基因克隆酶學(xué)基礎(chǔ)

1、關(guān)于基因克隆的酶學(xué)基礎(chǔ)第1頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四第四章 分子克隆的酶學(xué)基礎(chǔ) 基因的重組與分離，涉及到一系列相互關(guān)聯(lián)的酶促反應(yīng)。特別是核酸限制性內(nèi)切酶 和DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，使DNA分子的體外連接與切割成為可能。 核酸限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶是重組DNA技術(shù)賴以創(chuàng)立的重要酶學(xué)基礎(chǔ)。第2頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四重組DNA實(shí)驗(yàn)中常使用的酶II型核酸內(nèi)切限制酶DNA連接酶大腸桿菌DNA 聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶多核苷酸激酶末端轉(zhuǎn)移酶核酸外切酶III核酸外切酶堿性磷酸酶S1核酸酶Bal31核酸酶TaqDNA聚合酶第3頁，共107頁，20

2、22年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu) DNA的二維結(jié)構(gòu)第4頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四核酸酶通過切割相鄰的兩個(gè)核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，導(dǎo)致核酸分子多核苷酸鏈發(fā)生水解斷裂的蛋白酶叫做核酸酶。專門水解斷裂RNA分子的叫做核糖核酸酶（RNase) ；特異水解斷裂DNA分子的則叫做脫氧核糖核酸酶（DNase）。從核酸分子末端開始,一個(gè)核苷酸一個(gè)核苷酸地消化降解多核苷酸鏈,稱為核酸外切酶（ exonuclease）；從核酸內(nèi)部切割磷酸二酯鍵使之?dāng)嗔褳樾∑蔚臑楹怂醿?nèi)切酶（endonuclease）。 第5頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52

3、分，星期四第6頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四第一節(jié)、核酸內(nèi)切限制酶與DNA分子的體外切割寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象(R/M)修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶核酸內(nèi)切限制酶EcoBEcoK（Restriction and modification） 第7頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四E.coli 菌株噬菌體感染率 KBCE.coli K110-410-4E.coli B10-4110-4E.coli C111說明K和B菌株中存在一種限制系統(tǒng)可排除外來的DNA第8頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四GAATTCCTTAAGEcoR IM

4、EcoR I限制作用修飾作用G3 5 AATTCCTTAA5 3 GGAATTCCTTAAGMeMeMeEcoR I核酸內(nèi)切限制酶EcoR I 及其修飾的甲基化酶MEcoR 的限制與修飾作用第9頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四第10頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四第11頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四寄主的限制與修飾的作用保護(hù)自身的DNA不受限制;破壞外源DNA,使之迅速降解第12頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四2.限制酶的發(fā)現(xiàn)60年代提出了限制性內(nèi)切酶和限制酶的概念1968 年，首次從 E

5、.coli K 中分離到限制酶 有特定的識(shí)別位點(diǎn)但沒有特定的切割位點(diǎn)，切割位點(diǎn)離識(shí)別位點(diǎn)達(dá) 1000bp 以上。1970 年 ，美國約翰霍布金斯大學(xué)的 H. Smith找到 Hind 限制性內(nèi)切酶 。2006年2月為止共發(fā)現(xiàn)3773種限制酶,810種甲基化酶 第13頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四核酸內(nèi)切限制酶(restriction endonuclease)是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列（4-8bp），并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶第14頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四3. 核酸內(nèi)切限制酶的類型特性I型酶II型酶I

6、II型酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3種亞基單一成分2種不同亞基輔助因子ATP, Mg2+, S-MetMg2+ATP, Mg2+, S-Met序列特異切割不是是是切割位點(diǎn)距識(shí)別序列1kb處隨機(jī)切割識(shí)別序列內(nèi)或附近距識(shí)別距離下游24-26bp處克隆中的作用無用十分有用用處不大第15頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四4. II型核酸內(nèi)切限制酶的基本特性在特異識(shí)別序列切割DNA分子；兩個(gè)單鏈切割部位在DNA分子上的分布,通常不直接相對(duì)；斷片往往具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。(1) 基本特性第16頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四識(shí)別序列4-8個(gè)核苷酸序列大部分呈旋轉(zhuǎn)對(duì)稱、反

7、向重復(fù)結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)C-C-G-C-G-GG-G-C-G-C-C對(duì)稱軸切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)第17頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四 A B C C B A A B B A AB C C B A A B A B 部分識(shí)別序列不對(duì)稱:AccBS :CCGCTC GGCGAG BssS : CTCGTG GAGCAC 有一些限制酶可識(shí)別多種序列 AccI GT MKAC (M:A或C) HindII GTY RAC(Y:C或R:A或G)第18頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四識(shí)別位點(diǎn)在DNA分子中的頻率假定核苷酸隨機(jī)排列的情況下進(jìn)行 實(shí)踐中:如 DNA長49

8、kb，對(duì)于六堿基的酶應(yīng)該有12個(gè)切割位點(diǎn)，實(shí)際上要少一些，如Bgl II只有6個(gè)，BamHI只有5個(gè)，而SalI只有2個(gè)。44=25646=4096第19頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四基因組中堿基對(duì)的排列是非均勻的 ，盡管有的酶切序列中 GC 含量相同，但在基因組中出現(xiàn)的機(jī)率還是不一樣。 在 E.coli 中 Aso（GGCGCGCC） 20kb Not（GCGGCCGC） 200kb （常利用它出現(xiàn)的機(jī)會(huì)少來構(gòu)建圖譜） EcoR 和 Hind 5kb Spe（ACTAGT） 60kb第20頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四細(xì)菌基因組（Bac

9、teria genome)大多數(shù)富含A+T的細(xì)菌中，CCC和CGG的排列是最少見的，所以含有這兩種序列的識(shí)別序列出現(xiàn)的幾率就非常少。酵母基因組（Yeast genome)G+C含量38%， 在重復(fù)序列之外，富含G+C的識(shí)別序列就特別少。哺乳動(dòng)物中含CG序列的酶切位點(diǎn)稀少，大多CG序列是甲基化的第21頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四(2)、 限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的末端粘性末端Cohesive ends (Mached ends) 5粘性末端, 3突出末端平末端 Blunt ends非對(duì)稱突出端第22頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四粘性末端Cohes

10、ive ends (Mached ends) DNA分子在限制性內(nèi)切酶的作用下形成具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu),能夠通過互補(bǔ)堿基的配對(duì)而重新連接起來.EcoRI切割位點(diǎn)5-GAATTC-33-CTTAAG-5a .在對(duì)稱軸的5一側(cè)切割底物， DNA雙鏈交錯(cuò)斷開，形成5突出末端第23頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四EcoRI等產(chǎn)生的5粘性末端5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5EcoRI 37 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P

11、OH-G-C-T-C 5退火 4-7 5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5OHPPOH第24頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四b .3一側(cè)切割形成3突出末端5-CTGCAG-33-GACGTC-5PstI切割位點(diǎn)第25頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四PstI等產(chǎn)生的3粘性末端5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5PstI 37 5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A

12、-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OHPOHP第26頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四5突出端易于通過DNA激酶和32p ATP進(jìn)行同位素標(biāo)記3突出端是末端轉(zhuǎn)移酶的理想作用底物,在酶的作用下,容易使DNA片段帶上多核苷酸尾第27頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四在對(duì)稱軸上同時(shí)切割DNA的兩條鏈5-GCGGCCGC-33-CGCCGGCG-5平末端 Blunt ends第28頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分

13、，星期四PvuII等產(chǎn)生的平頭末端5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 55 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 PvuII 37 第29頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四第30頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四 同裂酶（Isoschizomer): 識(shí)別位點(diǎn)的序列相同的限制性 內(nèi)切酶 完全同裂酶:識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同：如MobI和Sau3AI 識(shí)別序列切割位點(diǎn)為 GATC 不完全同裂酶:

14、識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同如AatII(GACGT C )ZraI(GAC GTC)同尾酶(Isocaudiners):識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如 BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等EcoR GAATTC Mfe CAATTC Apo RAATTYR: A or G;Y:C or T第31頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四具粘性末端的DNA片段結(jié)合方式 限制性片段末端連接作用a.具有EcoRI粘性末端的2條DNA片斷之間的連接b.具有粘性末端的同一條片斷的自我連接第32頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四屬名頭一個(gè)字母+種

15、名頭兩個(gè)字母菌株名不同修飾體系系統(tǒng)名 Haemophilus influenzae d 嗜血流感桿菌d株 HindIII6. 核酸內(nèi)切限制酶的命名法第33頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四DNA 片段（線性載體）檢測末端長度對(duì)切割的影響時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)識(shí)別序列的末端長度對(duì)酶切效率有明顯影響，不同的酶對(duì)末端長度的要求是不同。因此設(shè)計(jì) PCR 引物時(shí)，引入酶切位點(diǎn)時(shí)，在位點(diǎn)之外加上能夠滿足要求的堿基數(shù)目。雙酶切多克隆位點(diǎn)時(shí)選擇合適的酶切秩序 第34頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四7、位點(diǎn)偏愛(site preference)某些限制酶對(duì)同一介質(zhì)中的有些

16、位點(diǎn)表現(xiàn)出偏愛性切割，即對(duì)不同位置的同一個(gè)識(shí)別序列表現(xiàn)出不同的切割效率的現(xiàn)象稱作位點(diǎn)偏愛 (1) 現(xiàn)象：EcoR 酶切割 噬菌體中的 5 個(gè)位點(diǎn)時(shí)并不是隨機(jī)的，靠近右端的位點(diǎn)比分子中間的位點(diǎn)切割快 10 倍；EcoR 對(duì)腺病毒 2（adenvirus-2）DNA 不同位置切點(diǎn)的切割速率也不同。EcoR 和 Hind 在 噬菌體 DNA 中的切割速率分別有 10 倍和 14 倍的差異 噬菌體 DNA 有 4 個(gè) Sac 位點(diǎn)，三個(gè)在中央，一個(gè)在右臂，對(duì)中央三個(gè)位點(diǎn)的酶切速度快 50 倍 第35頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四8.II 型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：對(duì)鹽濃度

17、要求相同的酶，原則上可以同時(shí)酶切，對(duì)鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時(shí)酶解低鹽酶先切，然后補(bǔ)加鹽，高鹽酶再切一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切酶切溫度要求不同時(shí),先低溫切,后高溫切第36頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四注意事項(xiàng)取少量酶最后加酶減少反應(yīng)體積反應(yīng)時(shí)間的延長 分裝（對(duì)于多個(gè)反應(yīng)）第37頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四第38頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四9、影響酶活性的因素 (1)DNA的純度:蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA, SDS、NaCl等提高對(duì)

18、低純度DNA酶切效率的方法:增加核酸內(nèi)切酶的用量,1ugDNA/10u;擴(kuò)大反應(yīng)體積,稀釋抑制因素延長酶切保溫時(shí)間 第39頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四(2)甲基化程度:大腸桿菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基 (3)緩沖液 pH,Mg2+ ,DTT,BSA,10(X)(4) 酶切消化反應(yīng)的溫度 大多數(shù)為 37,少數(shù) 25-30 smalI(25);ApaI(30)(5)DNA的分子構(gòu)型與切割 DNA 相比，EcoR、Pst、Sal 需要至少 2.5-10 倍的酶來切割 pBR322 的超螺旋 DNA。 第40頁，共107頁，2022年，

19、5月20日，5點(diǎn)52分，星期四(6)、酶的星星活性（star activity)在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識(shí)別序列相似的序列，這個(gè)改變的特殊性稱星星活性 星星活性是限制性內(nèi)切酶的一般性質(zhì)，任何一種限制酶在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下都能切割非典型位點(diǎn) Apo、Ase、BamH、BssH11、EcoR、EcoRV、Hind、Hinf、Kpn、Pst、Pvu、Sal、Sca、Taq 和 Xmn 等酶皆可表現(xiàn)出星星活性。 第41頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH等會(huì)使一核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的Star acti

20、vity現(xiàn)象甘油濃度高（5%） 酶過量（100U/l） 離子強(qiáng)度低（8.0） 有機(jī)溶劑如 PMSD （二甲基亞砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethbylformamide）、 sulphalane 等等. 用其它二價(jià)陽離子如 Mn+ 、Cu+、Co+ 或 Zn+ 代替了 Mg+ 。 第42頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四10、 酶切位點(diǎn)的引入（1）產(chǎn)生的 5 突出端補(bǔ)平后，再連接可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn) （2）同尾末端的連接 不同的同尾酶切割 DNA 產(chǎn)生的末端再相互連接時(shí)，可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)，同時(shí)原來的酶切位點(diǎn)

21、消失 BamH（GGATCC）+ Bcl（TGATCA） Alw（GGATC 4/5） 第43頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四（3）平末端的限制酶切割的DNA在連接后也可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn) Pvu（CAGCTG）+ EcoRV（GATATC） Mob（GATC） 第44頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)的終止65或80 溫浴20分鐘加入EDTA（10mM)終止第45頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四第二節(jié)、 DNA連接酶 催化雙鏈DNA片段靠在一起的 3羥基與5磷酸之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接起來的

22、酶。 兩種DNA連接酶大腸桿菌連接酶:是一種相對(duì)分子量為74000的蛋白質(zhì),催化時(shí)需NAD+做能量,只能連接粘性末端T4噬菌體連接酶:相對(duì)分子質(zhì)量60 000,需ATP做為能量來源,可連接粘性末端和平末端連接的條件:DNA3端有游離的-OH,5端有P;需要能量;必須是兩條雙鏈DNA.只封閉雙螺旋DNA骨架上的缺口第46頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四1T4 DNA 連接酶（T4 DNA ligase） T4噬菌體感染大腸桿菌產(chǎn)生底物：粘端、切口、平端的 RNA （但效率低）或 DNA 影響因素：低濃度的聚乙二醇 PEG （一般為 10%）和單價(jià)陽離子（150-200m

23、M NaCl）可以提高平端連接速率。第47頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四2E.coli DNA 連接酶（E.coli DNA ligase）與 T4 DNA ligase 活性相似，但需煙酰胺-腺嘌呤二核苷酸（NAD+）參與。平端連接效率低，常用于置換合成法合成 cDNA 不能將 RNA 連接到 DNA ，不連接 RNA 。第48頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四3Taq DNA 連接酶在兩個(gè)寡核苷酸之間進(jìn)行連接反應(yīng)，同時(shí)必須與另一DNA 鏈形成雜交體，相當(dāng)于連接 dsDNA 中的缺口作用在 4565 需 NAD+ ?？捎糜跈z測等位基因的變化

24、在 PCR 擴(kuò)增中引入寡核苷酸。它不可替代 T4 DNA ligase 。第49頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四二、連接反應(yīng)的機(jī)理ATP（NAD+)提供激活的AMPATP與連接酶形成共價(jià)“連接酶-AMP”復(fù)合物，并釋放出焦磷酸PPi。AMP與連接酶的賴氨酸-氨基相連AMP隨后從連接酶的賴氨酸-氨基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的5端P上,形成“DNA-腺苷酸”復(fù)合物 3-OH對(duì)磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出AMP第50頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四第51頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四 DNA連接酶第52頁，共107

25、頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四第53頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四四、影響連接反應(yīng)的因素1 反應(yīng)溫度 16 反應(yīng)，4 小時(shí)； 4 反應(yīng)，反應(yīng)過夜2 連接酶的濃度Weiss 單位 在 37 下 20 分鐘催化 1 nmol 32p 從焦磷酸根置換到， 32PATP 所需的酶量，定義為 1 個(gè) Weiss 單位。 NEB單位 在 20l 反應(yīng)體系中于 16 ，使 Hind 切過的 DNA （300g/ml，0.12M 5 末端）在 30 分鐘內(nèi)連接 50% 所需的酶量為 1 個(gè) NEB 單位。 1 NEB = 0.015 Weiss 1 Weiss =

26、67 NEB 平末端連接反應(yīng)的酶量大約是1-2個(gè)單位,粘性末端僅為0.1個(gè)單位,3 ATP濃度4 DNA片斷末端 自身環(huán)化的單體，線性二聚體或多聚體，分子間連接，重組質(zhì)粒第54頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四插入片段與載體的濃度比例3-10：1；堿性磷酸酶處理載體目的片段的量的計(jì)算提高連接效率的方法第55頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四第三節(jié)、 DNA 聚合酶（DNA polymerase ）和反轉(zhuǎn)錄酶 作用：在有模板，引物存在下，把脫氧核糖單核苷酸 （dNTP）連續(xù)加到雙鏈DNA分子引物鏈的3-OH端，催化核苷酸的聚合作用。一 基因工程中常

27、用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶， Klenow fragment T7 DNA聚合酶 T4 DNA聚合酶 修飾過的T7 DNA聚合酶 反轉(zhuǎn)錄酶第56頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四二、 DNA聚合酶的作用DNA聚合酶 I 與核酸雜交探針的置備；大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段與DNA末端標(biāo)記；T4 DNA 聚合酶和取代合成法標(biāo)記DNA片段；依賴于RNA的DNA聚合酶與互補(bǔ)DNA 的合成；第57頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四（一）、 E.coli DNA 聚合酶 1.基本活性 5-3 DNA 聚合酶活性。底物：為單鏈 DNA ，引

28、物（帶 3-OH 基） 或 5 突出的雙鏈 DNA 。 5-3 外切核酸酶活性 底物：雙鏈 DNA 或 DNA:RNA 雜交體活性：從 5 端降解雙鏈 DNA ，也降解 RNA:DNA 中的 RNA（RNase H 活性） 第58頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四 3-5 外切酶活性底物：帶 3-OH 的雙鏈 DNA 或單鏈 DNA 活性： 3-OH 端降解 DNA ，可被 5-3 聚合活性封閉，也可被帶 5 磷酸的 dNMP 所抑制。 在沒有 dNTP 的情況下，外切活性占主導(dǎo)地位，而當(dāng)存在足夠的 dNTP 時(shí)，外切活性和合成活性將處在動(dòng)態(tài)平衡中，結(jié)果使得雙鏈 DNA

29、 成為平末端。第59頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四DNA聚合酶 I 聚合活性第60頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四DNA聚合酶 I 的5-3核酸外切酶活性第61頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四2E.coli DNA 聚合酶 的用途切口平移法（nick translation ）標(biāo)記 DNA 所有 DNA 聚合酶中只有此酶有此反應(yīng) 53Mg2+,DNaseIdNTP,DNA polyI切口平移第62頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四探針標(biāo)記雙鏈DNA分子由DNaseI產(chǎn)生的單鏈缺口,帶有3OH

30、末端大腸桿菌DNA聚合酶I 的5 3外切酶活性從缺口5-P一側(cè)移去一到數(shù)個(gè)核苷酸大腸桿菌DNA聚合酶I將32P標(biāo)記的核苷酸摻入取代原先被刪除的核苷酸重復(fù)進(jìn)行和(d),使缺口沿著5 3方向移動(dòng).第63頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四（二）、Klenow DNA 聚合酶 E.coli DNA polymerase large fragment （Klenow fragment）大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶）裂解而從全酶中除去 5-3 外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和 3-5 外切活性不受影響，分子量為 76kDa 。第64頁，共107頁，202

31、2年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四活性：與 E.coli DNA 聚合酶 的活性是一致的。但沒有 5-3 外切活性作用： 補(bǔ)平 3 凹端 DNA 。要加足夠的 dNTP 抹平 DNA 3 凸端。必須加足量 dNTP 在 cDNA 克隆中合成第二鏈。隨機(jī)引物標(biāo)記。 應(yīng)用于 Sanger 雙脫氧鏈末端終止法的 DNA 測序（已經(jīng)被 T7 DNA 聚合酶取代） 第65頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四DNA分子末端標(biāo)記第66頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四（三）、T4 噬菌體 DNA 聚合酶（T4 phage DNA polymerase） 來源于

32、 T4 噬菌體感染的 E.coli ，分子量為 114kDa 活性： 與 Klenow 酶相似，但 3-5 外切活性強(qiáng) 200 倍 53聚合活性第67頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四用途用于補(bǔ)平或標(biāo)記3凹端取代合成（需高濃度dNTP一種)-末端標(biāo)記標(biāo)記DNA片段 利用外切活性產(chǎn)生3凹端再補(bǔ)平第68頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四（四）、T7 噬菌體 DNA 聚合酶（T7 phage DNA polymerase） 來源于 T7 噬菌體感染的 E.coli ，為兩種緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合體，一種是噬菌體基因 5 蛋白，另一個(gè)是宿主蛋白的硫氧還蛋白

33、。 聚合能力最強(qiáng)的DNA聚合酶；聚合過程中不形成二級(jí)結(jié)構(gòu)；可進(jìn)行單純的延伸或取代合成的途徑；在從5到3方向的聚合過程中也有一定程度的35核酸外切酶活性；將雙鏈DNA5或3突出末端轉(zhuǎn)變成平末端的結(jié)構(gòu)。第69頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四活性：與 T4 噬菌體 DNA 聚合酶和 Klenow DNA 聚合酶類似，但 3-5 外切活性為 Klenow 的 1000 倍。 用途： T7 噬菌體 DNA 聚合酶可替代 T4 的功能并可用于長模板的引物延伸。第70頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四修飾的T7DNA聚合酶切除了 99% 以上的 3-5 外切

34、活性 （V1）完全除去V2用于測序反應(yīng)第71頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四（五）、耐熱 DNA 聚合酶 在高溫下有 DNA 聚合活性，來自噬高溫的細(xì)菌，主要用于 PCR 反應(yīng)，如 Taq DNA 聚合酶、 Vent DNA 聚合酶、 Pfu DNA 聚合酶、 Pwo DNA 聚合酶和 Tth DNA 聚合酶等 第72頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四（六）、反轉(zhuǎn)錄酶（Reverse transcriptase） 依賴于 RNA 的 DNA 聚合酶，也叫做RNA指導(dǎo)的DNA 聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶?；钚裕河?5-3 合成 DNA 活性來自 AMV （

35、禽成髓細(xì)胞瘤病毒）或 Mo-MLV （ 鼠白血病病毒，又稱 M-MuLV） 第73頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四AMV反轉(zhuǎn)錄酶包含兩條多肽鏈； 具 5-3 DNA 聚合活性 很強(qiáng)的 RNA 酶 H 活性（降解與DNA雜交的RNA） 在 cDNA 合成開始時(shí)，引物和 mRNA 模板雜交體可成為 RNase H 的底物，此時(shí)，模板的降解和 cDNA 的合成相競爭；反應(yīng)終止時(shí)， RNase H 可在正在增長的 DNA 鏈近 3 端切割模板，趨向于抑制 cDNA 的產(chǎn)量并限制其長度。在 42 （雞的正常體溫）能有效發(fā)揮作用，能有效地拷貝較復(fù)雜的 mRNA ，但提純過程中易被

36、內(nèi)切酶污染。第74頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶 是單鏈多肽， 84kDa ， 其 RNase H 活性弱，有利于合成較長 cDNA。其基因工程產(chǎn)品純度高。 第75頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四2 用途cDNA（complememtary DNA)克隆5突出DNA的補(bǔ)平和標(biāo)記測序反應(yīng)第76頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四3 活性5 3DNA聚合活性 RNA or DNA為模板及帶3-OH的RNA或DNA引物RNaseH活性第77頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四反轉(zhuǎn)錄

37、酶的5-3方向的DNA聚合酶 I 活性第78頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四反轉(zhuǎn)錄酶的5-3方向和3- 5方向的核糖核酸外切酶活性（Rnase H)雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈第79頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四第四節(jié)、 DNA及RNA的修飾酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶與同聚物加尾T4多核苷酸激酶與DNA分子5末端的標(biāo)記堿性磷酸酶與DNA脫磷酸作用第80頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四一、末端轉(zhuǎn)移酶（terminal transferase）來源于小牛胸腺，是一種不依賴于模板的 DNA 聚合酶 。在二價(jià)陽離子

38、存在下，末端轉(zhuǎn)移酶催化 dNTP 加于 DNA 分子的 3 羥基端。 T 或 C 首選 CO2+ ； A 或 G 首選 Mg2+ 第81頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四TdT的基本特性5 p3 HOOH 3 p 5 TdTCo2+ dATP5 p3 HO AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 第82頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四末端轉(zhuǎn)移酶terminal transferase（TdT)第83頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四1 底物DNA 可短至 3 個(gè)核苷酸，對(duì) 3 羥基突出末端的底物作用

39、效率最高 低離子強(qiáng)度時(shí)， 5 突出端或平端的 DNA 也可作為底物 2 用途在 cDNA 或載體 3 末端加同聚尾用于克隆 末端標(biāo)記第84頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四同聚物加尾法再生Hind III識(shí)別位點(diǎn)第85頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四二、T4 多核苷酸激酶 （T4 polynucleotide kinase） 是一種磷酸化酶，可將 ATP 的 -磷酸基轉(zhuǎn)移至 DNA 或 RNA 的 5 末端。 分子克隆應(yīng)用中呈現(xiàn)兩種反應(yīng) ：正反應(yīng) ：將 ATP 的 -磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到無磷酸的 DNA 5 端。 用于對(duì)缺乏 5-磷酸的 DNA 進(jìn)行

40、磷酸化 ,催化5突出末端磷酸化速度比平末端或5末端磷酸化速度快得多。交換反應(yīng)：在過量 ADP和-32PATP 存在的情況下，該激酶可將磷酸化的 5 端磷酸轉(zhuǎn)移給 ADP ，然后 DNA 從 ATP 中 -磷酸而重新磷酸化。 使用的 ATP 均為放射性同位素標(biāo)記 - -32pATP ，那么反應(yīng)的產(chǎn)物都變成末端獲得放射性標(biāo)記的 DNA 。第86頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四第87頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四T4多核苷酸激酶的交換活性第88頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四三、堿性磷酸酶（alkaline phosph

41、atase） 主要來源于:牛小腸堿性磷酸酶（Calf intestinal alkaline phosphatase），簡稱 CIP 或 CIAP 細(xì)菌的堿性磷酸酶（Bacterial alkaline phosphatase, BAP）第89頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四作用催化除去 DNA 或 RNA 5 磷酸的反應(yīng) 用于防止 DNA 片段自身連接，或標(biāo)記（5 端）前除 DNA 或 RNA 5 磷酸 第90頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四第91頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四第92頁，共107頁，2022年，5

42、月20日，5點(diǎn)52分，星期四第四節(jié) 其它酶一、依賴于 DNA 的 RNA 聚合酶 （DNA dependent RNA polymerase） SP6 噬菌體 RNA 聚合酶（來源于感染鼠傷寒沙門氏菌 LT2 菌株） T4 或 T7 噬菌體 RNA 聚合酶（來源于噬菌體感染的大腸桿菌）。 第93頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四1活性 這些 RNA 聚合酶實(shí)際上為轉(zhuǎn)錄中的 RNA 合成酶，識(shí)別 DNA 中各自特異的啟動(dòng)子序列，并沿此 dsDNA 模板起始 RNA 的合成。它與 DNA 聚合酶不同，無需引物，但需識(shí)別特異性位點(diǎn)。2用途 體外合成 RNA 分子。 用于表達(dá)外

43、源基因。第94頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四二、核酸外切酶 （nuclease）單鏈外切核酸酶 大腸桿菌外切核酸酶I和VII：兩頭降解，產(chǎn)生2-25bp寡核苷酸片段雙鏈外切核酸酶大腸桿菌外切核酸酶III:雙鏈DNA從3OH末端開始降解，釋放5單核苷酸從 dsDNA 3-OH 逐一去除單核苷酸的反應(yīng)，底物為 dsDNA 或線狀和帶切口或缺口的環(huán)狀 DNA ，反應(yīng)結(jié)果是在 dsDNA 上產(chǎn)生長長的單鏈區(qū)。該酶還有對(duì)無嘌呤 DNA 特異性內(nèi)切核酸酶活性、 RNase H 活性和 3-磷酸酶活性（去磷酸）。不降解核酸內(nèi)的磷酸二酯鍵，也不降解單鏈 DNA 及帶 3 突出的 d

44、sDNA 。 持續(xù)作用能力不強(qiáng)，產(chǎn)物為切割程度不相上下的群體，有利于分離長短不等的 DNA 。第95頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四第96頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四三 單鏈核酸內(nèi)切酶1BAL31 核酸酶（BAL31 nuclease）來源于交替單胞菌（Alteromonas espejiana）BAL31 主要活性為單鏈特異的核酸內(nèi)切酶活性,從3羥基末端迅速降解DNA 依賴 Ca+ ,而且 EGTA(乙二醇-雙-(2-氨基乙基)四乙酸） 可抑制其活性。雙鏈的核酸外切酶活性：可從線性 DNA 兩條鏈的 兩端迅速去除單核苷酸第97頁，共107頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)52分，星期四用途從兩頭縮短 DNA ，用于構(gòu)建嵌套缺失體 制作 DNA 限制酶切圖;確定 DNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)從單鏈 RNA 上去除核苷酸。 第98頁