基因突變和損傷DNA的修復

1、第3章 基因突變與損傷DNA的修復 第一頁，共七十頁?；蛲蛔兊念愋秃头柍Ｓ玫膸讉€突變株突變發(fā)生的機理 (自發(fā)突變，誘發(fā)突變)保證遺傳穩(wěn)定的機制(損傷DNA的修復)第二頁，共七十頁。第一節(jié)基因突變的類型和符號一、基因的符號nodA（nodule 結(jié)瘤基因） ; nifA（nitrogen fixation 固氮基因）;trpA,trpB （tryptophan色氨酸）; trpA23, trpA46 （同一基因的不同突變位點）;第三頁，共七十頁。leu-,strr ;(營養(yǎng)缺陷，抗性)lacZ- ; (表型符號為正體LacZ);(lac, pro);（缺失）trpA:Tn5 ;（插入）E.

2、coli JM109 ; E. coli DH5; （菌株）E. coli JM109 (lac,proAB) trpA:Tn5 第四頁，共七十頁。二、基因突變的類型按照突變體表型特征不同分類：、形態(tài)突變型，例如第五頁，共七十頁。 、營養(yǎng)缺陷型 Ade- 、抗性突變型 Strr 、致死突變型 5、條件致死突變型 6、產(chǎn)量突變型第六頁，共七十頁。按照突變所引起的遺傳信息的改變分類：、錯義突變同一位置上的氨基酸改變GAA(E) AAA(K) 、同義突變同一位置上的氨基酸不變GAA(E) GAG(E)、無義突變堿基突變后形成終止密碼子GAA(E) UAA(stop)第七頁，共七十頁。第八頁，共七十頁

3、。、堿基置換轉(zhuǎn)換Py Py Pu Pu 顛換Py Pu轉(zhuǎn)換比顛換更常見按照遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變分類：第九頁，共七十頁。、移碼突變（編碼區(qū)）ATC GAA TTC GGG TAT TTAATC GAA TTC GGG TAT TTAC G AATC CGA ATT CGG GTA TTT AATC CGG AAT TCG GGT ATT TAATC CGA GAA TTC GGG TAT TTA第十頁，共七十頁。、DNA片段插入和缺失DNA大片段的缺失或重復，在放線菌中缺失范圍從幾個基因到幾十個基因。第十一頁，共七十頁。第二節(jié)常用的幾個突變株營養(yǎng)缺陷突變株溫度敏感突變株抗性突變株第十二頁，共七十頁

4、。例：供體E . coli (Hfr Strs)受體E . coli (F- Thr- Leu- Thi- Strr)在含有鏈霉素和硫胺素的基本培養(yǎng)基只能分離到蘇氨酸和亮氨酸的重組子第十三頁，共七十頁。第三節(jié) 突變發(fā)生的機理 (自發(fā)突變，誘發(fā)突變) 第十四頁，共七十頁。、 自發(fā)突變 堿基異構(gòu)式引起DNA復制過程的錯誤 a) 堿基異構(gòu)式 C(氨基) C(亞氨基) A(氨基) A(亞氨基) G(酮式) G(烯醇式) G(酮式) G(烯醇式) T(酮式) T(烯醇式-2) or T(烯醇式-4) 1,65,6第十五頁，共七十頁。第十六頁，共七十頁。OH第十七頁，共七十頁。第十八頁，共七十頁。b) 堿

5、基異構(gòu)式引起DNA復制的錯配 第十九頁，共七十頁。A(a) T(k) G(k) C(a) 正確配對 錯誤配對 G(k) T(e) A(a) C(i) A(i) C(a) G(e) T(k) 第二十頁，共七十頁。A(a) T(k) C(i) A(a) C(i) C(a)G(k)例如：環(huán)出效應轉(zhuǎn)座子第二十一頁，共七十頁。環(huán)出效應第二十二頁，共七十頁。、 誘發(fā)突變 2-1 物理誘變 a) 電離輻射誘變； Co60 ()( ) ray Cs137() () ray H3 () ray P32, S35() ray 衛(wèi)星搭載誘變； 高真空，強輻射，微重力 ()( ) ray穿透性 （外照射處理） ()

6、() ray非穿透性 （內(nèi)標記處理） dNTP電荷及結(jié)構(gòu)改變 第二十三頁，共七十頁。電離輻射引起DNA損傷的機理第二十四頁，共七十頁。b) 非電離輻射Ultra Violet light (U.V)-pyrimidine dimer (TT dimer )is generated by covalent links between adjacent TT 第二十五頁，共七十頁。2-2生物技術(shù)定點誘變 第二十六頁，共七十頁。PCR原理 解鏈退火延伸第二十七頁，共七十頁?；虻亩c誘變 oligo-dNt 介導的定點誘變 合成與目標基因某區(qū)段互補并含突變 位點的oligo-dNt 第二十八頁，共七

7、十頁。 突變oligo-dNt引物介導的PCR誘變目標基因克隆到質(zhì)粒中分為兩管 每管加入2個特定引物一個與基因內(nèi)某一區(qū)段互補（2，4）一個含突變堿基并與欲突變位點互補（1，3） PCR產(chǎn)物混合變性、復性 轉(zhuǎn)化E.coli第二十九頁，共七十頁。Pfu DNApolymerase from Pyrococus furiosus(火球菌屬) 具有3 5exonuclease 活性，校正復制時堿基的錯配復制高保真，聚合長度 兩引物5 端連接其中引物1中含欲突變的堿基 Pfu-PCR直接誘變法第三十頁，共七十頁。引物2合成的新生鏈不會使引物1靶序列發(fā)生 替代 未被引物2擴增的DNA，含有未突變的酶切位點

8、，經(jīng)酶解后成線狀，轉(zhuǎn)化E.coli不能穩(wěn)定存在 改進型 引物的PCR誘變 目標基因克隆到M13載體提取單鏈DNA為模板 設計兩引物分別與模板不同區(qū)段互補 引物1與目標基因互補，含一突變堿基，并5端磷酸化 引物2含一酶切位點，并造成酶切位點突變 12第三十一頁，共七十頁。兩通用引物（common P1 & common P2） 設計兩突變引物（mut.P1 & mut.P2） 第一次兩種PCR產(chǎn)物混合，變性，復性 其中一對雙鏈分子不能進行第二次PCR 另一對雙鏈分子的PCR產(chǎn)物為誘變基因 引物重疊延伸的PCR誘變 cP1 mP1mP2 cP2第三十二頁，共七十頁。基于PCR的隨機誘變目標基因克隆

9、于含兩酶切位點（RE A,B）的質(zhì)粒載體RE A, B 酶切克隆子，exonuclease III酶解目標基因3 斷口的單鏈Klenow片段dNTP一種堿基類似物（誘變劑）在聚合DNA過程中隨機造成誘變第三十三頁，共七十頁。 DNA shuffling 技術(shù)的基因誘變Mutants. Digestionligation transformationselection第三十四頁，共七十頁。2-3 化學誘變a) 干擾堿基合成的化學誘變劑6-Mercalto purine5-Amino Uracil 5-氨基尿嘧啶(5-AU) 和6-氮嘌呤(6-NP) 第三十五頁，共七十頁。b) 堿基類似物導致的堿

10、基錯配(5-BrU)BrBr第三十六頁，共七十頁。5-BrU(k) 5-BrU(e)ReplicationBrU(k)BrU(e)ATGC復制錯誤A/T G/C摻入錯誤G/C A/T第三十七頁，共七十頁。A(a)T(k)5-BrU(k)G(k)5-BrU(e)C(a)mispairingmispairingT(k)A(a)5-BrU(k)G(k)C(e)5-BrU(e)A(a)G(k)G(k)A(a)復制錯誤摻入錯誤5-BrU(k)5-BrU(e)第三十八頁，共七十頁。5-BrU(k) 5-BrU(e)ReplicationBrU(k)BrU(e)GC復制錯誤A/T G/C摻入錯誤G/C A/

11、TIn DNABrU(k) BrU(e) (normal) (isoform)BrU(k) BrU(e)難易A G G AT C C T第三十九頁，共七十頁。HNO2 (Nitrous acid NA) A C GHypoxanghine CUracil AXanthine Cdeamination HNO2 堿基修飾引起的化學突變第四十頁，共七十頁。 羥胺的致突變作用NH2OH (Hydroxylamine HA 羥胺)C(羥化) A(a)OHNH 羥化胞嘧啶 GC AT第四十一頁，共七十頁。d) 烷化劑EMS (Ethyl methane sulfanate)CH3SO-CH2CH3OOM

12、MS CH3SO-CH3OOSM (Sulfur Mustards gas 硫芥子氣)HS CH2CH2ClCH2CH2Cl第四十二頁，共七十頁。甲基化第四十三頁，共七十頁。誘變效應； 使堿基多處發(fā)生烷化，導致DNA結(jié)構(gòu)變異敏感位點H2NOOOCTN3, C4-N N3, C4-OAGN1, N3, C6-N, N7, C8 N1, C2-N, N3, C6-O, N7, C8H2NONHH第四十四頁，共七十頁。 Apurination (de-pu)脫嘌呤作用CH3CH2GMPCH3CH2 - OC6-O-烷基嘌呤 = TC4-O-烷基胸腺嘧啶 = GG GCH2CH2S-CH2CH2H 烷

13、化堿基電離異構(gòu)式 錯配 多功能烷化劑DNA分子交聯(lián)畸變G XTO7-烷基鳥嘌呤第四十五頁，共七十頁。e) 嵌合劑和移碼突變AO (Acridine Orange) 扁平分子EB (Ethidium Bromide)-ATTTTTCG -TAAAAAGC-A TTTCG -T AAAGC-TAO T-AT EB TTTTCG-TA分子插入異相退火AOE B-ATTTCG -TAAAGC-ATXTTTTCG-TAX AAAAGC-AAAAA-AAAAATT TTT-TTTTT-AAAAA- TTTTT-AAAAA- TTTTT-RE-AAAAA-TT TT T-AAAAAA-TT TTT T-+重

14、組XAAAAGC-TA第四十六頁，共七十頁。第四節(jié) 保證遺傳穩(wěn)定的機制（損傷DNA的修復）第四十七頁，共七十頁。復制過程中的錯配修復DNA的損傷修復基因的回復突變密碼的簡并致死突變多倍體復制過程中的錯配修復機制 (= 10-11)DNA mismatch+ - A- -C-DNApol (= 10-8)經(jīng)第二次校正= 10-11MRSMismatch RepairSystem注：polI具有3-5的核酸外切酶活性（瞬時，廣義上的校對和修復功能）第四十八頁，共七十頁。1、DNA的復制修復 1-1 Mismatch repair systemDNA polymerase ligase MCE (m

15、ismatch correct enzyme) 3 subunits mutH, L, S dam genem6A甲基化酶Scanning 新生鏈中錯配堿基識別新生鏈中非 m6A 的GATC序列酶切含錯配堿基的新生DNA區(qū)段第四十九頁，共七十頁。MCE scanningDNA中的GATC(palindromic seq.) 為m6A甲基化敏感位點平均每2kb左右有一GATC seq.3 -C-CTAG-CTAG- 5 5-T-GATC-GATC- 3 3- 5少 梯度 多（m6A）新生鏈第五十頁，共七十頁。MCE scanningendonucleasePolymeraseligaseGATC

16、 GATCCTAG CTAGTCGATC GATCCTAG CTAGTGATC GATCCTAG CTAGTA第五十一頁，共七十頁。1- (尿嘧啶-)N-糖苷酶系統(tǒng)-TAGC-ATCG-TAGC-AT G-U-TAGC-ung-aseGTUAU-TAGC-AT G-Apurinase(內(nèi)切酶)-TAGC-ADNApolligaseTCG-第五十二頁，共七十頁。第五十三頁，共七十頁。光復活酶 471aa2、 DNA的損傷修復2-1 光復活-TT-AA-TT-AA-TT-AA-TT-AA-可見光激活第五十四頁，共七十頁。2-2切除修復Before Replication Error-freeUvr

17、A, B, C gene Endonucleases Exonuclease DNA pol Ligase切除修復步驟：識別DNA鏈中的損傷部位損傷部分被切離修復第五十五頁，共七十頁。第五十六頁，共七十頁。第五十七頁，共七十頁。動畫第五十八頁，共七十頁。E.coli 存活%U.V 計量w.t.uvrA+ recA+rec A+ uvr a-rec A- uvr A-rec A. gene 以某種方式參與DNA損傷修復2-3 重組修復第五十九頁，共七十頁。 重組修復 (strand transfer repair)After replication repair RecA, DNA polyme

18、raeligase genes be needed第六十頁，共七十頁。2-4 SOS 修復Jean WeagleE.coliE.coliE.coli 80 10 100mut. 100% 50% 10% E.coli中噬菌體損傷的DNA被修復 AU.V. 誘導了E. coli 的SOS修復(A & B)SOS 修復高頻率的突變 (Error-prone)ABC第六十一頁，共七十頁。DNA damaged300 XsignalRecA cleaves LexA SOSUmnC mutation-Before inducing. LexA-p Rec-A,UmuC11genesNeg. repre

19、ssion-U.V.damage DNASignal (S.S. DNA tail or 5Nt S.S.DNA)一般lexA基因產(chǎn)物是阻遏蛋白LexA蛋白抑制自身基因的表達LexA蛋白阻遏SOS基因的表達RecA高效表達LexA過表達,但多數(shù)被RecA降解SOS基因表達機制第六十二頁，共七十頁。第六十三頁，共七十頁。RecA-P; 三種功能 DNA 重組活性 與S.S. DNA結(jié)合活性 少數(shù)蛋白的proteinase活性當DNA正常復制時（無復制受阻，無DNA損傷， 無TT dimer） RecA-p不表現(xiàn)proteinase活性第六十四頁，共七十頁。當DNA復制受阻/ DNA damaged能量大量消耗細胞內(nèi)原少量表達的RecA-p與S.S, DNA結(jié)合激活RecA-p的proteinase活性修復損傷LexA-p降解RecA-p高效表達 300 times upSOS open第六十五頁，共七十頁。當DNA復制度過難關(guān)后SOS repair 是一種error-prone 極強的修復機制是進化中形成的“ 竭盡全力，治病救人” 的措施（正常狀態(tài)下，SOS是關(guān)閉的）RecA-p很快消失LexA gene onSOS off第六十六頁，共七十頁。3、 突變的形成DNA未經(jīng)修復經(jīng)過修復 / 校正 死亡突變率降低傾向差錯修復 (重組修復，SOS）避免差錯修復(光修復，切補修復)