MTT實(shí)驗(yàn)操作流程

1、MTT實(shí)驗(yàn)操作流程MTT實(shí)驗(yàn)操作流程MTT實(shí)驗(yàn)操作流程V:1.0精細(xì)整理，僅供參考 MTT實(shí)驗(yàn)操作流程日期：20 xx年X月MTT實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作流程原理活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在570nm波長處測定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測得的吸光度值（即OD值），來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)（如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越?。?。試劑及耗材CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、生物安全柜、倒置顯微鏡 、低速離心機(jī)、酶

2、標(biāo)儀、8道排槍、培養(yǎng)基 胎牛血清 、MTT、 DMSO、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、胰酶、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板注意事項(xiàng)MTT溶液的配制，通常MTT 配成的終濃度為5mg/ml,須用PBS或生理鹽水做溶劑。MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，m過濾后4避光保存兩周內(nèi)，或配制成5mg/ml保存在-20長期保存，避免反復(fù)凍融，小劑量分裝，用避光袋或錫箔紙包住避光以免分解，當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)不能再用。DMSO可以直接溶解，無需配制，使用方便，溶解速度快，但對人體毒性較大，且需去除原培養(yǎng)液，在去除培養(yǎng)液的過程中，可能會(huì)把結(jié)晶去掉，導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)步驟： 細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 %的胰酶消化對數(shù)期細(xì)胞，待細(xì)胞即將脫離皿底時(shí)，加少量血清

3、終止反應(yīng)，1000r/min，離心5min，吸去上清，將細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)基吹打混勻，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整其濃度至5-10104/ml。 取4塊96孔板，分別標(biāo)記為0h、24h、48h、72h，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 L細(xì)胞懸液，每板分別鋪8組細(xì)胞，分別為3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000個(gè)/孔，邊緣孔用無菌PBS填充以消除邊緣效應(yīng)。 5%CO2，37培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h取出一塊96孔板檢測： a) 每孔加入10 L MTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6h； b) 小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液； c) 每孔加入150L D

4、MSO，使結(jié)晶物充分溶解； d) 加DMSO后10min內(nèi)，用酶標(biāo)儀檢測各孔波長l570nm的吸光值； 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖標(biāo)準(zhǔn)曲線。選擇合適的細(xì)胞濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 MTT藥物毒性實(shí)驗(yàn)步驟 %的胰酶消化對數(shù)期細(xì)胞，加少量血清終止反應(yīng)，1000r/min，離心5min，吸去上清，將細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)基吹打混勻，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整其濃度至5-10104/ml，藥物毒性實(shí)驗(yàn)一般每孔細(xì)胞數(shù)量500010000個(gè)（具體數(shù)目根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)判斷）。此外，還應(yīng)根據(jù)細(xì)胞本身特性，如生長快慢，來決定細(xì)胞數(shù)量。比如：生長較快的細(xì)胞密度可略小。將細(xì)胞懸液制備好后，輕輕混勻，每孔加入

5、90l細(xì)胞懸液, 這樣待測細(xì)胞的密度為500010000/孔（邊緣孔用無菌PBS填充）。注意：因細(xì)胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降，因此接種的過程中要反復(fù)多次混勻，如每加5個(gè)孔就混勻一次，以確保接種的細(xì)胞密在各孔之間完全相同，這對于MTT的結(jié)果至關(guān)重要。 5%CO2，37培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物。（原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩h，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。加藥時(shí)按照所需的濃度在EP管中先稀釋好，每孔加入10l已經(jīng)稀釋好藥物，使每孔最終體積為100l，為了避免產(chǎn)生誤差，稀釋好的藥物體積應(yīng)略大于所需藥物的體積。需要注意的是，以DMS

6、O作為溶劑溶解的藥物至少需要進(jìn)行100倍以上稀釋才能使用，因?yàn)樽饔糜诩?xì)胞DMSO的含量高于1%時(shí)，DMSO會(huì)殺死細(xì)胞從而影響判斷。） 按照藥物作用時(shí)間點(diǎn)，每24 h取出一塊96孔板檢測：a) 每孔加入10 L MTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6h； b) 小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液； c) 每孔加入150L DMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解； d) 加DMSO后10min內(nèi)，用酶標(biāo)儀檢測各孔波長570nm的吸光值；同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。 MTT結(jié)果分析IC50值可以通過Graphpad prism5進(jìn)行計(jì)算 MTT增殖實(shí)驗(yàn) 分別收集各組對數(shù)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度； 取4塊96孔板，每孔加入100 L細(xì)胞懸液，鋪板使待測細(xì)胞為5103 cell/孔（邊緣孔用無菌PBS填充以消除邊緣效應(yīng)），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔； 5%CO2，37培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h取出一塊96孔板檢測： a) 每孔加入20 L MTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)