總RNA提取-常用方案

1、試劑盒快速提取實(shí)驗(yàn)方法原理GTC和N-十二烷基肌氨酸鈉的聯(lián)合使用，將促使核蛋白復(fù)合體的解離，使RNA 與蛋白質(zhì)分離，并將RNA 釋放到溶液中。而進(jìn)一步從復(fù)合體中純化RNA ，則根據(jù)Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法進(jìn)行，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚將使RNA 進(jìn)入水相，這樣使其與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離。水相中的RNA 可用異丙醇沉淀濃縮。進(jìn)一步將上述RNA 沉淀復(fù)溶于GTC溶液中，接著用異丙醇進(jìn)行二次沉淀，隨后用乙醇洗滌沉淀，即可去除所有殘留的蛋白質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽，而RNA 中如含無(wú)機(jī)鹽，則有可能對(duì)以后操作中的一些酶促反應(yīng)產(chǎn)生抑制。實(shí)驗(yàn)材料 HYPERLI

2、NK /product/s?wd=%E5%BE%AE%E7%94%9F%E7%89%A9 t _blank 微生物 HYPERLINK /product/s?wd=%E5%8A%A8%E7%89%A9%E7%BB%86%E8%83%9E t _blank 動(dòng)物細(xì)胞 HYPERLINK /product/s?wd=%E6%A4%8D%E7%89%A9%E7%BB%84%E7%BB%87 t _blank 植物組織試劑、試劑盒 HYPERLINK /product/s?wd=RNA+%E6%8F%90%E5%8F%96%E8%AF%95%E5%89%82%E7%9B%92&t=3 t _blank

3、 RNA 提取試劑盒 HYPERLINK /product/s?wd=%E7%84%A6%E7%A2%B3%E9%85%B8%E4%BA%8C%E4%B9%99%E9%85%AF&t=3 t _blank 焦碳酸二乙酯 HYPERLINK /product/s?wd=%E4%B9%99%E9%86%87&t=3 t _blank 乙醇儀器、耗材 HYPERLINK /product/s?wd=%E6%81%92%E6%B8%A9%E6%B0%B4%E6%B5%B4&t=1 t _blank 恒溫水浴 HYPERLINK /product/s?wd=%E5%86%B7%E5%86%BB%E9%A

4、B%98%E9%80%9F%E7%A6%BB%E5%BF%83%E6%9C%BA&t=1 t _blank 冷凍高速離心機(jī) HYPERLINK /product/s?wd=%E7%B4%AB%E5%A4%96%E5%88%86%E5%85%89%E5%85%89%E5%BA%A6%E8%AE%A1&t=1 t _blank 紫外分光光度計(jì) HYPERLINK /product/s?wd=%E5%8F%96%E6%B6%B2%E5%99%A8&t=1 t _blank 取液器 HYPERLINK /product/s?wd=%E7%94%B5%E6%B3%B3%E4%BB%AA&t=1 t _b

5、lank 電泳儀 HYPERLINK /product/s?wd=%E7%94%B5%E6%B3%B3%E6%A7%BD&t=1 t _blank 電泳槽實(shí)驗(yàn)步驟一、細(xì)胞或組織破碎1. 微生物材料（1）發(fā)酵34天（或?qū)?shù)生長(zhǎng)期）的菌體，離心收集菌絲體（動(dòng)植物材料無(wú)需此步處理）。（2）用經(jīng)DEPC處理的水洗菌絲體23次，并盡量除去殘存的水。（3）加液氮充分研磨，使其成為粉末，以釋放RNA。（4）研磨后的樣品轉(zhuǎn)移至12 ml 變性液的容器中勻漿。2. 動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)材料 （適用的樣品量為細(xì)胞：108）（1）細(xì)胞或組織培養(yǎng)：按常規(guī)方法進(jìn)行。（2）深層懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的破碎。細(xì)胞收集：含一定濃度的細(xì)胞培養(yǎng)

6、液置于無(wú)菌離心管中，4，3 000 g 離心5分鐘。細(xì)胞洗滌：上步沉淀用25 ml 滅菌后冰凍的1PBS緩沖液洗滌，然后4，3 000 g 離心5分鐘。細(xì)胞破碎：在沉淀細(xì)胞中加入15 ml 預(yù)冷的變性液，用無(wú)菌處理過(guò)的勻漿器勻漿。3. 表面培養(yǎng)細(xì)胞的破碎（1）確定培養(yǎng)瓶數(shù)量，使選定的各培養(yǎng)瓶細(xì)胞累加后總量達(dá)108。（2）細(xì)胞收集：將培養(yǎng)液倒掉，用預(yù)冷的無(wú)菌PBS緩沖液洗滌一次，在培養(yǎng)瓶中加入8 ml 預(yù)冷變性液。（3）轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞溶解，此時(shí)可見粘度加大。（4）用無(wú)菌吸管將第一個(gè)培養(yǎng)瓶中的液體吸入第二個(gè)培養(yǎng)瓶，旋轉(zhuǎn)，溶解細(xì)胞，再吸入第三個(gè)培養(yǎng)瓶，以此類推。（5）直到將所選定的培養(yǎng)瓶全部洗滌

7、一次，然后從第一個(gè)培養(yǎng)瓶開始再加入4毫升上述變性液，將所有培養(yǎng)瓶洗一次。（6）將上述12 ml 含細(xì)胞的變性液轉(zhuǎn)移至一50 ml 無(wú)菌離心管中，勻漿破碎細(xì)胞。4. 植物組織破碎 （適用的樣品量為0.05 g 組織）（1）將600 ul 變性液置于1.5 ml 離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘。（2）將0.05 g 新鮮組織用液氮冰凍。（3）在液氮下，研磨組織塊。（4）待液氮揮發(fā)后，將上述分散的組織轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中。5. 動(dòng)物組織破碎 （適用的樣品量為1 g 組織）（1）將12ml 變性液置于50ml 離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘。（2）在上述管中加入1 g 新鮮或冰凍動(dòng)物組織，勻

8、漿粉碎。二、RNA 的抽提1. 在經(jīng)變性液勻漿的細(xì)胞或組織600 ul+60 ul pH4.0的2 M 乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩器。2. 600 ul 酚氯仿異戊醇（25241），徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒。3. 冰裕中1015分鐘，離心，4，10 000 g，20分鐘。4. 上層水相吸至無(wú)菌離心管中加等體積的異丙醇，-70，30分鐘沉淀RNA。5. 離心4，10 000 g，20分鐘。6. 沉淀RNA ，冷凍干燥15分鐘 ， RNA 沉淀重新溶于300 ul 變性液中，可振蕩（有時(shí)為了幫助溶解，可在65加熱，但時(shí)間應(yīng)極短）。7. 60 ul pH4.0的2 M 乙酸鈉徹底混勻，可用漩

9、渦振蕩器。8. 600 ul 酚氯仿異戊醇（25241），徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒。9. 冰裕中1015分鐘，離心，4，10 000 g，20分鐘。10. 上層水相吸至無(wú)菌離心管中。11. 等體積異丙醇二次沉淀（-70，30分鐘），75%乙醇洗沉淀，沉淀冷凍干燥。12. 復(fù)溶于去RNA 酶的水中（對(duì)于準(zhǔn)備長(zhǎng)期保存的RNA 可加入pH 5.0的乙酸鈉至終濃度為0.25 M，再加入2.5體積的乙醇，-70保存。）。 HYPERLINK javascript:void(0); 展開注意事項(xiàng)1. 研磨組織塊用于RNA 提取的樣品，必須是新鮮的細(xì)胞或組織，如采樣后，不能立即用于提取則樣品應(yīng)用液氮速

10、凍并貯于-70的冰箱中保存。2. 變性液及相應(yīng)的離心管需預(yù)冷。其他1. 變性液組成25 g異硫氰酸胍溶于33 ml CSB(42 mM pH4.0乙酸鈉、0.83%十二烷基肌氨酸鈉、0.2 mM -巰基乙醇)，65溶解，過(guò)濾滅菌，4預(yù)冷。2. 酸性酚配制55時(shí)，500 g酚溶入500 ml 50 mM，pH4.0乙酸鈉，混勻，靜止分層后，去上清，再反復(fù)加500 ml 50 mM，pH4.0乙酸鈉，直到pH4.1。氯化鋰提取法實(shí)驗(yàn)方法原理用高濃度尿素變性蛋白并抑制RNA 酶，用氯化鋰選擇沉淀RNA ，其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA ，具有快速簡(jiǎn)潔的長(zhǎng)處，但也存在少量DNA的污染及RN

11、A 得率不高，小RNA 片斷丟失的缺陷。實(shí)驗(yàn)材料 HYPERLINK /product/s?wd=%E5%BE%AE%E7%94%9F%E7%89%A9 t _blank 微生物 HYPERLINK /product/s?wd=%E5%8A%A8%E7%89%A9%E7%BB%86%E8%83%9E t _blank 動(dòng)物細(xì)胞 HYPERLINK /product/s?wd=%E6%A4%8D%E7%89%A9%E7%BB%84%E7%BB%87 t _blank 植物組織試劑、試劑盒 HYPERLINK /product/s?wd=%E6%B0%AF%E5%8C%96%E9%94%82&t=

12、3 t _blank 氯化鋰 HYPERLINK /product/s?wd=%E5%B0%BF%E7%B4%A0&t=3 t _blank 尿素 HYPERLINK /product/s?wd=Tris-HCL&t=3 t _blank Tris-HCL HYPERLINK /product/s?wd=EDTA&t=3 t _blank EDTA HYPERLINK /product/s?wd=SDS&t=3 t _blank SDS儀器、耗材 HYPERLINK /product/s?wd=%E6%81%92%E6%B8%A9%E6%B0%B4%E6%B5%B4&t=1 t _blank

13、恒溫水浴 HYPERLINK /product/s?wd=%E5%86%B7%E5%86%BB%E9%AB%98%E9%80%9F%E7%A6%BB%E5%BF%83%E6%9C%BA&t=1 t _blank 冷凍高速離心機(jī) HYPERLINK /product/s?wd=%E7%B4%AB%E5%A4%96%E5%88%86%E5%85%89%E5%85%89%E5%BA%A6%E8%AE%A1&t=1 t _blank 紫外分光光度計(jì) HYPERLINK /product/s?wd=%E5%8F%96%E6%B6%B2%E5%99%A8&t=1 t _blank 取液器 HYPERLIN

14、K /product/s?wd=%E7%94%B5%E6%B3%B3%E4%BB%AA&t=1 t _blank 電泳儀 HYPERLINK /product/s?wd=%E7%94%B5%E6%B3%B3%E6%A7%BD&t=1 t _blank 電泳槽實(shí)驗(yàn)步驟一、組織或細(xì)胞勻漿1. 對(duì)于大量組織或細(xì)胞，則每克組織或細(xì)胞加入510 ml 氯化鋰-尿素溶液，勻漿器高速勻漿2分鐘。2. 對(duì)于少量細(xì)胞（107個(gè)細(xì)胞/ml），則每克組織或細(xì)胞加入0.5 ml 氯化鋰尿素溶液手工勻漿，并轉(zhuǎn)移至Eppendof管中。二、純化1. 勻槳液在04放置4小時(shí)后，12 000 g 離心30分鐘。2. 取沉淀，

15、加入原勻槳液1/2體積的氯化鋰尿素溶液，重復(fù)步驟1。3. 沉淀用原勻漿液1/2體積的氯化鋰尿素溶液復(fù)溶后，加入等體積酚/氯仿/異戊醇在室溫放置1530分鐘并不時(shí)搖動(dòng)混勻，4 000 g 離心5分鐘。4. 取上層水相，加1/10倍體積的3 M 乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，-20放置1小時(shí)，5 000 g 離心。5. 70%乙醇洗沉淀一次，真空干燥。6. RNA 溶解液溶解沉淀，得RNA 。三、保存分裝，于-70保存。一步法實(shí)驗(yàn)材料 HYPERLINK /product/s?wd=RNA t _blank RNA試劑、試劑盒 HYPERLINK /product/s?wd=%E4%B9%

16、99%E9%85%B8%E9%92%A0&t=3 t _blank 乙酸鈉 HYPERLINK /product/s?wd=%E6%B0%AF%E4%BB%BF&t=3 t _blank 氯仿 HYPERLINK /product/s?wd=%E5%BC%82%E6%88%8A%E9%86%87&t=3 t _blank 異戊醇 HYPERLINK /product/s?wd=%E5%BC%82%E4%B8%99%E9%86%87&t=3 t _blank 異丙醇 HYPERLINK /product/s?wd=%E4%B9%99%E9%86%87&t=3 t _blank 乙醇 HYPERL

17、INK /product/s?wd=SDS&t=3 t _blank SDS HYPERLINK /product/s?wd=%E9%85%9A&t=3 t _blank 酚儀器、耗材 HYPERLINK /product/s?wd=%E7%A6%BB%E5%BF%83%E6%9C%BA&t=1 t _blank 離心機(jī) HYPERLINK /product/s?wd=%E5%88%86%E5%85%89%E5%85%89%E5%BA%A6%E8%AE%A1&t=1 t _blank 分光光度計(jì) HYPERLINK /product/s?wd=%E6%91%87%E5%BA%8A&t=1 t

18、_blank 搖床實(shí)驗(yàn)步驟1. 組織來(lái)源材料：100 ng 組織加1 l 變性液，在玻璃Teflon勻漿器中將其勻漿。2. 培養(yǎng)細(xì)胞：離心棄懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液或倒去單層培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)液（不需用生理鹽水洗滌），每107細(xì)胞加入1 ml 變性液，然后用吸管抽吸710次。3. 將勻漿移入5 ml 聚丙烯管子，加入0.1體積的2 mol/l pH4.0的乙酸鈉緩沖液，混勻。4. 加入1 ml 水飽和酚，混勻；再加入0.2體積的49：1氯仿/異戊醇。5. 混勻后0 4放置15 min。6. 于4用SS-34轉(zhuǎn)子10 000 g 離心20 min，將上層水相移入一個(gè)干凈試管中。7. 加入1 ml （等體積）異丙

19、醇-20放置30 min 沉淀RNA，于4 10 000 g 離心10 min。8. 將RNA溶解于0.3 ml 變性液，并移入1. 5 ml 微量離心管中，加0.3 ml 異丙醇,。9. -20放置30 min 沉淀，于4 10 000 g 離心10 min。10. 重懸RNA沉淀于75%乙醇，旋起沉淀，室溫放置1015 min，10 000 g 離心5 min。11. 真空干燥RNA 510 min，溶解沉淀于100200 l DECP此處理過(guò)的水或DEPC處理過(guò)的0.5%SDS，-70冰凍保存或保存在-20的乙醇中。CsCl法實(shí)驗(yàn)材料 HYPERLINK /product/s?wd=RN

20、A t _blank RNA試劑、試劑盒 HYPERLINK /product/s?wd=PBS&t=3 t _blank PBS HYPERLINK /product/s?wd=%E5%BC%82%E7%A1%AB%E6%B0%B0%E9%85%B8%E8%83%8D&t=3 t _blank 異硫氰酸胍 HYPERLINK /product/s?wd=CsCl&t=3 t _blank CsCl HYPERLINK /product/s?wd=DEPC&t=3 t _blank DEPC HYPERLINK /product/s?wd=%E6%97%A0%E6%B0%B4%E4%B9%99

21、%E9%86%87&t=3 t _blank 無(wú)水乙醇儀器、耗材 HYPERLINK /product/s?wd=%E6%B3%A8%E5%B0%84%E5%99%A8&t=1 t _blank 注射器 HYPERLINK /product/s?wd=%E7%94%B5%E6%B3%B3%E4%BB%AA&t=1 t _blank 電泳儀 HYPERLINK /product/s?wd=%E7%A6%BB%E5%BF%83%E6%9C%BA&t=1 t _blank 離心機(jī) HYPERLINK /product/s?wd=%E5%9F%B9%E5%85%BB%E7%AE%B1&t=1 t _blank 培養(yǎng)箱實(shí)驗(yàn)步驟一、 用于單層培養(yǎng)細(xì)胞1. 室溫下用PBS冼滌細(xì)胞，每平皿用5 ml，洗2次。2. 在不超過(guò)108細(xì)胞中加入異硫氰酸胍溶液，