采用電位滴定法測定植物提取液中甲酸脫氫酶活性的實驗教學(xué)

1、采用電位滴定法測定植物提取液中甲酸脫氫酶活性的實驗教學(xué)摘要：綜合性、設(shè)計性實驗?zāi)芨玫丶ぐl(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和培養(yǎng)學(xué)生的科研思維。為促進(jìn)新疆大學(xué)“雙一流”專業(yè)教 學(xué)改革和實驗室建設(shè)，培養(yǎng)學(xué)生成為應(yīng)用型創(chuàng)新人才，該文設(shè)計了一個基于電位滴定測定植物葉片中甲酸脫氫酶活性的綜 合性實驗教學(xué)案例，并已成功應(yīng)用于化學(xué)專業(yè)本科生實驗教學(xué)中。實踐結(jié)果表明，該案例緊密銜接本科生基礎(chǔ)課實驗教學(xué)， 強調(diào)“問題引出” “解決思路”和“實踐驗證”的流程完整性及連貫性，不但設(shè)計性和能動性強，且兼顧綜合性與實用 性，能夠有效地啟發(fā)和培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新思維和實踐能力，適用于化學(xué)、環(huán)境、生物等相關(guān)專業(yè)的高年級本科生的實驗教學(xué)。關(guān) 鍵

2、詞：實驗教學(xué)；創(chuàng)新思維；植物；甲酸脫氫酶；電位滴定An Experimental Teaching Case of Determination of Activity of FormicAcid Dehydrogenase in Plant Extracts by Potentiometric TitrationAbstract: Comprehensive and designed experiments can better stimulate students interest in learning and cultivate their scientific research thi

3、nking. To promote the teaching reform and laboratory construction of Double First-Class major in Xinjiang University and train students to become application-oriented innovative talents, a comprehensive experimental teaching case was designed based on the determination of the activity of formate deh

4、ydrogenase in plant leaves by potentiometric titration, which has been successfully applied to the experimental teaching of undergraduate students in chemical specialty. The teaching practice showed that the case was closely connected with the experimental teaching of undergraduate basic course, emp

5、hasizing the process integrity and coherence of problem elicitation, solution thinking and practice-based verification. The design was not only creative and initiative, but also comprehensive and practical. It could effectively inspire and cultivate students innovative thinking and practical ability

6、, suitable for chemical, environmental, biological and other related professional senior undergraduate experimental teaching.Key words: experimental teaching; innovative thinking; plants; formate dehydrogenase; potentiometric titration培養(yǎng)具有創(chuàng)新精神和實踐能力的各類創(chuàng)新 型、應(yīng)用型、復(fù)合型優(yōu)秀人才是高校實現(xiàn)一流大 學(xué)和一流學(xué)科建設(shè)的根本任務(wù)，也是衡量一流大 學(xué)辦

7、學(xué)水平的重要指標(biāo)1-2o應(yīng)用型創(chuàng)新人才是指 面向生產(chǎn)、建設(shè)、管理等領(lǐng)域的需求，介于“學(xué) 術(shù)性、理論型”研究人才和“職業(yè)性、技能型” 崗位人才之間的一種“應(yīng)用型、技術(shù)性”創(chuàng)新人才, 是我國今后相當(dāng)一段時間內(nèi)大量急需的人才類 型3-4o創(chuàng)新型人才培養(yǎng)的突出特點是始于問題、 源于實踐，其重點是要強化實踐教學(xué)環(huán)節(jié)5-6o實 踐教學(xué)是理工科專業(yè)本科教學(xué)中極為重要的一個 環(huán)節(jié)，在培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新意識、創(chuàng)新精神和創(chuàng)新能 力方面具有不可替代的作用7-8o酸堿滴定是分析化學(xué)基礎(chǔ)實驗課程的一個 重要知識點，在化學(xué)的定量分析中占有舉足輕重 的地位9o電位滴定法是在滴定過程中通過測量電置，以提高滴定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，

8、如圖3 所示。圖1實驗設(shè)計思路圖2精密pH置，以提高滴定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，如圖3 所示。圖1實驗設(shè)計思路圖2精密pH計1一堿式滴定管，2精密pH計, 3離心管，4復(fù)合電極，5磁子，6燒杯，7磁力攪拌器，8一鐵架臺。!2pH計圖3自制簡易電位滴定裝置圖位變化以確定滴定終點的方法，是滴定原理的一 種應(yīng)用形式，適用于待測溶液有色或渾濁及不符 合目視法確定滴定終點的情況，靠電極電位的突 躍來指示滴定終點10-11o電位滴定具有操作簡 單、方便、費用低、準(zhǔn)確度高、應(yīng)用范圍廣泛、 便于普及與推廣的優(yōu)點，是值得高校本科生掌握 的一項實驗操作技能12o植物提取液常常具有一 定的色度，因而電位滴定法適于測定

9、其中的酸度 變化。1實驗設(shè)計思路及意義甲醛是一種常見的室內(nèi)空氣污染物，長時間 接觸會對人體產(chǎn)生強致癌致畸的危害13o近年來 室內(nèi)空氣中甲醛污染的高效凈化技術(shù)已成為相關(guān) 領(lǐng)域的熱點問題14o各類技術(shù)中，因綠色植物凈 化具有成本低、清潔安全、無二次污染等優(yōu)點， 而受到廣泛歡迎15o空氣中的甲醛通過葉面吸收作用進(jìn)入植物體 后，可通過氧化途徑轉(zhuǎn)化為甲酸，再分解為二氧 化碳和水，從而達(dá)到“解毒”效果16-17o植物正 常生長下產(chǎn)生的甲酸會被植物體內(nèi)的甲酸脫氫酶 自身分解，不會影響植物體生長，但受甲醛污染 等外界刺激時，甲酸脫氫酶不能快速分解產(chǎn)生的 過量甲酸，會造成植物體內(nèi)的甲酸累積，導(dǎo)致植 物“酸中毒”

10、，減弱甚至失去甲醛凈化能力，并 影響植物生理功能18-19o因此，甲酸脫氫酶活性是評估和預(yù)測植物甲 醛耐受性及篩選甲醛高效凈化植物的重要指標(biāo)之 一。本實驗以熱變性酶的方式制備酶失活植物提 取液（簡稱失活提取液），采用電位滴定法，通過 測定外加甲醛后植物新鮮提取液和失活提取液中 甲醛含量的減少值，及外加甲醛前后植物新鮮提 取液和失活提取液中酸度變化的差異，達(dá)到定量 評估植物中甲酸脫氫酶活性大小的實驗?zāi)康?，?驗設(shè)計思路如圖1所示。2實驗原理依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20932011，工業(yè)中甲酸 含量的測定采用酸堿滴定法。由于植物中甲酸 含量較低和植物提取液研磨后自身存在顏色， 采用目視滴定法手工振蕩

11、會因人為主觀因素引起 較大的滴定誤差，因此我們用常見的精密pH計 （如圖2所示）和磁力攪拌器組裝簡易電位滴定裝3主要藥品和儀器3.1主要儀器1）電動離心機：TDL-50,江蘇金壇儀器廠。2）恒溫水浴鍋：HH-WL,江蘇省金壇市醫(yī)療 儀器廠。3）精密pH計：PHS-3C，上海虹益儀器儀表 有限公司。4）電子天平：BSA224S，賽多利斯科學(xué)儀器 （北京）有限公司。5）紫外分光光度計：T6新世紀(jì)，北京普析通 用儀器有限責(zé)任公司。6）大盤面磁力攪拌器：IKA,萊貝（上海）科學(xué) 儀器有限公司。3.2主要試劑1）甲醛使用液：取0.70 mL甲醛（含甲醛37% 40%）定容到250 mL容量瓶中，用已知準(zhǔn)

12、確濃度 的硫代硫酸鈉溶液標(biāo)定其準(zhǔn)確濃度。取上述標(biāo)定 溶液 35.00，50.00，75.00 mL 定容至 100 mL 容量 瓶中待用。2）氫氧化鈉溶液：稱取0.50 g氫氧化鈉，溶 解于500 mL新蒸蒸餾水中，用鄰苯二甲酸氫鉀溶 液標(biāo)定后待用。4實驗步驟4.1實驗前分組設(shè)計實驗方案中共設(shè)計3個變量：植物種類（6種）、 植物質(zhì)量與提取劑體積的比例固-液比（g : mL） 設(shè)為1：5, 1 : 10，1 : 20和外加甲醛濃度（350, 500，750 mg/L）。將新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué) 16-1班的37名本科生自由組合的方式分成6個大 組，每個大組選擇同一種植物，共同采集樣品并 進(jìn)行前

13、處理；每個大組再根據(jù)植物與水提取液比 例的不同分成3個小組），每小組內(nèi)同學(xué)分工協(xié) 作，共同完成3方面的實驗內(nèi)容：1）兩種提取液 的制備；2）測試兩種提取液對外加甲醛的凈化能 力；3）外加不同濃度甲醛前后植物提取液中酸度 的變化。4.2植物樣品采集、預(yù)處理和提取液的制備實驗所需的植物樣品均由學(xué)生在校內(nèi)草坪、 荒地及校外公園空氣清新、土壤無污染歷史處采 集并記錄準(zhǔn)確位置，每個小組將植物樣本進(jìn)行分 類。每次所用植物樣品均需新鮮采集，經(jīng)短途保 鮮運送回實驗室，立即用預(yù)冷的自來水和蒸餾水 依次清洗表面，拭干后待用。準(zhǔn)確稱量預(yù)處理好的植物樣品置于瓷研缽 中，將瓷研缽置于冰盒上，在04龍預(yù)冷12 h的 無二

14、氧化碳蒸餾水為提取液，按前述預(yù)設(shè)比例分 34次加入提取液，每次均快速研磨以提取出新 鮮植物葉片中的有效成分，分離出的新鮮提取液 轉(zhuǎn)移至同一預(yù)冷的離心管中混勻，在04龍離心 10 min，分離上清液并均分成兩份，一份立即進(jìn)行 外加甲醛實驗，即為植物新鮮提取液；另一份密 封于試管中，放入100龍沸水中加熱10 min后冷 卻，即為植物酶失活提取液（簡稱為失活提取 液）。所制備的提取液均需密封后置于04龍冰箱 中短時間保存。4.3植物提取液的酸度變化在100 mL離心管中依次準(zhǔn)確加入20.00 mL 植物提取液、8.00 mL甲醛溶液，放入磁子將混合 液在磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢? min，記錄初始溶液

15、 的pH值。隨后用準(zhǔn)確標(biāo)定后的0.025 mol/L氫氧 化鈉溶液進(jìn)行電位滴定，觀察并記錄每次加入一 定體積氫氧化鈉溶液后，混合液反應(yīng)完全后的 pH值。當(dāng)混合液的pH值接近11左右停止滴定 （實驗均設(shè)3個平行）。兩種提取液需分別進(jìn)行不加甲醛的空白實 驗。具體步驟為：將前述的8.00 mL甲醛溶液改 為預(yù)冷的蒸餾水，其余操作與前述相同。4.4植物提取液對外加甲醛的凈化能力在12個具塞比色試管中分別加入0.50 mL離 心后的新鮮或失活植物提取液，分別加入0, 350, 500，750 mg/L的甲醛使用溶液100應(yīng)（每個濃度 設(shè)三個平行），再分別加入0.50 mL乙酰丙酮，蒸 餾水定容5.00

16、mL,搖勻，置于60水浴中加熱 15 min后，冷卻、過濾、稀釋后，在波長414 nm 處，以水為參比，測定濾出液的吸光度值，完成 外加甲醛凈化實驗。4.5數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析4.5.1數(shù)據(jù)計算與處理甲醛變化量：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和加入甲醛前后 兩種植物提取液吸光度的變化值，計算出凈化反 應(yīng)完成后兩種植物提取液中甲醛濃度減少值 （m鮮樣理論值，m失活理論值），按原理即實際提取液中 甲醛減少量=理論提取液中甲酸生成量。甲酸脫氫酶活性評價：根據(jù)消耗的氫氧化鈉 濃度和體積及所對應(yīng)的pH值，繪制出滴定曲線。 根據(jù)相同條件下兩種提取液達(dá)到滴定終點時消耗 氫氧化鈉的體積和凈化甲醛量，計算植物新鮮提 取液中甲酸脫氫

17、酶的活性大小。具體計算方法：1）對比植物空白實驗結(jié)果，根據(jù)滴定曲線中 突躍范圍對應(yīng)的氫氧化鈉濃度和體積計算出新 鮮提取液外加甲醛后混合液中甲酸含量的實際值 m鮮樣實際滴定值。2）與第一步相同的方法計算出失活提取液外 加甲醛后混合液中甲酸含量的實際值m失活實際滴定值。3）根據(jù)兩種提取液甲醛減少值計算出滴定中 甲酸含量的變化值（Am新鮮，Am失活）。4）新鮮提取液的Am新鮮與失活提取液的Am失活 間的差值，即為新鮮提取液中由甲酸脫氫酶作用 導(dǎo)致的甲酸降解量，進(jìn)而判斷出新鮮提取中甲酸 脫氫酶活性大小。Am新鮮=m鮮樣理論值-初鮮樣實際滴定值A(chǔ)m失活=m失活理論-初失活實際滴定值A(chǔ)m=Am鮮樣_Am失

18、活4.5.2結(jié)果分析以某組學(xué)生做的落地生根葉實驗數(shù)據(jù)為例 進(jìn)行數(shù)據(jù)計算與結(jié)果分析。當(dāng)外加甲醛濃度均 為500 mg/L，計算出植物質(zhì)量和提取劑的比例 不同時甲酸脫氫酶的貢獻(xiàn)（此），實驗數(shù)據(jù)如表1 所示。表1植物質(zhì)量和提取劑的比例不同時甲酸脫氫酶的貢獻(xiàn)固液比刀鮮樣理論刀失活理論隊鮮樣實際滴定值刀失活實際滴定值偵鮮樣偵失活A(yù)m1:5293.46148.181 495.91 657.080001:10157.8799.76161.11471.810001:20148.1875.54057.54148.1818.01130.181）落地生根質(zhì)量和提取劑1 ： 5時，提取液 的滴定曲線如圖4（a）和圖4

19、（b）所示，在兩種提 取液中加入甲醛后，滴定曲線均向右平移，首 先表明混合液中甲酸含量有所增加，即可證明 加入到植物新鮮提取液中的甲醛，在甲醛脫氫 酶的作用下將甲醛先轉(zhuǎn)化為甲酸，由于甲酸脫 氫酶活性較小，不能夠完全降解植物提取液中 的甲酸，進(jìn)而導(dǎo)致提取液中甲酸含量增多，其 甲酸含量的增加對甲酸脫氫酶活性產(chǎn)生了抑制 作用。2）落地生根質(zhì)量和提取劑1 ： 10時，提取 液的滴定曲線如圖4（c）和圖4（d）可以看出，植 物提取液加入水的曲線和加入甲醛的曲線接近 重合，原因可能是隨著植物提取液比例的增大 導(dǎo)致降解外加甲醛的活性物質(zhì)的含量降低，使 得空甲醛轉(zhuǎn)化為甲酸的含量減少，曲線接近于 重合。3）落地生根質(zhì)量和提取劑1 ： 20時，提取 液的滴定曲線如圖3（e）和圖3（f）可知，隨著植 物質(zhì)量和提取劑比例不斷地增大，新鮮提取液 中滴定曲線與空白曲線相比，顯著向左偏移， 表明加入甲醛后生成的甲酸被植物提取液中的 甲酸脫氫酶快速分解，由于甲酸脫氫酶活性較 大除了把外加甲醛生成甲酸降解外，也降解植 物提取液中的本身存在的甲酸。實驗結(jié)束后，由學(xué)生逐一計算出不同實驗 條件下植物提取液中甲酸脫氫酶活性，大組內(nèi) 討論甲醛加入量、植物質(zhì)量與提取液體積的比 例（固-液比）對甲酸脫氫酶活性的影響；再根據(jù) 6