光鏡組織化學(xué)樣品的制備1課件

1、光鏡組織化學(xué)樣品的制備作者：第一組 切片的制備取材 固定（組織學(xué)和組織化學(xué)的主要不同）沖洗脫水透明透蠟包埋切片染色（組織學(xué)和組織化學(xué)的主要不同）封固取材動物的處死處死動物要求手法迅速、快捷，避免動物因過度痛苦而產(chǎn)生組織細(xì)胞的變化。頸椎脫臼法 （腦和脊髓，股動脈放血）根據(jù)實(shí)驗工作的目的選擇動物 取材應(yīng)根據(jù)實(shí)驗工作的目的選擇動物的種類、組織部位和材料大小。肝臟小鼠肝 （HE染色、PAS反應(yīng)、Feulgen反應(yīng)、檢測細(xì)胞骨架蛋白Tubulin-a）大白鼠腎、小腸（鈣鈷法的堿性磷酸酶 ）根據(jù)器官組織的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)選擇切面方向 肝縱橫切皆可，腎、小腸縱切為好。取材注意的問題1、樣品大小適當(dāng)（根據(jù)固定液和染色

2、方法來確定）。 光鏡樣品一般在1.0cm以內(nèi)（最大不超過2cm），電鏡樣品規(guī)格要求切成0.5-1.0cm3小塊。注意長、寬、高的比例。 注意樣品的定向；皮膚，腔道器官等一般剪成長條狀，較長時纏繞成同心圓狀2、低溫操作，防止自溶現(xiàn)象，通常以0-4的低溫條件下操作為佳。 新鮮組織如需保存，應(yīng)將所取組織用錫箔紙包好，放入液氮速凍，然后-70 保存3、部位準(zhǔn)確 對于病變組織要注意： 部位必須是主要病變區(qū)。 必須取病灶與正常組織的交界區(qū) 必要時取遠(yuǎn)離病灶的正常組織做對照4、避免人為因素刀剪銳利、潔凈 快速、準(zhǔn)確。 盡量保持生活狀態(tài)，力爭1分鐘之內(nèi)放入固定液，最遲不能超過3分鐘。避免人工損傷。 一刀切取，

3、切取應(yīng)在蠟板或濾紙上進(jìn)行，避免拉鋸、牽拉或擠壓等動作。固定（fixation）定義：將組織塊、制備細(xì)胞等經(jīng)過特殊的化學(xué)試劑（固定劑）作用，以保持組織和細(xì)胞的固有形態(tài)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成。非常重要的步驟，固定不當(dāng)無法修補(bǔ)。固定的目的：殺死活細(xì)胞或活組織，保持組織生前的形態(tài)結(jié)構(gòu)，保持結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分和活性。 1、抑制自溶 2、阻止溶解 3、防止腐敗 4、減少損傷 5、硬化組織 6、改變折光率 7、增加媒染作用，便于染色固定的注意事項固定的組織必須新鮮：及時固定固定液現(xiàn)配現(xiàn)用最為理想固定劑的用量：組織塊體積的15-50倍固定時間：根據(jù)材料的種類、性質(zhì)、大小和固定劑而定。固定的溫度：一般是低溫，特別是固定酶合

4、理選擇固定劑固定劑的性質(zhì)1、適應(yīng)固定的目的2、具有相當(dāng)?shù)拇┩噶?，迅速滲入組織和細(xì)胞，不改變其結(jié)構(gòu)。3、引起組織膨脹或收縮的作用要小。4、固定后，對組織有保存作用。 一般單一固定劑不能滿足所有條件，要根據(jù)固定標(biāo)本和目的選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌?。固定劑的選擇Carnoy液（氯仿300ML 冰醋酸100ML 95%酒精600ML）該固定液固定組織快速，在固定的同時兼有脫水的作用。溶液中的氯仿和酒精，對組織的收縮較厲害，但應(yīng)用了冰醋酸，這種現(xiàn)象便被中和去。水沖洗：流水沖洗12小時到一晝夜后，注意水流不宜太急，以免沖壞材料 脫 水 組織經(jīng)過固定后和洗滌后，含有大量水分，必須徹底去除，才利于透明與包埋脫水劑 -乙

5、醇將脫水劑配成各種濃度，自低濃度到高濃度循序進(jìn)行，否則會引起組織強(qiáng)烈的收縮和變形。注意事項：組織充分固定后方可脫水 脫水劑體積應(yīng)為組織塊體積的5-10倍 大小不一的組織塊分開脫水 70 8090(95）100（2次或3次） 組織在高濃度乙醇中停留時間不能過長，否則將會使組織脆化。二甲苯能溶于醇及醚，亦為石蠟溶劑，但不溶于水。它的透明力強(qiáng)，但組織塊在其中停留過久，容易收縮變硬變脆。1/3二甲苯+2/3乙醇混合液1/2二甲苯+1/2乙醇混合液2/3二甲苯+1/3乙醇混合液二甲苯二甲苯每級中停留時間，視組織塊大小而異，一般自30分鐘到2小時之間。在純二甲苯中應(yīng)更換二次，總的停留時間以不超過3小時為宜

6、。透明劑容積為組織塊的5-10倍如脫水不徹底，用二甲苯透明后，將發(fā)生下列不良后果：材料中仍留有微量水分，透明時，二甲苯進(jìn)不去，因此石蠟也不能透入，切片后將在蠟片中出現(xiàn)空洞，影響效果；如果組織塊在透明時呈白色渾濁不透明狀態(tài)時，則為脫水不徹底所致。此時應(yīng)返回重新脫水。封藏時，會發(fā)生乳白色云霧現(xiàn)象，鏡下觀察，可見許多密集水珠把組織掩蓋，切片作廢。注 意二甲苯極易揮發(fā)，長期接觸對呼吸道粘膜有較強(qiáng)的刺激作用。二甲苯極易吸收空氣中的水分，故在操作和保存過程中，要注意防止水分滲入二甲苯中。如用一、二滴石蠟油滴入其中，立即出現(xiàn)云霧狀，表示其中已含有水分，不能再用。 浸蠟和包埋讓石蠟支持劑滲透進(jìn)入組織內(nèi)部，使之

7、變硬，并將組織塊包埋進(jìn)去，利于切片，稱為浸蠟和包埋。包埋劑的要求1、完全浸透組織后，易從液態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)2、易透入組織，且不和組織細(xì)胞成分反應(yīng)3、變?yōu)楣虘B(tài)后，體積不發(fā)生明顯的變化4、具備良好的切割性質(zhì)5、染色前易去除6、價廉易得到石 蠟軟蠟：熔點(diǎn)52-56；硬蠟：熔點(diǎn)60-62 室溫高用硬蠟，室溫低用軟蠟新的石蠟應(yīng)反復(fù)融化、固化，排出空氣使用；舊的石蠟應(yīng)加熱使摻入的二甲苯揮發(fā)再用。包埋最重要的是溫度，包埋箱最好用隔水式電熱箱，電熱的稍差。包 埋樣品經(jīng)石蠟滲透后，其內(nèi)部間隙已完全被石蠟占據(jù)，此時還需要用同種硬度的石蠟包埋成蠟塊以利于后邊的切片，包埋可用相同的器具，也可折疊一牛皮紙盒。將液態(tài)石蠟緩緩倒

8、入紙盒中，再用鑷子輕輕將浸好蠟的組織塊夾入紙盒，擺好位置，待石蠟冷卻成固態(tài)即包埋完畢。我們可以看到： 水和酒精可以相溶。 酒精和二甲苯相溶。 二甲苯和石蠟可以相溶。 因為以上相鄰步驟所使用的液體均可以互溶，所以保證每一步驟液體能置換完全。 水和二甲苯不能相溶，乙醇和石蠟不能相溶，所以如果有一個步驟的處理不徹底，殘留的液體帶到下一個步驟將不能互溶，最終帶到滲蠟步驟中，成為細(xì)小的空洞，以至不能成為質(zhì)地致密的石蠟塊，也就切不成良好的切片。儀器及器材準(zhǔn)備1、切片機(jī) 2、切片刀 3、展片機(jī) 4、粘片劑 5、經(jīng)過清潔處理的載玻片 6、眼科彎鑷子 7、中號羊毫毛筆 8、酒精燈切片的貼附1、薄切片（小于7m）

9、可以不需貼附劑，要求載玻片干凈2、常用貼附劑：蛋白甘油切片過程 1、調(diào)節(jié)水溫至47左右(比熔點(diǎn)低5-6左右)； 2、固定蠟塊； 3、修整包埋面； 4、調(diào)節(jié)切片厚度； 5、切片：蠟帶應(yīng)連續(xù)、無缺、厚度均勻、無刀痕、開裂 6、展片； 7、烤片：60-62 30-60分鐘，再染色切片的注意事項1切片不能形成蠟帶：是室溫過低或石蠟過硬，蠟邊過小或不平所致，這時應(yīng)提高室溫，或在切片機(jī)旁點(diǎn)燃酒精燈。 2蠟帶彎曲：蠟塊上下不平行，刀鈍，蠟塊不與刀刃平行，均可產(chǎn)生此現(xiàn)象。 3蠟片卷起：刀口太鈍或不清潔，刀的角度過大或石蠟過硬，蠟片均會卷起。 4蠟片易粘在切片刀上或蠟片皺縮：室溫過高或石蠟太軟所致，用冷水或冰塊

10、冰一下即可。刀的角度過小，也能使切片皺縮。 5蠟片厚薄不一：刀或蠟塊沒有固定牢，切片機(jī)磨損或發(fā)生故障。 6蠟片出現(xiàn)裂隙或碎裂：組織浸蠟不足，或浸蠟溫度過高，或在透明劑中時間過久，組織已發(fā)脆。7蠟片出現(xiàn)縱裂口：刀有缺口或石蠟內(nèi)有硬物質(zhì)如鈣鹽物質(zhì)，或刀口不潔。HE染液制備1. 蘇木精染液（1） 稱取0.5g蘇木精、5.0g銨礬或鉀礬和0.1g碘酸鈉加溫溶于70ml蒸餾水中；（2） 加入30ml甘油和2ml冰乙酸充分混勻后過濾即成母液；（3） 母液可長期保存。用蒸餾水以1：20稀釋母液即成工作液。工作液也較長時間儲存，但每次染色前宜過濾，去除氧化膜；2. 伊紅染液伊紅有醇溶性與水溶性之分。將0.5g

11、伊紅溶于100ml 70%乙醇或蒸餾水即成工作液；Schiff試劑 配方-把0.05 g堿性品紅研細(xì),溶于含0.5 mL濃HCl的50 mL水中,再加入0.5 g Na2SO3固體,攪拌后,靜置,直到紅色褪去-為最佳配方. 配制過程比較復(fù)雜，一般可用半年，冰箱保存，用時恢復(fù)到室溫染色pH 24鈣鈷法的堿性磷酸血涂片 血涂片的顯微檢查是血液細(xì)胞學(xué)檢查的基本方法，臨床上應(yīng)用極為廣泛，制備厚薄適宜，分布均勻，染色良好的血涂片是血液學(xué)檢查的重要基本技術(shù)之一。 涂片法制片是生物顯微制片的基本方法之一。步驟可分5個步驟進(jìn)行消毒取血推片染色觀察消毒與取血 消毒 先按摩取血部位，使血流通暢；再用酒精消毒采血針和取血部位（如指尖）。 取血 待酒精干后，刺破皮膚，使血自然流出，勿擠。取干凈載片，讓血滴在離載片一端中45毫米處，注意手指持握載片的邊緣，勿觸及其表面。不能使載片接觸取血部位的皮膚推片 取一塊邊緣光滑的載片做推片。將其一端置于血滴前方，向后移動到接觸血滴，使血液均勻分散在推