基于電化學(xué)聚合固定抗體的電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)人免疫球蛋白

1、基于電化學(xué)聚合固定抗體的電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)人免疫球蛋白【摘要】基于電化學(xué)聚合在金電極外表固定兔抗人免疫球蛋白g抗體與人免疫球蛋白g及標(biāo)記有ru(bpy)2+3的羊抗人免疫球蛋白g抗體之間發(fā)生特異性免疫反響，形成三明治構(gòu)造，成功建立了用于測(cè)定人血清中免疫球蛋白g的電化學(xué)發(fā)光(el)免疫技術(shù)。利用此方法測(cè)定人免疫球蛋白g含量，濃度在50g/l2g/l范圍內(nèi)與電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y(a.u.)=48.41+0.09x(g/l)(n=7)；檢出限為20g/l(3)。測(cè)得正常人血清中免疫球蛋白g平均含量為11.2g/l，結(jié)果令人滿意?！娟P(guān)鍵詞】人免疫球蛋白g電化學(xué)發(fā)光免疫

2、檢測(cè)電化學(xué)聚合1引言免疫檢測(cè)法具有快速、靈敏、選擇性好等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、法醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)和環(huán)境科學(xué)等研究領(lǐng)域1。特別是近年來(lái)，隨著對(duì)免疫傳感器的深化研究，開(kāi)展了多種檢測(cè)技術(shù)，包括電化學(xué)、光學(xué)、壓電檢測(cè)、放射免疫分析法和電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法等1。其中，放射免疫分析法涉及環(huán)境污染問(wèn)題，酶免疫分析法受到酶保存和檢測(cè)靈敏度的限制；熒光免疫法有光的散射和雜光的干擾等問(wèn)題，限制了其在免疫方面的應(yīng)用。電化學(xué)發(fā)光是一種由于電化學(xué)反響引起化學(xué)發(fā)光的現(xiàn)象，具有操作簡(jiǎn)便、背景信號(hào)低、易于控制、特異性高等特點(diǎn)。ru(bpy)2+3化合物在電化學(xué)發(fā)光中是一種應(yīng)用最為廣泛的發(fā)光物質(zhì)，由于它具有靈敏度高，穩(wěn)定性好，發(fā)

3、光效率高等特點(diǎn)，所以被廣泛用于實(shí)際生物樣品的分析檢測(cè)1,1。免疫球蛋白(igg)是人體血清中含量最高的抗感染抗體，約占血清免疫蛋白的70%80%，其含量的上下往往作為慢性感染、慢性肝并免疫性疾病等疾病的參考值，所以對(duì)其含量檢測(cè)意義重大?，F(xiàn)有igg檢測(cè)方法有壓電免疫傳感器技術(shù)1、酶免疫法1和熒光免疫法1等。對(duì)于生物傳感器，生物分子固定的數(shù)量和活性是非常重要的，直接影響傳感器的性能。傳統(tǒng)的固定方法，如硅片上的硅烷化固定技術(shù)、金電極外表的巰基自組裝法以及戊二醛等化學(xué)試劑組裝法等，操作復(fù)雜，組裝時(shí)間長(zhǎng)，難以保持生物分子的活性。采用吡咯和生物分子共聚的方法，不但操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)少、易于控制，還能適用于微電

4、極及微量試劑的選擇性固定。這種方法常用于酶?jìng)鞲衅?、安培傳感器及電位傳感器，?yīng)用于電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器卻少有報(bào)道。本研究采用聚合吡咯和抗體的方法將抗體固定到金電極外表通過(guò)三明治免疫結(jié)合法實(shí)現(xiàn)對(duì)人igg的電化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)，結(jié)果令人滿意。2實(shí)驗(yàn)局部2.1儀器與試劑2.2實(shí)驗(yàn)方法電化學(xué)聚合吡咯固定抗體將金電極在金相砂紙上拋光后置于無(wú)水乙醇和蒸餾水中分別超聲清洗5in，于1.0+1.0v電位下在0.1l/lh2s4溶液中循環(huán)掃描20in，取出后用蒸餾水沖洗干凈，將新穎處理好的電極浸入含有0.1l/l吡咯、0.1g/l兔抗人igg、0.1l/lkl的0.1l/l磷酸鹽緩沖溶液(ph7.2)中，在800v

5、的電壓下聚合200s，取出用蒸餾水沖洗干凈。免疫組裝和電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)將1%bsa滴加到修飾有抗體的電極外表作用20in后，再滴加10l人igg溶液到電極外表組裝2h，最后將標(biāo)記有ru(bpy)3的羊抗人igg與電極組裝2h后，完成電極的免疫組裝。以鉑絲為對(duì)電極，ag/agl電極(3.0l/lkl)為參比電極，組裝好的電極為工作電極，自制的石英皿為檢測(cè)池，注入發(fā)光檢測(cè)液，在工作電極上施加從0.451.2v的循環(huán)電壓，檢測(cè)工作電極上的el信號(hào)。3結(jié)果與討論3.1電極修飾過(guò)程表征和ru(bpy)2+3標(biāo)記羊抗人抗體的電化學(xué)性質(zhì)為了保持抗體的生物活性，應(yīng)選擇在中性條件下聚合吡咯。對(duì)聚合過(guò)程進(jìn)展了阻抗表

6、征，由阻抗圖譜(圖1)可知，吡咯聚合后阻抗值增大，這是因?yàn)樵谥行詶l件下吡咯聚合后其電化學(xué)活性降低，與文獻(xiàn)19報(bào)道吡咯在ph5條件下聚合后電子傳導(dǎo)才能下降，導(dǎo)電性變差一致。而在共聚吡咯和抗體時(shí)由于抗體對(duì)電子傳遞的阻礙作用，使其阻抗值明顯大于單聚吡咯的阻抗值。隨著每一步組裝，阻抗值都明顯增大，分別為2974(人igg)和4980(ru(bpy)2+3標(biāo)記羊抗人igg)。圖1經(jīng)過(guò)不同修飾的金電極在0.01l/lk3fe(n)6/k4fe(n)6中的阻抗圖略fig.1eisfrthedifferentgldeletrdeseasuredin0.01l/lk3fe(n)6/k4fe(n)6頻率(freq

7、ueny):11105hz。如圖所示，ru(bpy)2+3標(biāo)記的羊抗人igg(b)在1.1v附近有明顯的氧化峰與ru(bpy)2+3(a)的電化學(xué)性質(zhì)一致20；在tpra存在條件下，在1.17v附近有明顯的發(fā)光信號(hào)(b)如圖3，與未標(biāo)記抗體的ru(bpy)2+3發(fā)光信號(hào)(a)相似，說(shuō)明ru(bpy)2+3標(biāo)記到羊抗人igg上后其電化學(xué)性質(zhì)和電化學(xué)發(fā)光性質(zhì)并沒(méi)有發(fā)生改變。而未標(biāo)記ru(bpy)2+3的抗體在0.451.2v沒(méi)有明顯發(fā)光信號(hào)。電壓ptential：0.451.2vvs.ag/agl；掃速sanrate：100v/s。電壓ptential：0.451.2vvs.ag/agl；掃速sa

8、nrate：100v/s。3.2實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化3.2.1電化學(xué)聚合時(shí)間對(duì)el的影響文獻(xiàn)21采用800v恒電位聚合吡咯(0.1l/l)，聚合時(shí)間直接影響到聚吡咯的厚度和抗體的固定量如圖4所示。隨著聚合時(shí)間的增加，el強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；200300s時(shí)el強(qiáng)度根本上處于平臺(tái)；但是當(dāng)聚合時(shí)間大于300s后，el強(qiáng)度開(kāi)場(chǎng)逐漸降低。根據(jù)文獻(xiàn)22，ru(bpy)2+3的發(fā)光機(jī)理如下：tpraetpra+tpra+tpra+h+tpra+ru(bpy)3ru(bpy)3+prdutru(bpy)3+tpra+ru(bpy)3*+prduttpra氧化產(chǎn)物tpra+與ru(bpy)3反響生成ru(bpy)3*,r

9、u(bpy)3*再由激發(fā)態(tài)返回基態(tài)ru(bpy)2+3時(shí)以光的形式放出能量。因此tpra的氧化對(duì)el強(qiáng)度有著重要的影響。圖4聚合時(shí)間對(duì)el強(qiáng)度的影響略fig.4effetsfplyerizatintienelintensity電壓(ptential)：0.451.2vvs.ag/agl；掃速(sanrate)：100v/s。所以隨著聚合時(shí)間的增加，聚吡咯層變厚，導(dǎo)電性變差，tpra在電極外表氧化難度增加，因此導(dǎo)致el強(qiáng)度下降。本實(shí)驗(yàn)選擇聚合時(shí)間為s。3.2.2免疫結(jié)合時(shí)間對(duì)el的影響由于羊抗人igg和人igg結(jié)合時(shí)間與兔抗人igg與人igg結(jié)合時(shí)間相近，實(shí)驗(yàn)中采用的兩組免疫結(jié)合時(shí)間一樣，考察了

10、結(jié)合時(shí)間從10in到4h中el值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：在室溫下當(dāng)免疫時(shí)間從10in到2h，el值逐漸增加；當(dāng)免疫時(shí)間大于2h，el值到達(dá)一個(gè)平臺(tái)根本保持不變，這說(shuō)明抗原抗體之間的特異性結(jié)合根本完成，因此實(shí)驗(yàn)選擇免疫結(jié)合時(shí)間為2h。圖5ph值對(duì)el強(qiáng)度的影響略fig.5effetsfphvaluefdetetingbufferslutinnelintensity電壓(ptential)：0.451.2vvs.ag/agl；掃速(sanrate)：100v/s。3.2.3發(fā)光檢測(cè)液的優(yōu)化根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，三丙胺的存在能極大地增強(qiáng)ru(bpy)2+3的el強(qiáng)度，l能抑制金電極外表自身氧化，增加el強(qiáng)度2。另外

11、發(fā)光檢測(cè)液的ph值對(duì)ru(bpy)2+3的el強(qiáng)度亦有很大的影響。由圖5可以看出，ph8.5時(shí)el強(qiáng)度隨著ph值增加而迅速增加；當(dāng)ph8.59.2時(shí)el強(qiáng)度到達(dá)一個(gè)平臺(tái)，ph9.2時(shí)el強(qiáng)度迅速下降。實(shí)驗(yàn)選擇檢測(cè)液的最正確條件為1.0103l/l三丙胺(tpra)5.0103l/llil42.0102l/l磷酸鹽緩沖溶液(ph8.7)。3.3igg的檢測(cè)3.3.1igg的線性范圍及檢出限在最正確檢測(cè)條件下，進(jìn)展了igg濃度檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。igg濃度在50g/l2g/l范圍內(nèi)與el強(qiáng)度呈良好線性關(guān)系，其回歸方程為y(el強(qiáng)度a.u.)=48.41+0.09x(igg濃度g/l)(n=7)，

12、相關(guān)系數(shù)為0.996，檢出限為20g/l(3)。與文獻(xiàn)13方法比擬，該方法具有更高的靈敏度，檢出限降低1個(gè)數(shù)量級(jí)。圖6不同濃度igg與el強(qiáng)度關(guān)系圖略fig.6rrelatinbeteeniggnertratinfr50g/lt10g/lvs.theelintensity.insert:thenentratinfiggasfr50g/lt2g/lvs.elintensity電壓ptential：0.451.2vvs.ag/agl；掃速sanrate：100v/s。實(shí)際血樣中igg的檢測(cè)取正常人血清，用pbs緩沖溶液稀釋，按照上述測(cè)試方法測(cè)定igg含量，同時(shí)參加標(biāo)樣作加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表

13、1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：實(shí)際血樣中人血清igg測(cè)量值分別為13.0、10.0和10.5g/l，加標(biāo)回收率分別為92、90和106，均在正常人血清人igg含量(814g/l)14范圍之內(nèi)?；厥章蕦?shí)驗(yàn)亦說(shuō)明本方法可行。表1人血清中igg濃度檢測(cè)結(jié)果略table1esultsfigginhuanseruusingtheelbisensr結(jié)論介紹了一種新型檢測(cè)人igg的免疫方法，用電化學(xué)聚吡咯固定生物分子免疫組裝后進(jìn)展el檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，固定效率高，易于控制。此檢測(cè)方法不但能用于人igg的檢測(cè)，還能應(yīng)用于其它抗原抗體的免疫檢測(cè)、dna檢測(cè)以及免疫藥物的篩眩此技術(shù)將有望用于多種抗原抗體的同時(shí)檢測(cè)和

14、免疫芯片的研制。【參考文獻(xiàn)】sithd.anal.he.,2002,74(17):462a466ahristdulidesn,tran,flrianpn,rdriguez,gdeya,ali,neikirkd,devittj.anal.he.,2002,74(13):30303036ksukes,hirshi,hisashiy,shinbus,atsuu,hirshia,yasu.j.agri.fdhe.,2022,55(23):934593505lisl,ihinseh,shindat,uedah.anal.he.,2022,79(16):619362006inj,baeuneraj.ana

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