多肽藥物分析課件

1、第十一章 多肽藥物分析一、前言二、合成多肽藥物藥學(xué)研究的基本考慮三、合成多肽藥物藥學(xué)研究的主要內(nèi)容（一）制備工藝研究（二）結(jié)構(gòu)確證研究（三）制劑處方工藝研究（四）質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（五）穩(wěn)定性研究一、前言1.1多肽類藥物產(chǎn)生的背景: 20世紀(jì)70年代生物技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，使多肽等生物技術(shù)藥物的研究進(jìn)展迅速；多肽固相合成技術(shù)高效液相色譜（HPLC）純化分析技術(shù)的發(fā)展1.2合成多肽藥物概念: 指采用化學(xué)合成方法制備的多肽類藥物。包括采用液相或固相合成方法制備的多肽藥物。1.3化學(xué)合成在多肽分類:純天然多肽：經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾的天然多肽: 增加多肽與受體的親和力、選擇性; 對酶降解的抵抗力、改善藥代

2、動(dòng)力學(xué)特性; 甚至由受體的激動(dòng)劑變?yōu)檗卓箘?二、合成多肽藥物藥學(xué)研究的基本考慮1、關(guān)于多肽（原料藥）合成工藝選擇的考慮 目前主要有液相合成和固相合成兩種方法。液相合成:逐步合成或片段縮合方法。逐步合成法:片段縮合:液相合成的優(yōu)點(diǎn): 中間產(chǎn)物純化、中間產(chǎn)物的理化常數(shù)、可以隨意進(jìn)行非氨基酸修飾、可以避免氨基酸缺失缺點(diǎn)是較為費(fèi)時(shí)、費(fèi)力等。 固相合成: 優(yōu)點(diǎn) 簡化了每步反應(yīng)的后處理操作，避免因手工操作和物料轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的損失，產(chǎn)率較高且能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化等缺點(diǎn) 每步中間產(chǎn)物不可以純化，必須采用較大的氨基酸過量投料，粗品純度不如液相合成物，必需通過可靠的分離手段進(jìn)行純化等。2、關(guān)于多肽結(jié)構(gòu)確證研究的考慮 氨基

3、酸組成分析、質(zhì)譜、氨基酸序列測定等對其結(jié)構(gòu)確證有重要意義。 對于具有一定空間結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮其活性的多肽，應(yīng)進(jìn)行必要的立體化學(xué)研究。3、關(guān)于多肽制劑處方工藝研究的考慮 合成多肽藥物制劑研究的總體目標(biāo)和要求與其它類型化學(xué)藥物制劑是一致的，即通過一系列研究工作，保證制劑劑型選擇依據(jù)充分、處方合理、工藝穩(wěn)定、生產(chǎn)過程得到有效控制，并能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。 但是，由于多肽藥物的生物活性可能和其空間結(jié)構(gòu)相關(guān)，多肽分子中存在大量的酰胺鍵，另外還可能有羧基、羥基、氨基、巰基等較為活潑的基團(tuán)，較易水解或降解，因此了解合成多肽藥物的物理化學(xué)穩(wěn)定性和生物學(xué)穩(wěn)定性對選擇適宜的劑型和合理的處方、制備工藝有重要作用。注意工藝雜

4、質(zhì):缺失(不完全)肽、斷裂肽、去酰胺多肽、氨基酸側(cè)鏈的不完全脫保護(hù)所形成的副產(chǎn)物、氧化肽、二硫鍵交換的產(chǎn)物、非對映異構(gòu)的多肽、低聚物和/或聚合物毒性試劑和溶劑5、關(guān)于多肽藥物穩(wěn)定性研究的考慮多肽藥物不穩(wěn)定的原因:水解、氧化、外消旋化、二硫鍵的斷裂及重排、消除、凝聚、沉淀、吸附等。穩(wěn)定性研究應(yīng)根據(jù)多肽藥物穩(wěn)定性的特點(diǎn)合理選擇試驗(yàn)條件、考察項(xiàng)目。（一）原料藥制備工藝研究1、工藝選擇 根據(jù)目標(biāo)肽的結(jié)構(gòu)、自身生產(chǎn)條件等考慮選用液相合成或固相合成工藝。 均需要提供: 化學(xué)反應(yīng)式、工藝流程圖、操作過程等，對工藝參數(shù)（如投料量、反應(yīng)條件、反應(yīng)試劑）要有詳細(xì)的描述，包括對于多肽的修飾（例如二硫鍵的形成等）。2

5、、起始原料、試劑的質(zhì)量控制氨基酸及其衍生物氨基酸及其衍生物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一般應(yīng)包括:性狀、熔點(diǎn)、比旋度、化學(xué)純度、色譜純度及光學(xué)純度、含量等，其中化學(xué)純度和光學(xué)純度的控制尤為重要。如果使用了特殊的氨基酸或其衍生物,申報(bào)資料中還應(yīng)提供其合成工藝及結(jié)構(gòu)研究的相關(guān)資料。樹脂采用固相合成方法制備多肽，應(yīng)提供樹脂的來源、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢驗(yàn)報(bào)告，并對樹脂的摩爾取代系數(shù)、在不同溶劑中的膨脹系數(shù)、所用合成條件下的穩(wěn)定性情況、交聯(lián)度等予以說明。常用樹脂包括聚苯乙烯-苯二乙烯交聯(lián)樹脂、聚丙烯酰胺和聚乙烯-乙二醇類樹脂及衍生物等，應(yīng)根據(jù)目標(biāo)多肽C末端氨基酸的不同類型（如羧酸型、酰胺型等）選擇特定用途的樹脂，并說明選擇的依據(jù)

6、。3、工藝的過程控制（1）反應(yīng)終點(diǎn)監(jiān)控液相合成屬于常規(guī)有機(jī)合成，一般可采用色譜法(如TLC法、HPLC法)監(jiān)測；固相合成偶合反應(yīng)的終點(diǎn)可采用茚三酮法、三硝基苯磺酸（TNBS）法和四氯苯醌等監(jiān)測。二硫鍵連接的終點(diǎn)可用Ellman試驗(yàn)或HPLC法監(jiān)測。（2）中間體質(zhì)量控制液相合成： 縮合片段：比旋度、熔點(diǎn)和純度等進(jìn)行控制。 較長序列的中間體：氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、質(zhì)譜、比旋度等。固相合成：一般無中間體分離過程。但如果多肽從樹脂上切割后還需進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)，對中間體的質(zhì)量也要進(jìn)行相應(yīng)控制，同時(shí)還要進(jìn)行相應(yīng)的結(jié)構(gòu)研究。 4、分離和純化多肽純化的方法包括：重結(jié)晶、逆流分布、電泳、離子交換色譜、凝膠

7、過濾色譜、反相色譜等。常見的純化方法：凝膠柱脫鹽，制備型高效液相色譜純化。樣品的干燥方法：常用凍干法，如果多肽對溫度不敏感，也可采用室溫或高溫干燥。（二）結(jié)構(gòu)確證研究多肽結(jié)構(gòu)研究的主要目的： 是要說明其氨基酸組成，序列是否正確，多肽分子中如有半胱氨酸，應(yīng)明確其狀態(tài)（氧化態(tài)或還原態(tài)），對含有多個(gè)半胱氨酸的多肽，應(yīng)明確二硫鍵的正確連接位點(diǎn)。對于長肽，需要對其空間結(jié)構(gòu)（例如二級、三級結(jié)構(gòu)）進(jìn)行研究。短肽： 元素分析、紅外光譜、核磁共振譜、氨基酸組成分析、質(zhì)譜等常見方法，氨基酸序列測定。中、長肽： 氨基酸組成，氨基酸序列分析。（Edman降解，質(zhì)譜：分子量及其序列信息，是對Edman降解的很好補(bǔ)充。）

8、（四）質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1、質(zhì)量研究原料藥的質(zhì)量研究研究項(xiàng)目一般包括： 外觀性狀、理化常數(shù)、鑒別、氨基酸組成分析、水分、反離子含量、純度、有機(jī)溶劑和反應(yīng)試劑殘留量、生物學(xué)安全性檢查、含量和/或活性效價(jià)測定等。對于合成多肽藥物，除常規(guī)項(xiàng)目外，理化常數(shù)一般需要關(guān)注其比旋度、等電點(diǎn)（pI）、溶解性（主要為水和緩沖液中）等。 氨基酸組成分析、反離子（例如三氟醋酸或醋酸根）含量、反應(yīng)試劑殘留量（例如從樹脂上裂解多肽使用了氫氟酸，需要檢查氟化物殘留量）等，則需要在原料藥質(zhì)量研究中予以重視。相關(guān)肽檢查（或稱有關(guān)物質(zhì)檢查）：RP-HPLC，（HPIEC）、毛細(xì)管電泳技術(shù)，高效分子排阻色譜（HPSEC）、（PA

9、GE）以及激光散射粒度測定等技術(shù)。有關(guān)物質(zhì)檢查的方法學(xué)驗(yàn)證應(yīng)能證明所采用的方法可以有效分離目標(biāo)多肽與工藝雜質(zhì)（例如缺失肽等）、降解產(chǎn)物（例如二硫鍵交換或氧化產(chǎn)物等）、聚合物等。一般應(yīng)考察兩種以上不同原理的方法，高效液相色譜法至少應(yīng)包括一種梯度洗脫方法，并采用多肽粗品和強(qiáng)制降解試驗(yàn)等對方法的專屬性等進(jìn)行考察、對比，此外還應(yīng)注意研究多波長檢測的結(jié)果并選擇合適的檢測波長等 合成多肽因結(jié)構(gòu)特征不同于通常的小分子化學(xué)藥品，純度檢查有時(shí)難以從根本上有效控制產(chǎn)品安全性，需要進(jìn)行必要的生物學(xué)安全性檢查（如過敏試驗(yàn)、降壓物質(zhì)、升壓物質(zhì)、異常毒性等）以全面控制產(chǎn)品質(zhì)量、保證安全性。此外，根據(jù)產(chǎn)品具體情況，對于長肽

10、，有時(shí)尚需進(jìn)行免疫原性或抗原活性等生物特性的研究。含量測定 評價(jià)多肽質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，理化方法測定其含量時(shí)稱為“含量測定”，生物學(xué)方法或酶化學(xué)方法測定其效價(jià)時(shí)稱為“效價(jià)測定”。對于短肽，理化方法測得的含量可以反映其有效程度時(shí)，首選簡單、通用的含量測定方法；對于具有一定空間結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮其活性的多肽，需進(jìn)行生物學(xué)方法或酶化學(xué)方法測定藥物活性（效價(jià)）的研究，包括含量與活性的關(guān)系、相應(yīng)的方法學(xué)驗(yàn)證等。（2）制劑的質(zhì)量研究 合成多肽制劑的質(zhì)量研究基本思路和要求可參照化學(xué)藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立的規(guī)范化過程指導(dǎo)原則、化學(xué)藥物制劑研究指導(dǎo)原則等相關(guān)內(nèi)容，根據(jù)合成多肽的具體特點(diǎn)，在原料藥質(zhì)量研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合劑型特

11、點(diǎn)、處方工藝以及臨床使用特點(diǎn)，重點(diǎn)研究所用輔料和制劑工藝對產(chǎn)品質(zhì)量的影響、制劑輔料和制劑產(chǎn)生的降解產(chǎn)物對檢測方法的影響以及與劑型相關(guān)的質(zhì)量要素。研究項(xiàng)目一般亦應(yīng)包括性狀、鑒別、檢查（安全性、均一性、純度要求與有效性指標(biāo)等）、含量或效價(jià)測定等幾個(gè)方面。2、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括氨基酸組成、等電點(diǎn)、中長肽的肽圖等。合理可行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)能有效控制產(chǎn)品質(zhì)量以保證臨床用藥的安全性和有效性，并有效地控制藥品批間質(zhì)量的一致性。化學(xué)藥物雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則。（五）穩(wěn)定性研究合成多肽藥物穩(wěn)定性研究的基本原則應(yīng)遵循化學(xué)藥物穩(wěn)定性研究的技術(shù)指導(dǎo)原則的一般性要求。與一般化學(xué)藥物相比，多肽藥物的穩(wěn)定性較差。穩(wěn)定性

12、研究應(yīng)根據(jù)多肽藥物穩(wěn)定性的特點(diǎn)合理選擇試驗(yàn)條件、考察項(xiàng)目。加速試驗(yàn)和長期留樣試驗(yàn)的試驗(yàn)條件應(yīng)依據(jù)藥物對溫度、濕度和光照等條件的敏感程度考察（影響因素試驗(yàn)）基礎(chǔ)上選擇；考察項(xiàng)目除常規(guī)項(xiàng)目（例如原料藥的比旋度、有關(guān)物質(zhì)和含量等）外，根據(jù)具體情況，可能還需要考察其生物活性的變化。與其他化學(xué)藥物不同，多肽藥物可能具有一定程度的表面活性，有與直接接觸藥品的包裝材料和容器發(fā)生吸附等相互作用的可能，從而引起制劑效價(jià)、生物活性下降。例如有些多肽分子能夠與玻璃表面的硅醇基發(fā)生相互作用。因此，在包裝材料的選擇方面需注意其與多肽藥物相互作用的研究，有些情況下可選擇特殊處理后的包裝容器，如表面經(jīng)硅烷化處理的容器等。生

13、物半衰期短 蛋白多肽類藥物進(jìn)入體內(nèi)后可以被酶迅速代謝降解，半衰期通常很短，如血管緊張素II的半衰期l min，胰島素在人體半衰期9 min，組織纖溶酶原激活物為2655min。多肽藥物藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)具有首關(guān)效應(yīng) 蛋白多肽類藥物直接口服給藥，在經(jīng)過胃腸道和肝臟時(shí)會被部分代謝，使得進(jìn)入體循環(huán)的藥量減少。如胰島素首次經(jīng)過肝臟有40 一50的藥量被清除。故早期蛋白多肽類藥物往往采用非口服給藥，如注射給藥、鼻腔給藥、眼部給藥等 但口服給藥是最方便的給藥方式，尤其適用于長期用藥，所以，研制口服蛋白多肽類藥物逐漸成為發(fā)展的主要趨勢。生物利用度低 由于蛋白多肽類藥物的生物半衰期短，加上胃腸道和肝臟的首關(guān)效應(yīng)等

14、原因，其生物利用度通常較低。特別是口服給藥，因其分子量大，不易被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)吸收，使其生物利用度更低，一般只有10 左右。結(jié)合蛋白的影響 蛋白多肽類藥物會和體內(nèi)某些特異性蛋白結(jié)合。這些特異性的蛋白往往會在細(xì)胞水平上調(diào)節(jié)蛋白多肽類藥物的效能，并可影響這類藥物的藥動(dòng)學(xué)行為，特別是可影響其體內(nèi)清除和體液分析。這些結(jié)合蛋白可以作為一種儲存庫使藥物的體內(nèi)存留時(shí)間延長，也可作為清除機(jī)制加速這類藥物的清除。影響蛋白多肽類藥物藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的主要因素對給藥方案依賴性 給藥方案可影響蛋白類治療藥物的藥效動(dòng)力學(xué)，特別是蛋白激素類，這些激素生理情況下的分泌具有生理節(jié)律性，外源性蛋白治療劑不同給藥速率和方式可產(chǎn)生不同的作用。蛋

15、白的免疫原性 象所有的蛋白那樣，蛋白類治療藥物亦具有免疫原性，從而可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體?？贵w除可中和蛋白藥物的生物活性外，還可影響蛋白藥物的體內(nèi)分布、代謝和排泄。內(nèi)源性干擾 一個(gè)主要的影響因素是不少蛋白類治療藥物就是機(jī)體中存在的物質(zhì)，特別是蛋白激素，細(xì)胞因子等。這些內(nèi)源性成分對外源性蛋白的藥物動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生干擾，因而在闡明給予的外源性蛋白藥物的確切藥動(dòng)學(xué)時(shí)，內(nèi)源性物質(zhì)的影響必須予以控制。生物檢定法 多肽類藥物的生物活性不僅取決于藥物的一級結(jié)構(gòu)，而且與二、三級結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。生物檢定法用于研究該類藥物的藥動(dòng)學(xué)的獨(dú)特性及檢定標(biāo)記藥物的生物活性，主要有在體分析和離體分析兩大類。 在體分析法分析多肽類藥物在整

16、體動(dòng)物中引起的特異生物學(xué)反應(yīng)；離體分析法通常用細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)，以細(xì)胞增殖、分化或細(xì)胞毒性為基礎(chǔ)，以細(xì)胞數(shù)的增減為量效指標(biāo)。分析方法免疫學(xué)方法 多肽類藥物是一種抗原或配體（或受體），有相應(yīng)的抗體或受體（或配體），用免疫學(xué)方法及受體配體結(jié)合法可定量測定其免疫活性或結(jié)合活性。 免疫學(xué)方法測定的是多肽的免疫活性而不是生物活性，不能同時(shí)測定代謝物，具有抗原決定簇的代謝片段可能增加結(jié)果誤差，也易受內(nèi)源性物質(zhì)干擾。放射性同位素標(biāo)記法 放射性同位素標(biāo)記法是研究多肽類藥物的主要工具，分為外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法。蛋白質(zhì)中如含有酪氨酸或賴氨酸等適宜的氨基酸，可用外標(biāo)法（將標(biāo)記物如125I以化學(xué)方法偶聯(lián)至完整蛋白質(zhì)中），常用的有氯胺T法；外標(biāo)法不可行時(shí)可用內(nèi)標(biāo)法（將標(biāo)記3H，14C或35S等同位素的氨基酸加入生長細(xì)胞或合成體系中，獲得含同位素的多肽分子）。內(nèi)標(biāo)法因操作復(fù)雜而少用。同位素標(biāo)記示蹤法與其他分析手段的聯(lián)合檢測 同位素標(biāo)記示蹤法與其他手段聯(lián)合包括十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS）、三氯醋酸沉淀（TCA）、HPLC法。色譜分析 肽譜圖分析是控制多肽