分子生物學技術(shù)-第十章 感染性疾病的分子診斷

1、第十章 感染性疾病的分子診斷Molecular diagnosis for infectious diseases感染的慨念 感染是病原體和人體之間的相互作用過程 病原體：衣原體、螺旋體、病毒、細菌、真菌、原蟲、寄生蟲 病原微生物：致病菌（條件致病菌）微生物人體微生物人體不同的感染狀態(tài)共生狀態(tài)在正常情況下，人體的一些腔道和體表均有微生物寄生 感染后果（轉(zhuǎn)歸） 病原體被清除 - 通過非特異性或特異性免疫隱性感染 - 是感染過程中最常見的類型顯性感染（臨床感染） - 感染致病，慢性感染引起炎癥潛伏性感染潛伏感染期間，病原體一般不排出體外病原攜帶狀態(tài) - 可以沒有臨床癥狀，而能排出病原體帶病原體的種

2、類不同：帶病毒者、帶菌者與帶蟲者不同攜帶狀態(tài) 潛伏期攜帶者、健康攜帶者、急性與慢性攜帶者是很多傳染病的重要傳染源感染性疾病的分子診斷策略一般性策略（檢出病原體）：判斷有無感染是何種病原體感染常用方法：PCR 雜交完整性策略：檢出病原體分型（分類）亞型耐藥性常用方法：雜交、PCR、基因芯片、DNA測序感染性疾病分子診斷標志物病原體核酸分子（DNA/RNA）基因表達產(chǎn)物代謝物免疫應(yīng)答分子細胞免疫體液免疫TT致敏T細胞淋巴因子B漿細胞IgMIgGIgAIgDIgE感染早期出現(xiàn)臨近恢復期出現(xiàn)與原蟲和蠕蟲感染有關(guān)定性或定量檢測病原體的核酸，已經(jīng)用于病毒、細菌和寄生蟲感染的診斷動態(tài)、定量地檢測病原體核酸，

3、能對療效判斷和病情預后評價提供客觀的依據(jù)感染性疾病的分子診斷臨床價值第一節(jié) 病毒的基因檢測病毒核衣殼（nucleocapsid）包膜（envelope）刺突（spike）核酸（nucleic acid） DNA or RNA衣殼（capsid） 衣殼粒核酸蛋白質(zhì)衣殼第一節(jié) 病毒的基因檢測檢測病毒的方法血清學檢測病毒分離鑒定（診斷的金標準）PCR技術(shù)（檢出率最高） 第一節(jié) 病毒的基因檢測乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）全世界有3.5億慢性攜帶者，75%在亞太地區(qū)每年有一百萬人死于HBV感染，是全球范圍內(nèi)第9位死因中國：50%70%的人受過感染，8%10%是HBV攜帶者

4、 世界其它地區(qū)亞太地區(qū)75%75%的長期慢性攜帶者來自亞太地區(qū)第一節(jié) 病毒的基因檢測HBV在肝細胞內(nèi)的復制A(n)mRNAcccDNAHBsAg 包膜負鏈DNA包裹后的前基因 mRNA傳染性HBV病毒顆粒傳染性HBV病毒顆粒部分雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶肝 細 胞第一節(jié) 病毒的基因檢測HBV基因組結(jié)構(gòu)pre-S1 pre-S1 pre-S1蛋白 pre-S2 pre-S2蛋白 S HBsAg pre-C HBeAg C HBcAg P DNAP X HBxAg編碼HBsAgpre-S2S區(qū) C區(qū) P區(qū) X區(qū) 第一節(jié) 病毒的基因檢測基因重疊急性感染時期HBV的標志物第一節(jié) 病毒的基因檢測HB

5、V 檢測窗口期血清學（HBsAg）：56天PCR：33天縮短23天（平均6-15天）HBV 基因分型HBV基因序列差異的多少，可將HBV劃分為不同的基因型，至今為止已發(fā)現(xiàn)A、B、C、D、E、F、G、H共8種基因型：A型主要存在于白人，B型和C型主要存在于亞洲人群E型主要存在于西非F型僅見于中南美洲的土著人G型和H型很少見不同基因型序列長度不同，主要是前S1區(qū)的不同。我國流行的主要是B和C基因型，長江以北以C型為主，長江以南以B型為主，另又少量的A型、D型和混合型。西北和西南尤其是西北有較高比例的D型 第一節(jié) 病毒的基因檢測第一節(jié) 病毒的基因檢測HBV分子診斷方法擴增位置引物序列擴增片段大小(b

6、p)P、X基因特異片段5-ATACTGCGGAACTCCTAGC-32785-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3基因特異片段5-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-34775-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3基因特異片段5-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-32585-ATGGGATCCCTGGATGCTGGGTCTTCCAAA-3HBV DNA檢測（PCR）PCR 引物是PCR擴增的關(guān)鍵，決定擴增的特異性和敏感度。PCR引物常根據(jù)其S、C、P和X基因中的高度保守序列來設(shè)計。部分常用的引物序列1樣本處

7、理（樣本處理區(qū)）2核酸擴增2. 1 試劑配置（PCR前準備區(qū)）2. 2 加樣（樣本處理區(qū)）2. 3 PCR擴增（檢測區(qū)）HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）第一節(jié) 病毒的基因檢測試劑制備標本處理擴增檢測xxx第一節(jié) 病毒的基因檢測HBV耐藥檢測（ YMDD突變檢測方法）YMDD突變檢測方法1. 基因測序法2. 熒光定量PCR方法基本原理確定探針特定的TM值來區(qū)分是否突變常用方法覆蓋突變位點熒光雙探針雜交 YIDD YMDD YVDD46.91 54.64 50.74第一節(jié) 病毒的基因檢測HBV的分子診斷的臨床應(yīng)用早期診斷監(jiān)測治療效果（病毒拷貝數(shù)）判斷病情耐藥檢測第一節(jié) 病

8、毒的基因檢測丙型肝炎病毒（HCV）急性丙肝的臨床診斷1. 流行病學史：有輸血史、應(yīng)用血液制品史或明確的HCV暴露史。2. 臨床表現(xiàn)：全身乏力、食欲減退、惡心和肝區(qū)疼痛等，其他可有低熱，輕度肝腫大，脾腫大，黃疸。部分患者無明顯癥狀。3. 實驗室檢查：ALT多呈輕度和中度升高，抗-HCV和HCV RNA陽性。約90%的輸血后非甲非乙型肝炎和7080%的無輸血史的散發(fā)型非甲非乙型肝炎由HCV感染所致 第一節(jié) 病毒的基因檢測HCV血中HCV含量僅為HBV的千分之一HCV的細胞培養(yǎng)尚未成功，病毒的分離極為困難HCV的變異性很高，使其診斷十分困難HCV的免疫學標志僅有抗HCV一項，且由感染至抗體產(chǎn)生大約需

9、要70天，部分病人感染后始終都不形成抗體第一節(jié) 病毒的基因檢測HCV分子診斷技術(shù)尤為重要HCV基因組（單鏈RNA）呈球形顆粒直徑約50nm有一脂質(zhì)包膜核心：單股正鏈RNA，全長9.4 kb僅一個開放讀框（ORF），編碼一條含有3008 3037個氨基酸的病毒前體多肽 第一節(jié) 病毒的基因檢測HCV基因分型的多樣性由于HCV的RNA聚合酶的忠實性不高，所以引起HCV的基因型呈多樣性HCV分為6個（IVI）主要基因型（Simmonds），各型又由若干亞型（a、b、c）組成HCV RNA基因分型有助于判定治療的難易程度及制定抗病毒治療的個體化方案第一節(jié) 病毒的基因檢測HCV分子診斷HCV RNA定性定

10、性檢測方法：RT-PCRHCV RNA定性檢測的特異度在98%以上，只要一次病毒定性檢測為陽性即可確證HCV感染一次檢測陰性不能完全排除HCV感染，應(yīng)重復檢查 第一節(jié) 病毒的基因檢測擴增位置引物序列擴增片段大小(bp)5端高度保守區(qū)5-GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGT-32445-CTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT-35端非編碼區(qū)序列5-GCGACACTCCACCATAGAT-33195-GAATCGTGCTCATGGTGCA-35端非編碼區(qū)序列5-CTGTGAGGAACTACTGTCT-32705-ACTCGCAAGCACCCTATCA-3HCV分子診斷HCV

11、RNA定量（病毒載量測定）bDNAreal-time RT-PCR（SOP）1 樣本處理（樣本處理區(qū)）2 擴增試劑準備（PCR前準備區(qū)）3 加樣（樣本處理區(qū)） 4 RT-PCR反應(yīng)（檢測區(qū)）第一節(jié) 病毒的基因檢測human immunodeficiency virus（ HIV ）第一節(jié) 病毒的基因檢測全國累計報告HIV感染者地理分布1-100101-500501-10001001-50005001-1000010000HIV感染者數(shù)截至2005年12月底第一節(jié) 病毒的基因檢測HIV在宿主細胞中的復制Step 1: BindingStep 2: Reverse TranscriptionSte

12、p 3: IntegrationStep 4: ReplicationStep 5: TranslationStep 6: Viral Assembly第一節(jié) 病毒的基因檢測靶細胞：CD4+ T 細胞HIV基因組基因組為RNA雙分子，與其它逆轉(zhuǎn)錄病毒基本相同其正鏈RNA分子大小為 HIV-1 9.3 kb 有3 組共8個基因 HIV-2 9.7 kb 有3 組共9個基因5端有帽子結(jié)構(gòu)，3端有poly(A)結(jié)構(gòu) 第一節(jié) 病毒的基因檢測HIV基因組第一組：逆轉(zhuǎn)錄病毒共同的結(jié)構(gòu)基因和側(cè)翼末端重復順序（long terminal repeats） gag（group of antigen)基因：編碼核

13、心蛋白 pol （polymerase）基因：編碼逆轉(zhuǎn)錄酶，DNA聚合酶 env（envelop）基因：編碼包膜蛋白LTRs：不編碼任何蛋白，可起始其它病毒基因的表達，無種屬特異性第二組：參與基因表達的調(diào)節(jié)基因 tat（trans-acting transcriptional gene） rev（regulator of expression of viral protein） nef（negative regulator factor）第三組：負調(diào)控病毒的感染性，成熟或釋放的基因 vif（viral infectivity factor）vpu（viral protein U） vpr（vi

14、ral protein R）第一節(jié) 病毒的基因檢測HIV基因組遺傳變異率高高度變異區(qū)在env基因內(nèi)，相當于gp120的五個區(qū)段，gag和pol基因較少變異，是基因組的保守區(qū)域HIV疫苗研發(fā)難度大第一節(jié) 病毒的基因檢測HIV-1感染后病毒標志物的變化第一節(jié) 病毒的基因檢測窗口期：檢測抗體 2-12周檢測p24抗原 2-3周 檢測RNA 11天HIV檢測HIV抗體檢測（窗口期測p24抗原，可輔助診斷 ）初篩試驗：酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試紙（金標試紙，雙抗原夾心法）最短在感染6天之后就可以檢測到 確認試驗：免疫印跡（Western blot, WB）HIV RNA 測定（RT-PCR）第一節(jié)

15、 病毒的基因檢測擴增位置HIV基因檢測中部分常用的引物序列擴增片段大小gag基因5-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-33425-CCAGTAGGAGAAATCTATAAAA-3gag基因5-ATAATCCACCTATCCCAGATAGGAGAAATC-31155-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATCC-3pol基因5-TAGAATTCCTCAGATCACTCTT-33605-GCAAGCTTATGGGCCATCCATTCC-3HIV病毒載量（HIV RNA 定量）主要有三種技術(shù)：RT-PCR（最低檢測限為50copies/ml ）bDNA（最低檢測限為50cop

16、ies/ml）NASBA（最低檢測限為20 copies/ml）NASBA（nucleic acid sequence-based amplification）基于核酸等溫擴增技術(shù)PCR檢測前病毒DNA，對出生48h內(nèi)嬰兒的檢測敏感性為38%，出生14d嬰兒的檢測敏感性可為93%第一節(jié) 病毒的基因檢測 方法檢測范圍實驗內(nèi)標準差（lg）抗凝劑RT-PCR4102-5 0.15 0.33ACD/EDTAbDNA4102-50.08 0.33EDTANASBA4102-50.13 0.33ACD/EDTA/HEP分子診斷技術(shù)在很大程度上改變了感染性疾病的診斷方法適用于檢測不能或不易培養(yǎng)、生長緩慢的病原微生物，如結(jié)核分枝桿菌、蒼白螺旋體、病毒等；通過檢測細菌16SrRNA基因或?qū)ζ錅y序，對細菌進行種屬鑒定，并可能發(fā)現(xiàn)新菌種；進行病原體感染的早期診斷，確定感染病原體的類型；通過對病原體核酸的定量檢測動態(tài)監(jiān)測疾病進展；進行病原體感染的分子流行病學調(diào)查；對病原體進行基因分型；