CIK細(xì)胞免疫治療課件

1、CIK細(xì)胞免疫治療CIK細(xì)胞免疫治療課件1CIK細(xì)胞免疫治療CIK細(xì)胞免疫治療課件1我國腫瘤現(xiàn)狀癌癥對人類健康和生命的威脅很大，它和心血管疾患已成為醫(yī)學(xué)上的兩大難關(guān)，在全世界構(gòu)成死亡原因的頭兩位。全世界52億人口中，每年約有700萬人新患癌癥，每年約有500多萬人死于癌癥， 幾乎每6秒鐘就有一名癌癥患者死亡。我國目前每年平均約有150萬人新患癌癥，每年約有80萬人死于癌癥，其中肺癌、胰腺癌、肝癌、鼻咽癌、前列腺癌、惡性淋巴瘤等，近年來有上升的趨勢，由于防癌措施的普及，宮頸癌、睪丸癌癥、白血病等有下降的趨勢。 我國惡性腫瘤發(fā)病現(xiàn)狀及趨勢 中國腫瘤，2012.2CIK細(xì)胞免疫治療課件2我國腫瘤現(xiàn)狀

2、癌癥對人類健康和生命的威脅很大，它和心血管疾患腫瘤手術(shù)化療放療生物治療細(xì)胞因子治療免疫細(xì)胞治療基因治療分子靶向治療抗體治療CIK細(xì)胞免疫治療課件3腫瘤手術(shù)化療放療生物治療細(xì)胞因子治療免疫細(xì)胞治療基因治療分子The Three Phases of the Cancer Immunoediting ProcessDunn GP, et al. Immunity, Vol. 21, 137148, August, 2004CIK細(xì)胞免疫治療課件4The Three Phases of the Cancer生物治療的原理免疫系統(tǒng)是人體的防御體系，一方面發(fā)揮著清除細(xì)菌、病毒、外來異物的功能，另一方面消除

3、體內(nèi)衰老細(xì)胞以及發(fā)生突變的細(xì)胞(有的突變細(xì)胞會變成癌細(xì)胞)。機(jī)體免疫系統(tǒng)和癌細(xì)胞相互作用的結(jié)果決定了癌癥的最終演變。對于健康的人來說，其免疫系統(tǒng)的強(qiáng)大足以及時(shí)清除突變的癌細(xì)胞。但對于癌細(xì)胞病人來說，普遍存在免疫系統(tǒng)低下，不能有效地識別、殺滅癌癥細(xì)胞；另一方面，癌癥細(xì)胞大量增殖，會進(jìn)一步抑患者的免疫功能，而且，癌癥細(xì)胞有多種機(jī)制來逃脫免疫細(xì)胞的識別與殺傷，癌癥的免疫治療就是借助分子生物學(xué)技術(shù)和細(xì)胞工程技術(shù)，提高癌癥的免疫原性，給機(jī)體補(bǔ)充足夠數(shù)量的功能正常的免疫細(xì)胞和相關(guān)分子，激發(fā)和增強(qiáng)機(jī)體抗瘤免疫應(yīng)答，提高癌癥對機(jī)體抗癌癥免疫效應(yīng)的敏感性，在體內(nèi)、外誘導(dǎo)癌癥特異性和非特異味性效應(yīng)細(xì)胞和分子，達(dá)到

4、最終清除癌癥的目的。CIK細(xì)胞免疫治療課件5生物治療的原理免疫系統(tǒng)是人體的防御體系，一方面發(fā)揮著清除細(xì)菌Virchow,對腫瘤免疫滲透進(jìn)行了描述首次報(bào)道了異基因骨髓移植Burnet,腫瘤免疫監(jiān)視假說Coley,利用細(xì)菌產(chǎn)物治療癌癥Zinkernagel和Doherty, 發(fā)現(xiàn)MHC 限制性CD8+細(xì)胞識別Steinman發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞Bevan發(fā)現(xiàn)交叉遞呈首次研究膀胱癌BCGIL-2的首次研究首次研究癌細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移治療IFN在黑色素瘤中的首次研究Bosenberg和Boon，人類腫瘤相關(guān)抗原的表征利用TFN對黑色素瘤和肉瘤隔離灌注的首次研究Sakaguchi再次發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)Toll樣受體

5、的免疫功能黑色素瘤的清髓性化療和過繼性細(xì)胞轉(zhuǎn)移治療免疫調(diào)節(jié)劑被用于治療VINVIN中人類乳頭瘤病毒疫苗FDA批準(zhǔn)sipuleucel-T治療前列腺癌，批準(zhǔn)Ipilimumab治療黑色素瘤重要的基礎(chǔ)免疫發(fā)現(xiàn)和關(guān)鍵臨床試驗(yàn)?zāi)[瘤免疫治療的發(fā)展歷程CIK細(xì)胞免疫治療課件6Virchow,對腫瘤免疫滲透進(jìn)行了描述首次報(bào)道了異基因骨髓免疫細(xì)胞類型細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞 （CIK）腫瘤抗原致敏的樹突狀細(xì)胞（ DC）DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞混合培養(yǎng)誘導(dǎo)出來的細(xì)胞 （DC-CIK）腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）自然殺傷細(xì)胞（ NK）以上免疫細(xì)胞皆已臨床應(yīng)用介紹Introduction介紹 IntroductionCIK

6、細(xì)胞免疫治療課件7免疫細(xì)胞類型細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞 （CIK）介紹Intro細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK）CIK細(xì)胞是將人體外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子共同培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞，又被稱為NK細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞，兼具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活性和NK細(xì)胞非MHC限制性殺瘤優(yōu)點(diǎn)。CIK細(xì)胞具有以下特點(diǎn)：增殖能力強(qiáng)殺瘤活性強(qiáng)殺瘤譜廣對正常骨髓造血前體細(xì)胞毒性小CIK細(xì)胞的殺瘤機(jī)制：對瘤細(xì)胞直接殺傷誘導(dǎo)腫瘤凋亡活化后產(chǎn)生大量細(xì)胞因子的抑制殺瘤作用激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，提高機(jī)體免疫功能CIK細(xì)胞免疫治療課件8細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK）CIK細(xì)胞是將人體外周血單個(gè)CIK細(xì)胞的殺瘤機(jī)

7、制CIK細(xì)胞免疫治療課件9CIK細(xì)胞的殺瘤機(jī)制CIK細(xì)胞免疫治療課件9CIK細(xì)胞中的效應(yīng)細(xì)胞是CD3+和CD56+細(xì)胞，在正常人外周血中極其罕見，僅1%5%。 在體外經(jīng)多因子培養(yǎng)2到3周，CD3+CD56+細(xì)胞迅速增多，較培養(yǎng)前升幅可達(dá)1000倍以上。 CIK細(xì)胞治療屬于過繼細(xì)胞免疫療法，由于CIK細(xì)胞溶瘤作用是非MHC限制性的，即不受腫瘤組織類型的限制，因此對任何一種腫瘤均有殺傷作用，但對高抗原表達(dá)的癌癥療效最好。CIK細(xì)胞免疫治療課件10CIK細(xì)胞中的效應(yīng)細(xì)胞是CD3+和CD56+細(xì)胞，在正常人外CIK細(xì)胞免疫治療課件11CIK細(xì)胞免疫治療課件11CIK細(xì)胞免疫治療課件12CIK細(xì)胞免疫治

8、療課件12CIK細(xì)胞免疫治療課件13CIK細(xì)胞免疫治療課件13CIK細(xì)胞治療適應(yīng)癥CIK細(xì)胞治療適應(yīng)癥：主要用于惡性黑色素瘤、前列腺癌、腎癌、肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等。適應(yīng)人群：除個(gè)別針對兒童復(fù)發(fā)腫瘤治療外，患者年齡16歲；生活自理，卡氏評分60分；預(yù)計(jì)生存期3個(gè)月；簽署知情同意書；放化療結(jié)束2周以上（個(gè)別病例具體分析）。CIK細(xì)胞免疫治療課件14CIK細(xì)胞治療適應(yīng)癥CIK細(xì)胞治療適應(yīng)癥：CIK細(xì)胞免疫治療Karnofsky（卡氏，KPS，百分法）功能狀態(tài)評分標(biāo)準(zhǔn)體力狀況評分正常，無癥狀和體征100 能進(jìn)行正常活動，有輕微癥狀和體征90 勉強(qiáng)可進(jìn)行正?；顒?，有一些癥狀或體征80 生活可自理，

9、但不能維持正常生活工作70 生活能大部分自理，但偶爾需要別人幫助60 常需人照料50 生活不能自理，需要特別照顧和幫助40 生活嚴(yán)重不能自理30 病重，需要住院和積極的支持治療20 重危，臨近死亡10 死亡0 CIK細(xì)胞免疫治療課件15Karnofsky（卡氏，KPS，百分法）功能狀態(tài)評分標(biāo)準(zhǔn)體CIK細(xì)胞治療禁忌癥自身免疫性疾病患者T細(xì)胞淋巴瘤患者對治療中所用生物制劑過敏者懷孕或哺乳期婦女器官功能衰竭及臟器移植者不可控制的感染性疾病CIK細(xì)胞免疫治療課件16CIK細(xì)胞治療禁忌癥自身免疫性疾病患者CIK細(xì)胞免疫治療課件細(xì)胞治療示意圖CIK細(xì)胞免疫治療課件17細(xì)胞治療示意圖CIK細(xì)胞免疫治療課件1

10、7CIK細(xì)胞的體外來源血液的來源：患者自體血或家屬血（60ml）中心血站申請血庫血（濃縮白細(xì)胞1U）血液的檢查：血常規(guī)檢查、血凝四項(xiàng)等血型檢測-A/B/O、Rh血型檢測，自體血之外的必須血型匹配常見病毒檢測-HAV、HBV、梅毒、HIV等檢測CIK細(xì)胞免疫治療課件18CIK細(xì)胞的體外來源血液的來源：CIK細(xì)胞免疫治療課件18病人采血前注意事項(xiàng)病人清晨抽血前可以進(jìn)食，但勿食用油膩食物；抽血前不能輸液；抽血前病人沒有任何感染及心肺肝功能異常；手術(shù)病人術(shù)前取血；放、化療病人血象正常后取血；淋巴細(xì)胞絕對值0.8不能取血，0.8可以取血 。CIK細(xì)胞免疫治療課件19病人采血前注意事項(xiàng)病人清晨抽血前可以進(jìn)

11、食，但勿食用油膩食物；CIK細(xì)胞免疫治療課件20CIK細(xì)胞免疫治療課件20儀器：超凈臺或生物安全柜，離心機(jī)、水浴鍋、微波爐、天平、移液槍、顯微鏡準(zhǔn)備材料：剪刀、鑷子、培養(yǎng)瓶，離心管/架，5ml/10ml/25ml移液管，滴管試劑：CIK培養(yǎng)基，生理鹽水，硫酸慶大霉素，各種細(xì)胞因子等消毒用品：75%酒精，無菌紗布，酒精棉球CIK細(xì)胞免疫治療課件21儀器：超凈臺或生物安全柜，離心機(jī)、水浴鍋、微波爐、天平、移液分離PBMNC病人自體血或家屬血血庫血淋巴分離液密度梯度離心2000rpm，20min血漿單個(gè)核細(xì)胞分離液紅細(xì)胞吸出單個(gè)核細(xì)胞，生理鹽水洗滌23次，1500rpm，10min血漿于56 滅活3

12、0 min后，3000 rpm，10 min；4 保存?zhèn)溆肅IK細(xì)胞免疫治療課件22分離PBMNC病人自體血淋巴分離液血漿單個(gè)核細(xì)胞分離液紅細(xì)胞CIK細(xì)胞培養(yǎng)流程D0天補(bǔ)30 ml進(jìn)T75包被培養(yǎng)瓶24 h后加細(xì)胞因子，并補(bǔ)液至40 mlD4或D5天視細(xì)胞情況一擴(kuò)二或三，補(bǔ)液至每瓶120 mlD2天進(jìn)T175培養(yǎng)瓶補(bǔ)液至100 mlD6或D7天一擴(kuò)二D8或D9天一擴(kuò)二D9或D10天取樣送檢并擴(kuò)增一擴(kuò)二D10或D11天一擴(kuò)二D13或D14天回輸根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)情況補(bǔ)液20或30 ml回輸CIK細(xì)胞免疫治療課件23CIK細(xì)胞培養(yǎng)流程D0天補(bǔ)30 ml進(jìn)T75包被培養(yǎng)瓶24 CIK細(xì)胞回輸時(shí)的一些準(zhǔn)備工

13、作回輸前的準(zhǔn)備： 醫(yī)生填寫治療申請單，病人或家屬簽字知情同意書 護(hù)士核對科室、病人姓名、住院號、床號、血型等回輸時(shí)的注意事項(xiàng)： 用輸血器回輸，前15min緩慢滴注（2030滴/分鐘），無反應(yīng)后按60滴/min滴入，回輸過程中觀察患者有無其他反應(yīng)回輸后的注意事項(xiàng)： 回輸結(jié)束后，應(yīng)留院觀察2h左右CIK細(xì)胞免疫治療課件24CIK細(xì)胞回輸時(shí)的一些準(zhǔn)備工作回輸前的準(zhǔn)備：CIK細(xì)胞免疫治CIK細(xì)胞治療的副反應(yīng)及處理常見的副反應(yīng)：一過性發(fā)熱，常在輸入后4-8h內(nèi)發(fā)生，持續(xù)2- 8h；其它的副反應(yīng)：乏力和全身不適等，較少見；出現(xiàn)寒戰(zhàn)可肌注25mg異丙嗪。發(fā)熱的處理：體溫38.5，溫水擦浴，必要時(shí)肌肉注射20

14、mg苯海拉明或12.5mg非那根；回輸?shù)拇┐厅c(diǎn)如有紅腫、疼痛、皮溫升高、硬結(jié)予以50%Mg2SO4濕敷即可。CIK細(xì)胞免疫治療課件25CIK細(xì)胞治療的副反應(yīng)及處理常見的副反應(yīng)：CIK細(xì)胞免疫治療謝謝！CIK細(xì)胞免疫治療課件26謝謝！CIK細(xì)胞免疫治療課件26人體外周血單核細(xì)胞分離（SOP）操作步驟：50 ml離心管中加入15 ml淋巴細(xì)胞分離液；用吸管吸取血樣沿管壁緩慢加于淋巴細(xì)胞分離液液面上，注意此過程中不能把血液與分離液間的界面破壞，保持界面的清晰；配平后，于2000 rpm離心20 min；離心結(jié)束后，管內(nèi)液體分四層，從上到下分別為血漿、單核細(xì)胞、分離液和紅細(xì)胞，緩慢吸取上層血漿，置于離

15、心管內(nèi)于56 滅活30 min后，于3000 rpm離心10 min，4 保存?zhèn)溆脤⒌喂懿宓皆旗F層，吸取單核細(xì)胞至另一個(gè)離心管中，加入1#試劑50ml，于1500 rpm離心10 min；傾出上清液，再用1#試劑50 ml重懸細(xì)胞，洗滌23次；計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和測定細(xì)胞活力，備用；最后將清洗干凈的單核細(xì)胞轉(zhuǎn)入隔天已包被好的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。CIK細(xì)胞免疫治療課件27人體外周血單核細(xì)胞分離（SOP）操作步驟：CIK細(xì)胞免疫治療注意事項(xiàng)：整個(gè)過程要嚴(yán)格無菌操作；將血加入淋巴細(xì)胞分離液時(shí)，必須保持兩種液體界面清晰；用滴管吸取淋巴細(xì)胞層時(shí)，要掌握好力度，在細(xì)胞層上作各方向吸取，勿吸入其他層液體；操作應(yīng)輕柔

16、，細(xì)胞懸液要充分混勻，避免損傷細(xì)胞活力及丟失細(xì)胞。CIK細(xì)胞免疫治療課件28注意事項(xiàng)：CIK細(xì)胞免疫治療課件28CIK細(xì)胞制備（SOP）取血庫濃縮白細(xì)胞血1U（或自體血60 ml）；用人淋巴細(xì)胞分離液，11或11.5分離單核淋巴細(xì)胞，2000 rpm離心20 min，取上層血漿至另一50 ml離心管內(nèi)，于56 滅活30 min，3000 rpm離心10 min，4 保存?zhèn)溆茫晃“篆h(huán)層單核淋巴細(xì)胞，置50 ml離心管內(nèi)，用1號試劑，洗滌23次，2000 rpm離心10 min；用2號試劑調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2-3106/ml；加入已包被CIK-1的75 cm細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，每瓶30 ml；24 h后，補(bǔ)加培養(yǎng)基10 ml（內(nèi)含CIK-3、CIK-4、CIK-5各一支）；再培養(yǎng)2448 h后，視細(xì)胞狀態(tài)用CIK培養(yǎng)基，將細(xì)胞一擴(kuò)二培養(yǎng)；CIK細(xì)胞免疫治療課件29CIK細(xì)胞制備（SOP）取血庫濃縮白細(xì)胞血1U（或自體血608. 以后每23 d傳代一次。10 d后，取細(xì)胞懸液送外檢（檢測細(xì)菌、真菌、支原體，結(jié)果為陰性方可用）；9. 14 d后，收集細(xì)胞，用于細(xì)胞治療；10. 收集治療：將生長旺盛的CIK細(xì)胞，收集，離心，留樣并進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，洗滌23次，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)和測定細(xì)胞活力（每次輸入細(xì)胞數(shù)要2109