Proskauer）試驗 葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇二乙酰紅色化合物+ 胍基化合物 葡萄糖丙酮酸 乙酰甲基甲醇V-VP（Voges-Proskauer）試驗

9、 葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇二乙酰紅色化合物+ 胍基化合物 葡萄糖丙酮酸 乙酰甲基甲醇22特選課堂V-VP（Voges-Proskauer）試驗 V-VP（VC-枸櫞酸鹽利用（citrate utilization）試驗利用枸櫞酸鹽生長 + 不能利用 - 23特選課堂C-枸櫞酸鹽利用（citrate utilization）試一、埃希氏菌屬生物學(xué)特性抵抗力 該菌對熱的抵抗力較其他腸道桿菌強，55經(jīng)60分鐘或60加熱15分鐘仍有部分細菌存活。 在自然界的水中可存活數(shù)周至數(shù)月，在溫度較低的糞便中存活更久。對磺胺類、鏈霉素、氯霉素等敏感，青霉素對它的作用弱, 易產(chǎn)生耐藥菌株.24特選課堂一、埃希氏菌屬

10、生物學(xué)特性抵抗力 24特選課堂一、埃希氏菌屬生物學(xué)特性 致病性：（1）致病因素 侵襲力:大腸桿菌具有抗原和菌毛,抗原有抗吞噬作用,有抵抗抗體和補體的作用,菌毛能幫助細菌黏附于黏膜表面.有侵襲力的菌株可以侵犯腸道表皮層引起炎癥. 內(nèi)毒素:大腸桿菌細胞壁具有內(nèi)毒素的活性 腸毒素:有兩種,不耐熱腸毒素(LT),成分可能是蛋白質(zhì),加熱65經(jīng)30min即被破壞. LT與霍亂菌腸毒素作用相似,都是刺激小腸上皮細胞的腺苷環(huán)化酶,使ATP轉(zhuǎn)變?yōu)镃AMP,促進腸黏膜細胞的分泌功能,使腸液大量分泌,引起腹瀉;耐熱腸毒素(ST)無免疫性,耐熱,100經(jīng)10-20min不被破壞,也可使腸道細胞的CAMP水平升高,引起

11、腹瀉. 25特選課堂一、埃希氏菌屬生物學(xué)特性 致病性：（1）致病因素 25特選課LT與ST的比較特性不耐熱腸毒素耐熱腸毒素分子量較大，73000較小，1500-5000耐熱性不耐熱耐熱免疫原性有無B亞單位受體腸黏膜GM1神經(jīng)節(jié)苷酯腸黏膜GM1神經(jīng)節(jié)苷酯致病機理活化細胞腺苷酸環(huán)化酶，細胞內(nèi)cAMP含量升高，分泌功能亢進，引起腹瀉活化細胞鳥苷酸環(huán)化酶，細胞內(nèi)cGMP含量升高，分泌功能亢進，引起腹瀉26特選課堂LT與ST的比較特性不耐熱腸毒素耐熱腸毒素分子量較大，730一、埃希氏菌屬生物學(xué)特性致病性：（2）所致疾病 腸外感染：泌尿系統(tǒng)感染最常見病原菌。還可引起膽囊炎、肺炎、新生兒或嬰兒腦膜炎。 腹瀉

12、：產(chǎn)毒素大腸桿菌是嬰兒及旅游者腹瀉的主要原因；致病性大腸桿菌是嬰兒腹瀉的主要原因；侵襲型大腸桿菌主要引起較大兒童和成年人腹瀉。27特選課堂一、埃希氏菌屬生物學(xué)特性致病性：（2）所致疾病 27特選課堂一、埃希氏菌屬生物學(xué)特性血清學(xué)特性 大腸埃希氏菌的抗原構(gòu)造主要由菌體抗原(O)，鞭毛抗原(H)和莢膜抗原(K)三部分組成。 1）O抗原 成分為細胞壁上的糖、類脂和蛋白質(zhì)復(fù)合物，也是細菌的內(nèi)毒素，熱穩(wěn)定性較強，高壓蒸汽處理2小時不被破壞。每一血清型只含有一種O抗原，本菌已發(fā)現(xiàn)有167種O抗原，分別以阿拉伯數(shù)字表示。 2）H抗原 為蛋白質(zhì)；一種大腸埃希氏菌只有一種H抗原，無鞭毛則無H抗原，H抗原能在80

13、度被破壞，也能被酒精破壞。H抗原共有64種。28特選課堂一、埃希氏菌屬生物學(xué)特性血清學(xué)特性 28特選課堂3）K抗原 是細胞外部的莢膜或菌體表面物質(zhì)，又稱包膜抗原。新分離的大腸埃希氏菌70具有K抗原。根據(jù)K抗原耐熱的敏感性可把K抗原分為A、B、L三類，共有103種，致病性大腸埃希氏菌的抗原主要為B抗原，少數(shù)為L抗原，B抗原與L抗原均可在煮沸后被破壞，A抗原耐熱性強，可耐受煮沸1小時而不被破壞。， O抗原可將大腸埃希氏菌分成若干血清群，再根據(jù)K抗原和H抗原進一步分為若干個血清型或亞型，根據(jù)大腸埃希氏菌抗原的鑒定結(jié)果，寫出其抗原式如O111：K58(B)H12，一般認為H抗原與致病性無關(guān)，因此，一般

14、不需要進行H抗原的鑒定。 29特選課堂3）K抗原 29特選課堂二、致病性大腸埃希氏菌的檢驗 致病性大腸埃希氏菌的檢驗應(yīng)按中華人民共和國國家標準食品衛(wèi)生檢驗方法(微生物學(xué)部分)(GB4896-84)的有關(guān)內(nèi)容進行檢驗。其檢驗程序如圖52。30特選課堂二、致病性大腸埃希氏菌的檢驗 致病性大腸埃希氏菌的檢驗應(yīng)按二、致病性大腸埃希氏菌的檢驗（一）、增菌培養(yǎng) 1、以無菌操作的方法稱取樣品25g，加入225ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，可用滅菌砂在研缽中磨碎或以均質(zhì)器打碎樣品。 2、取適量接種于乳糖膽鹽培養(yǎng)基中，測定大腸菌群MPN，其余移入500ml三角瓶中于361培養(yǎng)6小時。挑取一環(huán)，接種于一管30ml腸道菌增

15、菌肉湯中，42增菌培養(yǎng)18小時。31特選課堂二、致病性大腸埃希氏菌的檢驗（一）、增菌培養(yǎng) 31特選課堂二、致病性大腸埃希氏菌的檢驗（二）、分離培養(yǎng) 1、將乳糖膽鹽發(fā)酵陽性管液與增菌液分別劃線接種于麥康凱或伊紅美蘭瓊脂平板上。 2、于361培養(yǎng)1824小時觀察菌落對于污染嚴重的食品可直接按劃線法接種，不經(jīng)過增菌過程。不但要注意乳糖發(fā)酵的菌落，同時也要注意乳糖不發(fā)酵的菌落。32特選課堂二、致病性大腸埃希氏菌的檢驗（二）、分離培養(yǎng) 32特選課堂EMB平板照片及原理原理：伊紅美藍瓊脂平板含伊紅和美藍染料，在此亦作為指示劑。大腸菌群發(fā)酵乳糖造成酸性環(huán)境時，故可染上酸性染料伊紅，又因伊紅與美蘭結(jié)合（該兩種

16、染料即結(jié)合成復(fù)合物）使大腸菌群產(chǎn)生帶核心的、有金屬光澤的深紫色的（龍膽紫的紫色）陽性菌落，從菌落表面的反射光中還可看到綠色金屬閃光。在伊紅美蘭平板上的典型菌落呈紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常有金屬光澤。有的由于被檢樣品影響，亦呈現(xiàn)紫色、粉紫、中心灰紫、無黑心、濕潤等，常為大腸桿菌，均應(yīng)注意挑選。 33特選課堂EMB平板照片及原理原理：伊紅美藍瓊脂平板含伊紅和美藍染料，大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂平板上的特征 34特選課堂大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂平板上的特征 34特選課堂EMB培養(yǎng)基，上為E.coli，下為傷寒桿菌 35特選課堂EMB培養(yǎng)基，上為E.coli，下為傷寒桿菌 35特選課堂大腸桿菌

17、在麥康凱瓊脂（）的特征麥康凱瓊脂（）或伊紅美蘭（）瓊脂平板上，置培養(yǎng)小時，檢查有無疑似大腸桿菌菌落。大腸桿菌在麥康凱平板上的典型菌落呈鮮艷的桃紅、粉紅色.大腸埃希氏菌在麥康凱瓊脂平板上的特征 36特選課堂大腸桿菌在麥康凱瓊脂（）的特征麥康凱瓊脂（）大腸埃希氏菌在麥康凱瓊脂平板上的特征大腸埃希氏菌在麥康凱瓊脂平板粘稠菌落的特征37特選課堂大腸埃希氏菌在麥康凱瓊脂平板上的特征大腸埃希氏菌在麥康凱瓊脂沙門氏菌麥康凱瓊脂平板菌落不發(fā)酵乳糖38特選課堂沙門氏菌麥康凱瓊脂平板菌落不發(fā)酵乳糖38特選課堂二、致病性大腸埃希氏菌的檢驗（三）、生化試驗 1、選取在麥康凱或伊紅美蘭平板上發(fā)酵乳糖或不發(fā)酵乳糖的菌落5

18、個以上，分別接種于三糖鐵(TSI)或克氏雙糖鐵瓊脂(KI).同時將這些培養(yǎng)物分別接種蛋白胨水、半固體、尿素瓊脂、氰化鉀肉湯和賴氨酸脫羧酶實驗培養(yǎng)基。經(jīng)36培養(yǎng)18-24小時。棄去H2S陽性或尿素酶陽性或阿拉伯糖陰性的培養(yǎng)物。 2、TSI斜面產(chǎn)酸或不產(chǎn)酸,底層產(chǎn)酸, H2S陰性,氰化鉀陰性和尿素酶陰性的培養(yǎng)物為大腸埃希氏菌. TSI底層不產(chǎn)酸或 H2S、氰化鉀、尿素有任何一項為陽性的培養(yǎng)物，均非大腸埃希氏菌。必要時做氧化酶實驗或革藍氏染色鏡檢。39特選課堂二、致病性大腸埃希氏菌的檢驗（三）、生化試驗 39特選課堂40特選課堂40特選課堂枸椽酸鹽試驗原理及斜面照片枸椽酸鹽試驗：某些細菌能利用枸椽酸

19、鹽作為碳源，及磷酸銨作為氮源，將枸椽酸鹽分解為二氧化碳，培養(yǎng)基反應(yīng)后成堿性，由于指示劑的作用，培養(yǎng)基變?yōu)樘m色。大腸桿菌陰性,產(chǎn)氣桿菌陽性.41特選課堂枸椽酸鹽試驗原理及斜面照片枸椽酸鹽試驗：某些細菌能利枸椽酸鹽試驗原理及斜面照片42特選課堂枸椽酸鹽試驗原理及斜面照片42特選課堂大腸桿菌：MR + /VP -43特選課堂大腸桿菌：MR + /VP -43特選課堂注關(guān)于大腸桿菌的反應(yīng)的說明 大腸桿菌試驗的模式反應(yīng)，在一般情況下應(yīng)為“”或?qū)ⅰ啊币舶ㄔ趦?nèi)，共代表了絕大多數(shù)大腸桿菌（占）的實際反應(yīng)結(jié)果，因而受到了國際上的廣泛承認，并將其列為大腸桿菌的常規(guī)鑒別反應(yīng)公式。但個別大腸桿菌的反應(yīng)，也可能出現(xiàn)“

20、”和“”等等異?，F(xiàn)象。由于這種異常反應(yīng)出現(xiàn)的頻率極少，沒有普遍性的代表意義，因而在分類鑒別和統(tǒng)計學(xué)上，可以忽略不計。 44特選課堂注關(guān)于大腸桿菌的反應(yīng)的說明 44特選課堂致病性大腸埃希氏菌的檢驗（四）血清學(xué)試驗 假定試驗： 從平板上選菌落生長稠密處挑取培養(yǎng)物，用致病性大腸埃希氏菌、侵襲性大腸埃希氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌多價O血清和出血性大腸埃希氏菌O157血清做玻片凝集試驗。不凝集的培養(yǎng)物可做陰性報告。當與某一種多價O血清凝集時,再與該多價血清所包含的單價血清做實驗,如與某一種單價O血清呈現(xiàn)強烈的凝集反應(yīng),即為假定實驗陽性.不凝集的培養(yǎng)物可做陰性報告。45特選課堂致病性大腸埃希氏菌的檢驗（四

21、）血清學(xué)試驗 45特選課堂致病性大腸埃希氏菌的檢驗（四）血清學(xué)試驗 證實試驗： 制備O抗原懸液,稀釋血清.稀釋血清與抗原懸液在10mm75mm試管內(nèi)等量混合,做試管凝集試驗. （五）、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌毒素試驗 1、動物試驗 將經(jīng)過生化證實試驗的大腸埃希氏菌培養(yǎng)物接種肉湯管，于36+1培養(yǎng)24小時，3000轉(zhuǎn)分離心30分鐘。取上清液用G6濾器過濾后分作兩份，一份加熱6030分鐘，供ST測定用，另一份不加熱，供LT測定用。46特選課堂致病性大腸埃希氏菌的檢驗（四）血清學(xué)試驗 46特選課堂致病性大腸埃希氏菌的檢驗（五）、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌毒素試驗 1、動物試驗 1）家免結(jié)軋回腸段試驗：取體重為

22、2kg的家兔，禁食使腸內(nèi)容物排空。麻醉后剖腹，取出回腸段，按10-15cm為一段，分段結(jié)扎，取一段注射肉湯2mL作為陰性對照，另一段注射已知產(chǎn)毒菌肉湯培養(yǎng)物的上清液2ml作為陽性對照。其他各段分別注射待試菌株肉湯培養(yǎng)物的濾液2mL。將腹壁縫合。 測定LT時，于注射后18小時剖腹檢查 測定ST時，于注射后6-8小時剖腹檢查 取出腸管分別抽取腸段的積液，測定其容量，并測定腸段的長度。積液量(mL)與腸段長度(cm)之比大于l者為陽性。47特選課堂致病性大腸埃希氏菌的檢驗（五）、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌毒素試驗（五）、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌毒素試驗 1、動物試驗 2）乳鼠灌胃試驗：將被檢菌株接種于Hond

23、a氏產(chǎn)毒肉湯內(nèi),36度培養(yǎng)24小時,離心,取上清夜,注入1-4日齡乳胃內(nèi),禁食3-4小時,麻醉,取出腸管,稱量腸管(包括積液)質(zhì)量及剩余體質(zhì)量,二者之比大于0.09陽性,0.07-0.09為可疑.致病性大腸埃希氏菌的檢驗48特選課堂（五）、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌毒素試驗 致病性大腸埃希氏菌的檢致病性大腸埃希氏菌的檢驗（五）、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌毒素試驗 2、雙向瓊脂擴散試驗: 將被檢菌按5點環(huán)形接種于Elek氏培養(yǎng)基上，以同樣操作共做兩份，361培養(yǎng)48小時，在每株菌的菌苔上各放一片多粘菌素紙片，36+1經(jīng)56時，使抗生素滲入瓊脂中，在五點環(huán)形菌苔各5mm處的中央，挖一個直徑4mm的園并用一滴瓊脂墊底。在一