《放線菌分類》課件

1、放線菌分類第一部分 總論2022/9/22第一節(jié) 概論一、放線菌在微生物系統(tǒng)學(xué)中的地位19世紀(jì)前曾將放線菌歸入真菌，后將其列于細(xì)菌中克拉西里尼科夫首先將放線菌放在植物界，原生植物門，裂殖菌綱，后有人將其列入原生生物界。1968年被歸于原核生物界。1978年Gibbens和Murray建議將原核生物界分為薄壁菌門、厚壁菌門、疵壁菌門、柔膜菌門，放線菌被包括在厚壁菌門在1989年出版的伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊，放線菌被劃分在原核生物界、厚壁菌門、分支菌綱、放線菌目2022/9/22通過對放線菌16SrRNA/rDNA序列分析，提出放線桿菌綱這一新的分類等級，并將放線桿菌綱分為5個亞綱。迄今，放線菌提升

2、為放線菌門，屬于原核生物界細(xì)菌域第14門，放線菌門僅有放線菌綱，放線菌綱有5個亞綱：醋酸菌亞綱、紅細(xì)菌亞綱、紅蝽菌綱、球桿菌亞綱、放線菌亞綱。放線菌亞綱有放線菌目和雙歧桿菌目。目前包括十個亞目，40個科、170多屬2022/9/22二、放線菌生物學(xué)的發(fā)展（一）、分子系統(tǒng)學(xué)從發(fā)現(xiàn)放線菌至今已有100多年歷史，放線菌分類學(xué)已由經(jīng)典分類、化學(xué)分類、發(fā)展到分子分類，從而建立放線菌分子系統(tǒng)學(xué)1942年鏈霉素的發(fā)現(xiàn)極大促進(jìn)放線菌分類學(xué)研究的開展，同時，一些經(jīng)典專著（放線菌的屬和種分類鑒定和描述）的出版標(biāo)志著放線菌分類學(xué)的形成。20世紀(jì)50年代發(fā)展起來的數(shù)值分類應(yīng)用在大量獨立的菌株歸群以至定種或更高類群的分

3、類，并取得廣泛成功。2022/9/22Cummins最早指出革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁化學(xué)組分是有用的化學(xué)分類特征。經(jīng)常使用的特異性化學(xué)特征包括：細(xì)胞壁化學(xué)組分、枝酸菌、脂肪酸、磷酸類脂、全細(xì)胞蛋白及核糖體蛋白電泳分析。20世紀(jì)70年代進(jìn)入了化學(xué)分類時期。20世紀(jì)80年代，Stackebradt等根據(jù)16SrRNA相似性、DNA-rRNA和DNA-DNA雜交結(jié)果，描繪了放線菌和其他生物之間的系統(tǒng)發(fā)育樹，這標(biāo)志著放線菌分類學(xué)分子分類時期的開始。也稱之為基因型分類。目前，以分子系統(tǒng)學(xué)為核心，綜合微生物多種不同信息（表型、基因型、系統(tǒng)發(fā)育信息），來研究微生物系統(tǒng)進(jìn)化的多相分類方法已成為研究放線菌各級分類單位

4、的最有效手段。2022/9/22（二）分子生態(tài)學(xué)伴隨著放線菌分類學(xué)的發(fā)展，放線菌生態(tài)學(xué)的研究由萌芽時期、發(fā)展時期進(jìn)入到分子生物學(xué)時期，產(chǎn)生了放線菌分子生態(tài)學(xué)。放線菌分子生態(tài)學(xué)的研究內(nèi)容目前主要是采用分子生物學(xué)技術(shù)，研究不同自然環(huán)境中放線菌的多樣性、分布狀況、及它們的數(shù)量動態(tài)。應(yīng)用于放線菌分子生態(tài)學(xué)研究的方法大致分兩類：全程rRNA分析法和DNA指紋分析法2022/9/22（三）分子遺傳學(xué)1、分子遺傳學(xué)發(fā)展過程早在20世紀(jì)50年代初期放線菌遺傳學(xué)研究工作就已展開。放線菌分子遺傳學(xué)伴隨著鏈霉菌分子遺傳學(xué)的發(fā)展主要經(jīng)歷了體內(nèi)研究、體外研究和計算機虛擬遺傳學(xué)研究3個階段。2022/9/222、次生代謝

5、分子調(diào)控近期研究認(rèn)為，各種次生代謝產(chǎn)物充當(dāng)著基因調(diào)控作用。放線菌次生代謝的分子遺傳學(xué)是目前工業(yè)微生物最為活躍的研究領(lǐng)域之一。這主要表現(xiàn)在以下兩方面：第一，理論研究上的價值第二，放線菌次生代謝產(chǎn)物合成機制的研究受到廣泛重視，越來越多的次生代謝產(chǎn)物合成及調(diào)控基因被復(fù)制。2022/9/22（四）生物信息學(xué)目前生物信息學(xué)用于放線菌研究的主要內(nèi)容為以下幾個方面1、獲取不同放線菌的完整基因組2、發(fā)現(xiàn)新基因和新的單核苷酸多態(tài)性3、基因組中非編碼蛋白質(zhì)區(qū)域的結(jié)構(gòu)和功能研究4、在基因組水平研究放線菌系統(tǒng)進(jìn)化5、放線菌次生代謝藥物的設(shè)計和改造2022/9/22三、放線菌生物技術(shù)的發(fā)展（一）分離培養(yǎng)和純化技術(shù)近年來

6、，國內(nèi)外科學(xué)家正在開展一種從自然生態(tài)環(huán)境中選擇性分離放線菌的分離技術(shù)。非鏈霉菌或稀有放線菌作為新的生理活性物質(zhì)的重要來源成為關(guān)注的熱點。Colwell 實驗室在1982年提出活的但不可培養(yǎng)微生物的概念，他們發(fā)現(xiàn)將霍亂弧菌和大腸埃希菌（簡稱大腸桿菌）轉(zhuǎn)到不含營養(yǎng)物質(zhì)的鹽水中，經(jīng)常長時間的低溫保存，細(xì)菌會進(jìn)入一種數(shù)量不減、有代謝活力、但在正常試驗室培養(yǎng)條件下不能生長產(chǎn)生菌落的狀態(tài)，稱為活的但不能培養(yǎng)（viable but nonculturable, VBNC）2022/9/22分子生物學(xué)研究表明，之所以絕大多數(shù)包括放線菌在內(nèi)的微生物未被發(fā)現(xiàn)，主要原因在于收分離條件和技術(shù)的限制，因此，分離技術(shù)仍然

7、是放線菌生物學(xué)研究中的重大課題，同時也是擴大菌種來源必須要解決的問題。2022/9/22（二）基因工程技術(shù)目前基因工程技術(shù)在放線菌產(chǎn)生抗生素方面的應(yīng)用主要有以下途徑1、抗生素生物合成基因簇有關(guān)基因的克隆2、利用組合生物技術(shù)產(chǎn)生新的抗生素3、通過激活抗生素的沉默基因獲得新的抗生素4、利用基因重組技術(shù)改良抗生素的生產(chǎn)菌。2022/9/22四、放線菌資源的開發(fā)與利用（一）放線菌生物多樣性1、陸生放線菌的多樣性2、海洋放線菌的多樣性3、植物內(nèi)生放線菌2022/9/22（二）放線菌物種多樣性由于防線菌的生態(tài)多樣性，決定了它為適應(yīng)多變環(huán)境，發(fā)生遺傳變異形成的物種多樣性。因此放線菌還有極其豐富多樣的未知世界

8、等待人們?nèi)グl(fā)現(xiàn)。（三）代謝產(chǎn)物多樣性目前已發(fā)現(xiàn)的數(shù)萬種微生物來源的生物活性物質(zhì)中，約70%是由放線菌所合成的次級代謝產(chǎn)物。其中，以抗生素最引人注目。商業(yè)上新放線菌=新天然產(chǎn)物=商業(yè)成功2022/9/22目前世界上已報道了大約8個科24個屬約200個樹種具有與弗蘭克氏菌共生結(jié)瘤固氮的能力，我國約有6科8屬88個種。與弗蘭克氏菌共生結(jié)瘤固氮的非豆科植物是一種重要的固氮資源。2022/9/22（五）活的但不能培養(yǎng)的放線菌資源 不能培養(yǎng)的放線菌資源如同可培養(yǎng)放線菌資源類似，主要存在形式與應(yīng)用前景有：1、基因，尤其是編碼功能蛋白的基因2、代謝產(chǎn)物，如具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，尤其是各類先導(dǎo)化合物3、特

9、殊代謝途徑，如合成和分解，利用某些特殊化合物的新代謝途徑，用于生物降解等4、新的代謝調(diào)控機理，如用于篩選或者構(gòu)建高產(chǎn)或高活性菌5、具有不同生態(tài)功能的微生物活細(xì)胞等，如生物膜用于污水處理，污染或破壞的微生物生態(tài)系統(tǒng)的修復(fù)6、人工構(gòu)建的、可用于科研與生產(chǎn)的細(xì)胞。2022/9/22（六）極端環(huán)境中的放線菌資源1993年 在德國召開第一界極端環(huán)境微生物生物技術(shù)會議，國際上對極端環(huán)境微生物研究工作有了進(jìn)一步進(jìn)展1997年創(chuàng)刊的極端微生物雜志發(fā)刊詞中，極端微生物成為一個新的微生物世界就整個極端環(huán)境微生物的研究而言，對放線菌的研究還遠(yuǎn)不如細(xì)菌。如果說我們知道的放線菌種類不到實有數(shù)的10%，那極端環(huán)境就不會有

10、1%極端條件放線菌必然有特殊的生物學(xué)特征，產(chǎn)生特殊的產(chǎn)物，最值得研究的是從他們中開發(fā)藥物，特殊酶、或用于環(huán)境治理的功能菌株。2022/9/22第二節(jié) 放線菌系統(tǒng)分類學(xué)的過去和現(xiàn)在一、國外概況1、歷史及著名研究單位最早描述放線菌的學(xué)者Cohn，他自人淚腺感染病灶中分離到一株絲狀病原菌鏈絲菌。而后Harz建立了放線菌屬。美國新澤西農(nóng)業(yè)試驗站，Rutgers大學(xué)微生物研究所1942年發(fā)現(xiàn)鏈霉素。放線菌的屬和種分類鑒定和描述，放線菌分類學(xué)開始形成。整個70年代是放線菌化學(xué)分類時代構(gòu)建放線菌系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)入分子分類時代2022/9/22據(jù)了解，目前放線菌分類做得最出色的是德國國家菌種保藏中心（DSMZ）

11、，以Stackebrandt教授為首的實驗室。另一著名實驗室英國紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)Goodfellow實驗室。放線菌分類的先驅(qū)單位Waksman微生物研究所。韓國生命科學(xué)與生物技術(shù)研究院，僅從微生物分類而言，韓國也可算是一個大國。2022/9/222、國外放線菌分類研究的特點：（1）仍有新的放線菌分類單位不斷被發(fā)現(xiàn)（2）一些實驗室把工作重點放在利用綜合手段搞清已有菌種的歸屬以及各屬、各種之間關(guān)系，從更高層次理清放線菌本身，放線菌與其他細(xì)菌的關(guān)系。2022/9/22二、國內(nèi)概況放線菌分類學(xué)奠基人閻遜初院士。70年代前對放線菌的研究幾乎都集中在中科院微生物研究所，集中在鏈霉菌屬。70年代后開展化學(xué)分類，

12、分類的范圍也擴大到稀有放線菌。閻遜初1992年出版的放線菌分類和鑒定集我國放線菌分類之大成，是放線菌分類工作者的必備參考書之一。2004年，劉志恒、姜成林等編著的放線菌現(xiàn)代生物學(xué)與生物技術(shù)較全面的闡述了放線菌生物學(xué)的基本問題，對我國放線菌生物學(xué)科的建立奠定了基礎(chǔ)。2022/9/22三、幾個值得重視的問題1、在以rRNA為主的分子分類已經(jīng)比較普及的今天，應(yīng)按照系統(tǒng)學(xué)的要求，吸取基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)及其他學(xué)科最新成就，建立完善細(xì)菌分類系統(tǒng)，使系統(tǒng)學(xué)更能反映生物進(jìn)化的本來面目和生物之間的真實關(guān)系。2、從我國學(xué)者發(fā)表論文和內(nèi)容來看，發(fā)現(xiàn)少創(chuàng)新少，大多沿用或改進(jìn)國外分類系統(tǒng)和方法進(jìn)行的工作。

13、3、現(xiàn)行雜交方法有較大誤差，應(yīng)該探索新途徑。4、特定類群的快速鑒定5、及時擴大研究范圍6、設(shè)計新的獨特的分離方法分離未知菌，才能不斷提供新的菌種資源。2022/9/22作業(yè)三：放線菌資源的開發(fā)與利用（任選其一簡述）什么叫放線菌？為什么在分類上將其歸為原核微生物？ 如何理解“放線菌是介于細(xì)菌與絲狀真菌間而更接近細(xì)菌的一類微生物”？ 預(yù)習(xí)：放線菌形態(tài)特征和培養(yǎng)特征（包括基內(nèi)菌絲、氣生菌絲、孢子絲、孢子形態(tài)特征及培養(yǎng)基上菌落培養(yǎng)特征）2022/9/22放線菌(Actinobacteria)是一類革蘭氏陽性細(xì)菌，曾經(jīng)由于其形態(tài)被認(rèn)為是介于細(xì)菌和霉菌之間的物種。它們具有分支的纖維和孢子，依靠孢子繁殖，表

14、面上和屬于真核生物的真菌類似，從前被分類為“放線菌目”(Actinomycetes)。但因為放線菌沒有核膜，且細(xì)胞壁由肽聚糖組成，和其它細(xì)菌一樣。目前通過分子生物學(xué)方法，放線菌的地位被肯定為細(xì)菌的一個大分支。放線菌用革蘭氏染色可染成紫色（陽性），和另一類革蘭氏陽性菌厚壁菌門相比，放線菌的GC含量較高。2022/9/22放線菌屬于(C)。A真菌單細(xì)胞的原始生物C多細(xì)胞的細(xì)菌D低等植物放線菌的菌絲可以分為(B)。A營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞B.營養(yǎng)菌絲和氣生菌絲C營養(yǎng)體和孢子體D營養(yǎng)菌絲和孢子枝2022/9/22第三節(jié) 形態(tài)特征和培養(yǎng)特征在分類中的意義一、放線菌的基本形態(tài)1、基內(nèi)菌絲：又稱營養(yǎng)菌絲或者初級

15、菌絲，深入培養(yǎng)基內(nèi)或生長在培養(yǎng)基表面，主要功能為吸收營養(yǎng)物。顯微鏡下，基內(nèi)菌絲比氣生菌絲細(xì)，多分枝，透明，顏色較淺。直徑一般為0.4-1.2微米，大多數(shù)類群不形成橫隔也不斷裂。少數(shù)類群（如諾卡氏菌）基內(nèi)菌絲劇烈彎曲成樹根狀，生長到一定階段形成橫隔，并斷裂成不同形狀的斷裂小體，束絲放線菌屬的基內(nèi)菌絲纏扭成菌絲束。有些菌屬的基內(nèi)菌絲纏繞形成菌核。2022/9/22基內(nèi)菌絲有白、黃、橙、紅、綠、藍(lán)、紫、褐、黑等不同顏色，有些還產(chǎn)生水溶性或者脂溶性色素。放線菌基內(nèi)菌絲顏色及是否產(chǎn)生可溶性色素是定種的重要依據(jù)。2、氣生菌絲：氣生菌絲是基內(nèi)菌絲發(fā)育到一定階段，向空氣中生長的菌絲體。顯微鏡下，氣生菌絲一般比

16、基內(nèi)菌絲顏色深，且比基內(nèi)菌絲略粗。各種放線菌能否形成氣生菌絲，取決于物種特性、營養(yǎng)條件或環(huán)境等環(huán)境。3、孢子絲：放線菌生長到一定階段，在其氣生菌絲上分化了形成孢子的菌絲，為孢子絲。孢子絲成熟后多以橫隔分裂的方式形成孢子和孢子鏈。孢子鏈形狀有直生，波曲、螺旋或者輪生等不同形狀。螺旋圈數(shù)和疏密程度隨種而異。孢子鏈的長短、形狀、著生位置、顏色是定種的依據(jù)之一。2022/9/222022/9/224、孢子放線菌孢子形成方式有三種(1)基內(nèi)菌絲的胞壁產(chǎn)生隔膜，形成孢子，如小單孢菌。(2）有鞘菌絲的胞壁長生隔膜而成，孢子壁是母菌絲的壁，如鏈霉菌。（3）孢子在母菌絲內(nèi)形成，又在其外形成孢子壁，母菌絲破壁釋放

17、孢子，稱為內(nèi)生孢子，如高溫放線菌。放線菌孢子有球形、卵形、瓶形、柱形、臘腸狀、或者瓜子狀。表面結(jié)構(gòu)有光滑、褶皺、瘤狀、鱗片狀、刺狀、毛發(fā)狀，有些孢子還有鞭毛，極生或者周生。孢子類型、形狀、著生位置、排列方式、孢子多少有無鞭毛表面結(jié)構(gòu)特征都是重要的分類依據(jù)。2022/9/222022/9/225、孢囊：有些生孢囊放線菌會形成典型的孢囊，孢囊著生位置因?qū)俣悺Ｓ械逆吣疑L在氣絲上，有的生長在基絲上。孢囊形成大體分兩種形式：孢子絲纏繞而成；孢囊梗逐漸膨大產(chǎn)生。孢囊有圓形、棒狀、指狀、瓶裝等不同形狀，外圍都有囊壁，無囊壁的為假孢囊孢囊內(nèi)原生質(zhì)分化為孢囊孢子。帶鞭毛遇水游動，反之無。孢囊著生位置、形狀、

18、孢囊孢子有無鞭毛都是劃分屬的重要依據(jù)2022/9/22分生胞子鏈2022/9/22二、放線菌形態(tài)特征培養(yǎng)特征的穩(wěn)定性1、形態(tài)特征放線菌的形態(tài)受基因調(diào)控，一般相當(dāng)穩(wěn)定，因此形態(tài)特征作為重要的分類依據(jù)。但是一些“器官”的發(fā)育與形成早遲、多少甚至有無與培養(yǎng)條件有關(guān)，因此，進(jìn)行放線菌分類必須要進(jìn)行形態(tài)特征和培養(yǎng)特征的相關(guān)實驗。通常用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲和孢子的基本形態(tài)。用掃描電鏡觀察菌絲和孢子的表面結(jié)構(gòu)。用透視電鏡觀察孢子鞭毛的超顯微結(jié)構(gòu)?？捎寐衿ㄓ^察形態(tài)為避免細(xì)胞變形，可采用臨界點干燥處理。2022/9/222、培養(yǎng)特征：指在各種培養(yǎng)基上的生長征狀。一般以孢子、氣生菌絲、基內(nèi)菌絲的顏色和可溶性色素的

19、有無、不同培養(yǎng)基上的生長狀況作為主要特征。一定要嚴(yán)格按照國際公認(rèn)的實驗方法進(jìn)行2022/9/22第四節(jié) 放線菌生理生化特征一、生理生化實驗的內(nèi)容對溫度的適應(yīng)性對PH的適應(yīng)性對滲透壓的適應(yīng)性對氮源的利用能力對碳源的利用能力及產(chǎn)酸對生長因子的需要需氧性對抗生素及抑菌劑的敏感性抗菌活性代謝產(chǎn)物酶學(xué)特征2022/9/22二、實驗方法工作步驟1、獲得該種微生物的純培養(yǎng)物2、測定一些列必要的鑒定指標(biāo)（不同微生物有不同鑒定指標(biāo)）3、查找權(quán)威性鑒定手冊和刊物及相關(guān)網(wǎng)站信息2022/9/22（一）ph、溫度和Nacl等耐受性實驗培養(yǎng)基：Bennett瓊脂培養(yǎng)基或YIM38#培養(yǎng)基培養(yǎng)條件：28培養(yǎng)7d、14d記

20、錄、10培養(yǎng)時2、4周記錄Ph實驗用液體培養(yǎng)基，測試PH2.0-12.0供試菌株生長情況，以確定菌株生長PH范圍及最適PH溫度試驗用固體培養(yǎng)基。測試0-75供試菌株生長情況，以確定菌株生長,溫度范圍及最適溫度鹽耐受實驗用液體培養(yǎng)基，測試供試菌種對Nacl及其他鹽類耐受力。測試供試菌株0-30%鹽濃度生長情況，確定耐受上下限濃度及最適濃度2022/9/22（二）碳源利用實驗培養(yǎng)基：無碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基不同碳源按不同濃度加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)置對照（三）氮源利用實驗培養(yǎng)基：無氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基不同氮源按0.5%濃度加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)置對照2022/9/22（四）、酶學(xué)特性實驗通常需要測定的酶學(xué)特征實驗包括氧化

21、酶、接觸酶、脲酶、酯酶、明膠液化、淀粉水解、牛奶凝固與胨化、纖維素水解、硝酸鹽還原等2022/9/22氧化酶（Oxidase）試驗氧化酶亦即細(xì)胞色素氧化酶，為細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，氧化酶先使細(xì)胞色素C氧化，然后此氧化型細(xì)胞色素C再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。試驗方法：在瓊脂斜面培養(yǎng)物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑12滴，陽性者Kovacs氏試劑呈粉紅色深紫色，Ewing氏改進(jìn)試劑呈藍(lán)色。陰性者無顏色改變。應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)判定試驗結(jié)果。2022/9/22過氧化氫酶的測定過氧化氫酶又稱接觸酶，能催化過氧化氫分解水和氧。試劑：310過氧化氫（H2O2）菌種培養(yǎng)：將測試菌種接種于合適的培養(yǎng)基斜面

22、上，適溫培養(yǎng)1824h。試驗方法：取一干凈的載波片，在上面滴1滴310的H2O2 ，挑取1環(huán)培養(yǎng)1824h的菌苔，在H2O2溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)，則為過氧化氫酶陽性，無氣泡者為陰性。也可將過氧化氫溶液直接加入斜面上，觀察氣泡的產(chǎn)生。注意事項：過氧化氫酶是1種以正鐵血紅素作為輔基的酶，所以測試菌所生長的培養(yǎng)基不可含有血紅素或紅血球。2022/9/22尿素酶（Urease）試驗有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶，因為不論底物尿素是否存在，細(xì)菌均能合成此酶。其活性最適pH為7.0。試驗方法：挑取1824h待試菌培養(yǎng)物大量接

23、種于液體培養(yǎng)基管中，搖均勻，加入無菌尿素，于361培養(yǎng)10，60和120min，分別觀察結(jié)果?；蛲坎疾⒋┐探臃N于瓊脂斜面，不要到達(dá)底部，留底部作變色對照。培養(yǎng)2，4和24h分別觀察結(jié)果，如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作最終判定，變?yōu)榉奂t色為陽性。2022/9/2243明膠液化試驗蛋白質(zhì)和氨基酸一般作為微生物的氮源，但是當(dāng)缺缺乏糖類物質(zhì)時，它們也可作為微生物的碳源和能源。明膠是由蛋白質(zhì)經(jīng)水解產(chǎn)生，在25以下可維持凝膠狀態(tài)，以固體狀態(tài)存在，而在25以上時明膠就會液化。有些微生物可產(chǎn)生一種稱為明膠酶的胞外酶，水解這種蛋白質(zhì)，而使明膠液化，甚至在4仍能保持液化狀態(tài)。2022/9/2244明膠液化試驗37培養(yǎng)

24、48h后,將明膠培養(yǎng)基輕輕放入4冰箱30min，觀察明膠的液化狀況。2022/9/22石蕊牛奶的反應(yīng)牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在牛奶中加入石蕊是作為酸堿指示劑和氧化還原指示劑。石蕊在中性時呈淡紫色，酸性時呈粉紅色，堿性呈藍(lán)色，還原時則自上而下地褪色變白。細(xì)菌對牛奶的作用有一下幾種：產(chǎn)酸細(xì)菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使石蕊變紅。產(chǎn)堿細(xì)菌分解酪蛋白產(chǎn)生堿性物質(zhì)，使石蕊變藍(lán)。胨化細(xì)菌產(chǎn)生蛋白酶，使酪蛋白分解，故牛奶變得比較澄清酸凝固細(xì)菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使石蕊變化，當(dāng)酸度很高時，可使牛奶凝固。凝乳酶凝固有些細(xì)菌能產(chǎn)生凝乳酶，使牛奶中的酪蛋白凝固，此時石蕊常呈藍(lán)色或不變色。還原細(xì)菌生長旺盛，使培養(yǎng)基氧化還原電位降低

25、，因此石蕊還原褪色。接種與觀察結(jié)果：接種待測菌株，適溫培養(yǎng)3、5、7d或14d，按上述特征觀察和記錄牛奶產(chǎn)酸、產(chǎn)堿、凝固或胨化等反應(yīng)。2022/9/2246淀粉水解實驗微生物對大分子的淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪不能直接利用，必須靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)分解成小分子物質(zhì)才能被微生物吸收利用。胞外酶主要是水解酶，通過加水裂解大分子物質(zhì)為較小的化合物，使其能被運輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)。如淀粉酶水解淀粉為小分子的糊精、雙糖和單糖；脂肪酶水解脂肪為甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白質(zhì)為氨基酸等。這些過程可以通過觀察細(xì)菌菌落周圍物質(zhì)的變化來證實。如可以用滴加碘液到菌落周圍看是否變藍(lán)色來檢查是否產(chǎn)生淀粉酶。脂肪水解后產(chǎn)生脂肪酸會使

26、培養(yǎng)基pH下降，可以在培養(yǎng)基中事先加入中性紅試劑，培養(yǎng)基會從淡紅色變?yōu)樯罴t色。2022/9/2247淀粉水解實驗把淀粉平板培養(yǎng)基分成六部分，分別按下圖方式接上提供的五種菌，留一區(qū)作為對照。圖5-1 淀粉水解實驗接菌圖2022/9/22纖維素分解實驗測定菌種產(chǎn)生纖維素酶的能力。將濾紙條一端浸沒在液體培養(yǎng)基中，滅菌后將待測菌種接種到液面以上的濾紙條上，一個月后觀察濾紙條是否被分解。2022/9/22硝酸鹽（Nitrate）還原試驗有些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮氣等。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗。試驗方法：臨試前將試劑的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（萘胺乙醇溶液）試液

27、各0.2ml等量混合、取混合試劑約0.1ml、加于液體培養(yǎng)物或瓊脂斜面培養(yǎng)物表面，立即或于10min內(nèi)呈現(xiàn)紅色即為試驗陽性，若無紅色出現(xiàn)則為陰性。用-萘胺進(jìn)行試驗時，陽性紅色消退很快、故加入后應(yīng)立即判定結(jié)果。進(jìn)行試驗時必須有未接種的培養(yǎng)基管作為陰性對照。-萘胺具有致癌性、故使用時應(yīng)加注意。2022/9/22（五）代謝產(chǎn)物實驗代謝產(chǎn)物中的有機酸組分非常重要，常用方法有甲基紅實驗（MR實驗）、V_P實驗、色氨酸分解實驗、半胱氨酸分解（硫化氫產(chǎn)生實驗）實驗等2022/9/2251甲基紅試驗甲基紅試驗是用來檢測由葡萄糖產(chǎn)生的有機酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。有些細(xì)菌(如大腸桿菌等)分解糖類產(chǎn)生丙酮酸，丙酮

28、酸進(jìn)一步反應(yīng)形成甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基的pH降低到4.2以下。有些細(xì)菌(如產(chǎn)氣桿菌)在培養(yǎng)的早期產(chǎn)生有機酸，但在后期將有機酸轉(zhuǎn)化為非酸性末端產(chǎn)物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大約6。 2022/9/2252甲基紅試驗取3支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，標(biāo)記。1支接種大腸桿菌，1支接種產(chǎn)氣桿菌，1支接未知菌。37培養(yǎng) 48h。加甲基紅指示劑數(shù)滴，觀察結(jié)果。呈現(xiàn)紅色者為陽性，呈現(xiàn)黃色者為陰性。*甲基紅指示劑pH 4.4(紅色)6.2(黃色) 2022/9/2253V.P. 試驗(伏普試驗)V.P.試驗是用來測定某些細(xì)菌利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物的能力。2022/9/2254V.P.試驗取3支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，1號接種大腸桿菌，2號接產(chǎn)氣桿菌，第3支接未知菌37培養(yǎng) 48h后。加入40%KOH 510滴，然后再加入等量的5%-萘酚溶液，用力振蕩，再放入37溫箱中保溫30min，以加快反應(yīng)速度。觀察培養(yǎng)基的顏色變化。若培養(yǎng)物呈現(xiàn)紅色，為伏-普反應(yīng)陽性。2022/9/2255吲哚