南方醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué) 第二章 研究方法課件

1、第一節(jié) 顯微鏡技術(shù) 光學(xué)顯微鏡 : 觀察顯微結(jié)構(gòu) （light microscope)顯微鏡 電子顯微鏡 : 觀察亞微結(jié)構(gòu) (electron microscope) 第二章.細(xì)胞生物學(xué)研究方法分辨率公式n = 介質(zhì)折射率（空氣1，水1.33，香柏油1.5）= 標(biāo)本對(duì)物鏡鏡口張角的半角， sin的最大值為1。= 照明光源的波長，白光0.5 m 。橫向分辨率 Rx,y=0.61/nsin 縱向分辨率 Rz=2/(nsin)2 退 出Technology for Cell Biology首 頁(一)普通光學(xué)顯微鏡的分辨率：0.2微米一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)思考：如何提高顯微鏡的分辨能力？人眼的分辨率：1

2、00 m不同光線的波長名 稱 波 長 (nm) 可見光 760-390 紫外光 390-13 X射線 13-0.05 射線 1-0.005 電子束: 100V 0.123 10,000V 0.0122 100,000V 0.00387 （二）普通光學(xué)顯微鏡的成像原理 光鏡的結(jié)構(gòu) 光學(xué)部分 照明部分 機(jī)械部分在普通光學(xué)顯微鏡下，細(xì)胞結(jié)構(gòu)呈半透明狀，不易看清。往往將標(biāo)本切片進(jìn)行染色提高可辨程度。移動(dòng)臂蠟或樹脂包埋的樣品切片用鋼刀樣品切片蠟帶伸展在蓋玻片和載玻片之間的切片切片機(jī)（三） 熒光顯微鏡以紫外線為光源，照射被檢物體發(fā)出能觀察到的熒光。熒光顯微鏡顯示同一細(xì)胞中的多種結(jié)構(gòu)成分細(xì)胞核內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞骨架

3、通過致密部分(如細(xì)胞核),速度慢通過疏松部位(如細(xì)胞質(zhì)),速度快相位差(光程差)振幅差(明暗差)相差顯微鏡 倒置相差顯微鏡載物臺(tái)的上方： 光源 長焦距聚光器載物臺(tái)的下方： 物鏡應(yīng)用：直接對(duì)培養(yǎng)的 細(xì)胞進(jìn)行觀察體外培養(yǎng)的細(xì)胞(a)：正在分裂生長的Hela 細(xì)胞(b)：CHO單層細(xì)胞的培養(yǎng)用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。(五)激光共聚焦顯微鏡二、電子顯微鏡1.透射電子顯微鏡分辨率= 0.1 nm2.掃描電子顯微鏡-標(biāo)本表面的三維結(jié)構(gòu)顯示細(xì)胞表面三維立體結(jié)構(gòu)顯示細(xì)胞斷面三維立體結(jié)構(gòu)電鏡與光鏡的比較顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMTEM20

4、0nm100nm0.1nm可見光（400-700） 紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa利用樣品對(duì)光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對(duì)電子的散射和透射形成明暗反差一.細(xì)胞組分的分級(jí)分離 第二節(jié).細(xì)胞生物學(xué)其他研究方法分離不同類型細(xì)胞 大小 密度 形狀 小 輕 不規(guī)則 大 重 圓形二 細(xì)胞培養(yǎng)（一）細(xì)胞培養(yǎng) 從機(jī)體中取出組織或細(xì)胞，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，使之能夠繼續(xù)生存的一種方法。（二）分類原代培養(yǎng)(primary culture):直接從生物體獲取 細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)(secondary culture)：將原代培養(yǎng)的細(xì) 胞以定比例擴(kuò)大培養(yǎng)。體外培養(yǎng)的細(xì)胞(a)：正在分裂生長的Hela 細(xì)胞(b)：CHO單層細(xì)胞的培養(yǎng)三、細(xì)胞融合（細(xì)胞雜交）1.概念：在自發(fā)或人工誘導(dǎo)下，相同或不同基因型細(xì)胞之間相互融合的過程。2.誘導(dǎo)因子：生物：仙臺(tái)病毒 化學(xué)：聚乙二醇 物理：電脈沖3.分類： 異核體：不同基因的細(xì)胞核融合 同核體