微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)理論及思考題

1、實(shí)驗(yàn)一 顯微的使用微生物大小定的方二、基本原理現(xiàn)代普通光學(xué)顯微鏡利用目鏡和物鏡兩組透鏡系統(tǒng)來(lái)放大成像們由機(jī) 械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分組成物鏡的性能最為關(guān)鍵它直接影響著顯微鏡的 分辨率。其中油鏡的放大倍數(shù)最大，對(duì)微生物學(xué)最為重要。微生物細(xì)胞的大小是微生物基本的形態(tài)特征也是分類鑒定的依據(jù)之一微生物 大小的測(cè)定需要在顯微鏡下借助于特殊的測(cè)量工具測(cè)微尺包括目鏡測(cè)微 尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺。其中鏡臺(tái)測(cè)微尺并不直接用來(lái)測(cè)量細(xì)胞大小 ，而是用于校正 目鏡測(cè)微尺每格的相對(duì)長(zhǎng)度鏡測(cè)微尺每小格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度因顯微鏡的不 同放大倍數(shù)而異因此用目鏡測(cè)微尺測(cè)量微生物大小時(shí)必須先用鏡臺(tái)測(cè)微尺進(jìn) 行校正以求出該顯微鏡在一定放大倍

2、數(shù)下目鏡測(cè)微尺每小格所代表的相對(duì)長(zhǎng) 度，然后根據(jù)微生物細(xì)胞相當(dāng)于目鏡測(cè)微格數(shù)，即可計(jì)算出細(xì)胞的實(shí)際大小兩重合線間鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度=兩重合線間目鏡測(cè)微尺格數(shù)思考題1、用油鏡觀察時(shí)應(yīng)注意哪些問(wèn)題？在載玻片和鏡頭之間加滴什么油？起什么作 用？答（1）應(yīng)先用摖鏡紙將鏡頭摖干凈，以防止實(shí)驗(yàn)的污染。使用油鏡時(shí)，應(yīng)先用 低倍鏡再用高倍鏡，然后再是油鏡，用完之后也要用摖鏡紙將油鏡摖掉。（2）滴加香柏油（3）作用是增加折射率，即增加了顯微鏡的分辨率，油的折射率和分辨率成 反比，同時(shí)與波長(zhǎng)成正比。2、影響顯微鏡分辨率的因素有哪些？答顯微鏡的分辨率指顯微鏡能辨別兩點(diǎn)之間的最小距離的能力最小分辨距離

3、越小分辨率越高最小可分辨率距離2NA 且 NA=n.sin,所以分辨率由物 鏡的 NA 值與照明光源的波長(zhǎng)兩個(gè)因素決定，當(dāng)然還有介質(zhì)的折射率。3、為什么要換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時(shí)，必須用鏡臺(tái)測(cè)微尺重新對(duì)目鏡測(cè) 微尺進(jìn)行校正？答不同放大倍數(shù)目鏡測(cè)微尺每小隔所代表實(shí)際長(zhǎng)度不一樣必須用鏡臺(tái)測(cè)微 尺進(jìn)行重新校正，這樣目鏡測(cè)微尺測(cè)量的長(zhǎng)度才是目前狀態(tài)的準(zhǔn)備長(zhǎng)度。 4、在不改變目鏡和目鏡測(cè)微尺，而改用不同放大倍數(shù)的物鏡來(lái)測(cè)定同一微生物 的大小時(shí)，其測(cè)定的結(jié)果是否相同？為什么？答：相同的，不同的放大倍數(shù)，目鏡測(cè)微尺每小格所代表實(shí)際長(zhǎng)度不一樣，必須 重新校正，才能得到目前狀態(tài)的準(zhǔn)確長(zhǎng)度。實(shí)驗(yàn)二 顯微直接計(jì)

4、法二、基本原理顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定 面積和容積的載玻片上（又稱計(jì)菌器其優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速、操作簡(jiǎn)單。目前 國(guó)內(nèi)外常用的計(jì)菌器有：血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 Peteroff-Hauser 計(jì)菌器及 Hawksley 計(jì)菌器等。利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方 法此法是將單細(xì)胞微生物的懸液或孢子懸液注入血球計(jì)數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室中在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)的由于加蓋蓋玻片之后的血球計(jì)數(shù)板的 計(jì)數(shù)室的容積是一定的（ ，萬(wàn)分之一毫升所以可根據(jù)在顯微鏡下觀察 到的微生物數(shù)目來(lái)計(jì)算單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目，包括死菌和活菌。六、思考題根據(jù)你的體會(huì)明用血

5、細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的誤差主要來(lái)自哪些方面？應(yīng)如何 盡量減少誤差，力求準(zhǔn)確？答操作時(shí)沒(méi)有先蓋蓋玻片再加懸液導(dǎo)致體積不準(zhǔn)確避免先蓋蓋玻片再滴 加懸液細(xì)胞：多稀釋溶液溶液不均勻避免：滴加溶液前混勻懸液實(shí)驗(yàn)三二、基原理微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)所用的器皿，大多要進(jìn)行消毒、滅菌和用來(lái)培養(yǎng)微生物，因此 對(duì)其質(zhì)量洗滌和包裝方法均有一定的要求玻璃器皿的形狀和包裝方法要求能 防止污染雜菌為準(zhǔn)玻璃器皿的洗滌方法根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康钠髅蟮姆N類所盛的物 品洗滌劑的類別和沾污程度等的不同而有所不同清洗后的玻璃器皿經(jīng)包裝 后即可進(jìn)行干熱滅菌。干熱滅菌有火焰燒灼滅菌和熱空氣滅菌兩（P59火焰燒灼滅菌適用于載 玻片、試管口、玻棒、接種工具和金屬用具如

6、鑷子等的滅菌。通常所說(shuō)的干熱滅 菌是在電烘箱內(nèi)利用高溫干燥空氣使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅 菌的目的 而細(xì)內(nèi)蛋白質(zhì)固與其身含水有，在菌受時(shí)， 當(dāng)境和細(xì)內(nèi)水量大則蛋質(zhì)固變?cè)剑粗疁缇?比，干熱滅菌所需溫度高160170間長(zhǎng)1-2h但干熱滅菌溫度不能 超過(guò) 180，否則，包器皿的紙或棉塞就會(huì)燒焦，甚至引起燃燒。此法適用于玻 璃器皿如吸管和培養(yǎng)皿等的滅菌。培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品、衣物等不能用 干熱滅菌。思考題1、為什么在吸管的包裝時(shí)要在其粗端吸管口塞上一小段棉花？答：以免使用時(shí)將殺菌吹入其中或不甚將微生物吸出管外。2、在干熱滅菌操作過(guò)程中應(yīng)注意哪些問(wèn)題，為什么？答物品不要擺的太擁擠

7、以免妨礙空氣流通滅菌物品不要直接觸電熱干燥 箱內(nèi)壁的鐵板，以防包裝紙烤焦起火。干熱滅菌的過(guò)程中嚴(yán)防恒溫調(diào)節(jié)的自動(dòng)控制失靈而造成安全事故電熱干燥 箱具有可以觀察的窗口，滅菌的過(guò)程中玻璃溫度較高，注意避免燙傷。電熱干燥箱內(nèi)溫度內(nèi)的溫度未降到 70以前，切勿自行打開(kāi)箱門，以免驟然 降溫導(dǎo)致玻璃器皿炸裂。3、為什么干熱滅菌比濕熱滅菌所需要的溫度高，時(shí)間長(zhǎng)？答：細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)在菌體受熱時(shí)環(huán)境和細(xì)胞 水的含量越大，則蛋白質(zhì)凝固就越快，反之，含水量越少，凝固就越慢。所以干 熱滅菌比濕熱滅菌所需要的溫度更高，時(shí)間更長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)四二、基原理牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基

8、礎(chǔ)培養(yǎng)基有時(shí)又 稱為普通培養(yǎng)基配方為肉膏 3g白胨 10g 5g 1000ml， pH 。中牛肉為生物供源、能、磷酸和維生，白胨 主提供氮，而 提供無(wú)鹽在配制固體培養(yǎng)基時(shí)還要加入一定量的瓊 脂作凝固劑。瓊脂常用濃下 96時(shí)溶化一實(shí)際用在沸水中或下 面以石棉煮溶化以瓊脂焦瓊脂時(shí)固通常不微物 分利用。任何一種培養(yǎng)基，一經(jīng)制成就應(yīng)及時(shí)徹底滅菌，以備培養(yǎng)微生物使用，一般 培養(yǎng)基的滅菌采用高壓蒸汽滅菌法壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密 閉的加壓滅菌鍋內(nèi)通過(guò)加熱使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽待水蒸氣 急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡然后關(guān)閉排氣閥繼續(xù)加熱此時(shí)由于 蒸汽不能逸出，滅菌鍋內(nèi)的壓力增加，

9、使沸點(diǎn)增高，得到高 100的溫度。導(dǎo) 致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。注意點(diǎn)節(jié) （4）升壓、保壓和降壓：關(guān)閉排所閥后，鍋內(nèi)壓力開(kāi)始上升。當(dāng)壓力升到所 需壓力（一般培養(yǎng)基和器皿滅菌控制 121 分鐘）時(shí)，控制熱源，維持壓力 到所需時(shí)間后，停止加熱，待壓力降至接 ”，打開(kāi)排氣閥排氣。注意不能 過(guò)急地排氣則會(huì)由于鍋內(nèi)壓力突然下降而造成鍋內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不 平衡而沖出燒瓶口或試管口，和使棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。（5）無(wú)菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入 的溫室中培養(yǎng) 2448 小時(shí)，經(jīng)檢 查無(wú)菌生長(zhǎng)，可保存?zhèn)溆?。思考題1、培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基應(yīng)具備哪些條件？為什么？答：碳源：提供微生物營(yíng)養(yǎng)碳素（碳

10、架）氮源：提供微生物生長(zhǎng)、繁殖所需氮元素?zé)o機(jī)鹽大量元素細(xì)胞內(nèi)的成分滲透壓成分定 PH的激活劑 ； 微量元素：酶的激活劑，特殊分子或結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)因子一種微生物正常代謝必不可少且不能由簡(jiǎn)單碳源氮源合成的 有機(jī)物，一般需要量很少，在微生物體能的功能主要是輔酶或輔基水：在生命過(guò)程中必不可少2、在配制培養(yǎng)基的操作過(guò)程中應(yīng)注意些什么問(wèn)題？答：1、當(dāng)然是注意濃度配比不要搞錯(cuò)2、很多培養(yǎng)基的加料順序有講究，否則會(huì)有沉淀產(chǎn)生3、有些培養(yǎng)基會(huì)有不溶物質(zhì)，分裝前應(yīng)搖勻4、不要忘了調(diào)節(jié) 值（一般細(xì)菌都需要，酵母可能自然 就行，不 過(guò)不一定）5、加熱溶解時(shí)盡量不要煮沸，會(huì)損失營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)3、培養(yǎng)基配制完后，為什么要及時(shí)滅菌？若

11、不能及時(shí)滅菌，應(yīng)如何處理？ 答：培養(yǎng)基里含有豐富的氮源，碳源，微量元素等等。如果不立即滅菌，那么，就會(huì)長(zhǎng)菌。你可能會(huì)認(rèn)為再滅菌不就可以了？！但是，很多的微生物，特別 是真核微生物在生長(zhǎng)的時(shí)候會(huì)改變?nèi)芤旱?PH同時(shí)滅菌后細(xì)胞破碎，帶入新的 氨基酸，蛋白等，這些都是試驗(yàn)不穩(wěn)定的因素。如果不能立刻滅菌，應(yīng)該在配置 培養(yǎng)基的時(shí)候直接稱取粉末不加入水溶解可在室溫保存如果加入的是液體 的，已經(jīng)配置好的培養(yǎng)基，應(yīng)該在 4 度并保存，但時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。4、高壓蒸汽滅菌中為什么要把冷空氣排凈，為什么在滅菌后不能驟然快速降 壓？答：在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時(shí)，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全是極為重 要的因?yàn)榭諝獾呐蛎?/p>

12、壓大于水蒸氣的膨脹壓所以水蒸氣中含有空氣時(shí)， 在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。如果驟然快速降壓，就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓 力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。實(shí)驗(yàn)五二、基原理將微生物的培養(yǎng)物或含有微生物的樣品移植到培養(yǎng)基上的操作技術(shù)稱為接 種接種是微生物實(shí)驗(yàn)及科學(xué)研究中的一項(xiàng)最基本的操作技術(shù)無(wú)論微生物的分 離、培養(yǎng)、純化或鑒定經(jīng)及有關(guān)微生物的形態(tài)觀察及生理研究都必須進(jìn)行接種。 接種的關(guān)鍵是要嚴(yán)格的進(jìn)行無(wú)菌操作如操作不慎引起污染則實(shí)驗(yàn)結(jié)果就不可 靠。影響下一步工作的進(jìn)行。微生物的培養(yǎng)特征是指微生物在固體半固體和液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)后

13、所表現(xiàn) 出的群體生長(zhǎng)特征不同的微生物有其固有的培養(yǎng)特征這些特征可以作為不同 種類微生物的鑒別特征之一并能為識(shí)別純培養(yǎng)是否被污染作為參考了解它們 的培養(yǎng)征、掌握其長(zhǎng)規(guī)律識(shí)別、控制利用微物具有重要值。固體培基又分平板斜面兩形式在平板主要察菌落面結(jié)構(gòu)形 態(tài)及邊狀況（如 P75 ）斜面主要察菌苔形態(tài)。思考題1、用斜面檢測(cè)微生物的培養(yǎng)特征接種時(shí)，為什么不要?jiǎng)澏鄺l線或蛇形，而只要 劃一條直線？答用斜面接種微生物是為了能挑去微生物培養(yǎng)的單菌落若劃多條線或蛇形容 易形成菌苔，失去斜面的培養(yǎng)意義。2、接種環(huán)針)接種前后灼燒的目的是什么？為什么在接種前一定要將其冷卻？ 如何判斷燒過(guò)的接種環(huán)已冷卻？答：為了消毒滅菌

14、芽孢等，消滅可能引起污染的一切生物體；若沒(méi)有冷卻的話，接種的微生物也會(huì)被灼燒致死，所以一定要冷卻；一般用接種環(huán)在玻璃器皿的上蓋內(nèi)側(cè)接觸一會(huì)（大約 5s后用接種環(huán)接觸 培養(yǎng)基，培養(yǎng)基沒(méi)有被燙壞，沒(méi)有冷熱物接觸而發(fā)出滋滋聲，就認(rèn)為已冷卻，可 以接種了。3、試述如何在操作中貫徹?zé)o菌操作的原則？答在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌操作或在酒精燈附近操作且接種前后接種環(huán)都需要過(guò) 火并灼燒成紅色。試管口（接種管）開(kāi)關(guān)試管帽前后也需過(guò)火，若為平板培養(yǎng)則 倒平板過(guò)程前后培養(yǎng)基的開(kāi)口處都要在火焰中過(guò)一下接種完畢后接種環(huán)仍需 要過(guò)火消毒。在個(gè)人操作時(shí)盡量挽起衣袖，雙手 70%酒精消毒，并戴上手套操 作。實(shí)驗(yàn)六二、基原理革蘭氏染色

15、將細(xì)菌分為革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性由這兩類細(xì)菌細(xì)胞壁的 結(jié)構(gòu)和組成不同決定的蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組 成、壁厚、類脂質(zhì)量低，用乙醇脫色時(shí)細(xì)胞壁脫水，使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑 縮小透性降低從而使結(jié)晶紫碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)經(jīng) 脫色和復(fù)染后仍保留初染劑的藍(lán)紫色革蘭氏陰性不同由于細(xì)胞壁肽聚糖層較 薄，類脂含量高。所以當(dāng)脫色處理時(shí)，類脂質(zhì)被乙醇溶解，細(xì)胞壁透性增大，使 結(jié)晶紫碘的復(fù)合物比較容易被洗脫用復(fù)染劑復(fù)染后細(xì)胞被染上復(fù)染劑的 紅色。革蘭氏色反應(yīng)是細(xì)重要的別特征，為證染色果的正確性采用 規(guī)范的色方法是十重要的2、初染滴加結(jié)晶紫（以剛好將菌膜覆蓋為宜）染色 水洗。3、

16、媒染用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約 1min，水洗。4、脫色用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加 的乙醇脫色，直至流出的乙醇無(wú)紫色時(shí)，立即水洗。革蘭氏色結(jié)果是否確，乙脫色是革蘭染色操的關(guān)鍵環(huán)節(jié)脫色 不足，性菌被誤染陽(yáng)性菌脫色過(guò)度，性菌被染成陰性菌脫色時(shí) 一般約 30s。5、復(fù)染用番紅液復(fù)染約 2min，水洗6、鏡檢干燥后，用油鏡觀察。菌體被染成藍(lán)紫色的是革蘭氏陽(yáng)性菌，被染成紅色的是革蘭氏陰性菌。 思考題1 你認(rèn)為哪些環(huán)節(jié)會(huì)影響革蘭氏染色結(jié)果的正確性？其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是什 么？涂片過(guò)程中涂片不宜過(guò)厚；初染；媒染；脫色；復(fù)染。最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是乙醇脫色。脫色不足，陰性菌被誤染成

17、陽(yáng)性菌；脫色過(guò)度，陽(yáng)性 菌被誤染成陰性菌，脫色時(shí)間一般約 2030s2、你的染色結(jié)果是否正確？如果不正確，請(qǐng)說(shuō)明原因。答：染色結(jié)果正確。3、革蘭氏染色時(shí)，初染前加碘液?jiǎn)?？乙醇脫色后?fù)染之前，革蘭氏陽(yáng)性菌和革 蘭氏陰性菌應(yīng)分別是什么顏色？答：不加碘液。乙醇的脫色后復(fù)染前，革蘭氏陽(yáng)性菌為淡紫色，革蘭氏陰性菌為 無(wú)色。實(shí)驗(yàn)七二、基原理平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后，其中的微生物充分分散成單個(gè) 細(xì)胞取一定量的稀釋樣液接種到平板上經(jīng)過(guò)培養(yǎng)由每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而 形成肉眼可見(jiàn)的菌落，即一個(gè)菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)， 根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)（平板菌計(jì)數(shù)法

18、 然操作繁，結(jié)果需培養(yǎng)一時(shí)間才能取，而且定結(jié)果易受種因素 影響，是，由于其大的優(yōu)是可以獲得菌的信，所以廣泛用于生 制品檢，食品、飲和水等含菌指數(shù)或染程度檢測(cè)）本實(shí)驗(yàn)是用源水的平板菌落計(jì)數(shù)技術(shù)測(cè)定水中細(xì)菌總數(shù)。由于水中細(xì)菌種類 繁多它們對(duì)營(yíng)養(yǎng)和其他生長(zhǎng)條件的要求差別很大不可能找到一種培養(yǎng)基在一 種條件下使水中所有的細(xì)菌均能生長(zhǎng)繁殖因此以一定的培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng) 出來(lái)的菌落計(jì)算出來(lái)的水中細(xì)菌總數(shù)僅是一種近似值目前一般是采用普通肉 膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。思考題1、要使平板菌落計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，需要掌握哪幾個(gè)關(guān)鍵？為什么？答板菌落計(jì)數(shù)法是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單 細(xì)胞繁殖而成的現(xiàn)象進(jìn)行的

19、因此首先將待測(cè)樣品作一系列稀釋稀釋度的選擇 很重要，以三個(gè)稀釋度中的第二稀釋度倒平板所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在 個(gè)左右 為最好再取一定量的稀釋菌液接種到培養(yǎng)皿中使其均勻分布于平皿中的培養(yǎng) 基內(nèi)那么平板的均勻程度也是很重要培養(yǎng)過(guò)程中的溫濕度控制也很關(guān)鍵經(jīng) 培養(yǎng)后由單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖形成菌落統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目即可換算出樣品中的含 菌數(shù)。2、你所測(cè)的水源的污穢程度如何？3、試比較平板菌落計(jì)數(shù)衍和顯微鏡直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用。答平板計(jì)數(shù)能有效地檢出活菌但是時(shí)間長(zhǎng)受到培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件等系列因素 的影響，而鏡檢雖然簡(jiǎn)單快速，但是檢出的是總菌數(shù)，包括死活，另外由于其是 選擇其中一個(gè)區(qū)域來(lái)計(jì)數(shù)，存在一定的誤差。實(shí)驗(yàn)八二、

20、基原理酵母菌是不運(yùn)動(dòng)的單細(xì)胞真核微生物大小通常比常見(jiàn)細(xì)菌大幾倍甚至十 幾倍大多數(shù)酵母菌以出芽方式進(jìn)行無(wú)性繁殖有的分裂繁殖本實(shí)驗(yàn)通過(guò)美藍(lán) 染液水浸片和水一碘液水浸片來(lái)觀察酵母菌的形態(tài)和出芽生殖方式。美藍(lán)是一種無(wú)毒性的染料它的氧化型呈藍(lán)色還原型無(wú)色用美藍(lán)對(duì)酵母 的活細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)，由于細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力， 能使美藍(lán)有藍(lán)色的氧化型變成無(wú)色的還原型因此具有還原能力的酵母活細(xì)胞 是無(wú)色的而死細(xì)胞或代謝作用微弱的衰老細(xì)胞呈藍(lán)色或淡藍(lán)色借此即可對(duì)酵 母菌的死細(xì)胞和活細(xì)胞進(jìn)行鑒別。思考題1、呂式堿性美藍(lán)染液濃度和作用時(shí)間的不同，對(duì)酵母菌死細(xì)胞數(shù)量有何影響？ 試分析其原因。答式堿性美藍(lán)

21、染液濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致死細(xì)胞越來(lái)越多。 （2）染色劑作用時(shí)間較慢，隨時(shí)間的增加，被染的死細(xì)胞數(shù)目增多。染色 劑逐漸導(dǎo)致菌體細(xì)胞脫水隨時(shí)間增加死亡數(shù)目增多隨染色時(shí)間增加更多 的代謝緩慢的老細(xì)胞被染色，從而觀察時(shí)被當(dāng)成了死細(xì)胞。2、在顯微鏡下，酵母菌有哪些突出的特征區(qū)別與一般細(xì)菌？答通光學(xué)顯微鏡下首先是酵母菌要比細(xì)菌大的多酵母菌具有細(xì)胞核而細(xì)菌沒(méi) 有細(xì)胞核只有擬核也就是核區(qū)如果酵母菌在進(jìn)行出牙繁殖可以清晰看到從菌 體出的芽有些細(xì)菌具有鞭毛，而酵母菌不具有鞭毛。酵母菌呈卵圓形、圓形、圓 柱形或檸蒙形,菌落形態(tài)與細(xì)菌相似但較大較厚呈乳白色或紅色表面濕潤(rùn)、 粘稠。微生物學(xué)驗(yàn)考試?yán)碚撛囶}班級(jí)姓

22、名學(xué)號(hào)成績(jī)1. 革藍(lán)式染的基本操作步驟？細(xì)染色的部位？那一最關(guān)鍵，色過(guò)度或不足會(huì)出現(xiàn)什么問(wèn)題 步驟：1制片。取活躍生長(zhǎng)期菌種按常規(guī)方法涂片（不宜過(guò)厚燥和固定2初染。滴加草酸銨結(jié)晶紫染液覆蓋涂菌部位，染色 傾去染液，水洗至流出水無(wú)色；3媒染。先用盧戈氏碘液沖去殘留水跡，再用碘液覆蓋 去碘液，水洗至流出水無(wú)色；4脫色。將玻片上殘留水用吸水紙吸去，在白色背景下用滴管流加 乙醇色（一般 20-30s ）,流出 液無(wú)色時(shí)立即用水洗去乙醇；5復(fù)染。將玻片上殘留水用吸水紙吸去，用番紅復(fù)染液染色 水洗，吸去殘水晾干；6鏡檢。油鏡觀察。細(xì)胞壁革蘭氏染成敗的關(guān)鍵是精脫色。如脫色過(guò)度，革蘭氏陽(yáng)性菌也可被脫色而染成陰

23、性菌；如脫色時(shí) 間過(guò)短，革蘭氏陰性菌也會(huì)被染成革蘭氏陽(yáng)性菌。脫色時(shí)間的長(zhǎng)短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的 影響，難以嚴(yán)格規(guī)定。2. 為什么濕滅菌比干式滅菌溫度？在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大。原因有三：一是濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝 固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低；二是濕熱的穿透力比干熱大；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在。 1g 水 100時(shí)，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可放 2.26kj 的熱量這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從 而增加滅菌效力。3. 大腸菌群測(cè)定時(shí)常采用什么方法，分那幾步？該方法與菌落總數(shù)測(cè)定的原理有何不同？常用多管發(fā)酵法，包括初發(fā)酵試驗(yàn)、平板分離和復(fù)發(fā)酵

24、試驗(yàn)三步。不同： 落總數(shù)：指在一定條件下（如需氧情況、營(yíng)養(yǎng)條件 pH培養(yǎng)溫度和時(shí)間等）每克（每毫升）檢 樣所生長(zhǎng)出來(lái)的細(xì)菌菌落總數(shù)，由于現(xiàn)有條件不能滿足其生理需求，故難以繁殖生長(zhǎng)所有細(xì)菌，所以它并 不表示實(shí)際中的所有細(xì)菌總數(shù)，菌落總數(shù)并不能區(qū)分其中細(xì)菌的種類。大腸菌群：指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。該法可以確定大腸 菌群的存在和菌群近似值。4. 高壓蒸汽菌開(kāi)始前為什么要排？舉例（ ）說(shuō)明用的高壓菌條件？冷空氣的熱膨脹系數(shù)大，若無(wú)菌鍋內(nèi)留有冷空氣，當(dāng)滅菌鍋密閉加熱時(shí)，冷空氣受熱很快膨脹，使壓 力上升，造成滅菌鍋內(nèi)壓力與溫度不一致，產(chǎn)生假性蒸汽壓，鍋內(nèi)溫度低于蒸

25、汽壓表示的相應(yīng)的溫度，致 使滅菌不能徹底。特別是使用只裝有壓力表，沒(méi)有溫度表的滅菌鍋時(shí)，尤應(yīng)注意。如：0.1MPa, 115 ，30min 0,1MPa,121 ,20min5. 劃線培養(yǎng)可分曲線和分段法，述各自適用對(duì)象？何確定平上單個(gè)菌落是否為純培養(yǎng)？6. 平板法菌總數(shù)測(cè)定時(shí)主要的注事項(xiàng)有哪些？7. 九管法測(cè)腸菌群時(shí)，取樣品 加入 225ml 生理鹽水中，然后分別取 釋液， 添加到相稀釋度的乳糖膽鹽培基中。 37培養(yǎng) ，產(chǎn)氣數(shù)管數(shù)分別為 2，2經(jīng)分離、驗(yàn)證 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)倍乳糖發(fā)酵管（ 10ml 組） 1 管產(chǎn)氣，1ml 組有 2 管產(chǎn)氣， 組無(wú)產(chǎn)氣。請(qǐng)報(bào)告其大 腸桿菌數(shù)1108. 根據(jù)下表報(bào)告樣

26、的菌落總：稀釋倍數(shù)101010菌落總數(shù)平板 1平板 2多不可計(jì)多不可計(jì)19230528389. 紫外線殺原理？最佳殺菌波長(zhǎng)多少？細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)體芽孢對(duì)紫線的抵抗能力一樣嗎？紫外線殺菌機(jī)制主要是因?yàn)樗T導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成和 DNA 的交聯(lián)而抑制 DNA 的復(fù)制， 另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成O ，再使 氧化成臭氧或使水氧化成過(guò)氧化氫，臭氧和過(guò)氧 化氫均有殺菌作用。最佳殺菌波長(zhǎng)為 右。不一樣。芽孢抵抗能力大于細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)體10. 常用的平板分離方法有那三種？各有什么優(yōu)缺點(diǎn)？11. 油鏡觀察的注意事項(xiàng)？滴加什么油？起什么作用？將高倍鏡轉(zhuǎn)離工作位置，在待觀察的樣品區(qū)域滴上一滴香柏油，將油鏡轉(zhuǎn)到工作位置，油鏡鏡頭此時(shí) 正好浸泡在鏡油中。注意： 不可將高倍鏡轉(zhuǎn)動(dòng)經(jīng)過(guò)加有鏡油的區(qū)域。香柏油，為了增加顯微鏡的分辨率。12. 簡(jiǎn)述革蘭染色的基本原理？根據(jù)所學(xué)知識(shí)判斷沙門氏桿菌乳酸鏈球是陽(yáng)性還是陰性菌？P82.沙門氏為陰性，乳酸鏈球菌為陽(yáng)性13. 細(xì)菌芽胞為什么抵抗不良