大豆皂苷的分離純化課件

1、題目： 葡聚糖凝膠色譜結合制備型高效液相色譜分離純化大豆皂苷 大豆皂苷 皂苷又名皂甙或皂素，是固醇類或三萜類化合物的低聚配糖體總稱，因其水溶液能形成持久泡沫，象肥皂一樣而得名，它廣泛存在于植物和海洋動物體內。大豆皂苷是一種常見的皂苷，它主要存在于豆科植物中。豆類植物種子中大豆皂苷的含量一般在0.62%-6.16%之間。大豆皂苷是皂苷研究中起步較晚的一類, 大豆皂苷具有明顯的溶血作用, 對人體健康不利, 被視為抗營養(yǎng)因子, 同時它具有苦味, 導致大豆制品具有苦澀味, 因此在豆類食品加工中總被設法除去。近年來，國內外大量研究表明：大豆皂苷不僅毒副作用很小，而且其本上還具有許多對人體健康有益的生理功

2、能。大豆皂苷的化學組成 大豆皂苷( Soyasapon ins)屬于三萜類齊墩果酸型皂苷, 是三萜類同系物的羥基和糖分子環(huán)狀半縮醛羥基失水縮合而成, 它可以水解生成多種糖類和配糖體, 目前已確認的大豆皂苷約18種, 是由5種皂苷元( Soyasapogeno 、)和糖基中的D 一葡萄糖醛酸(glcUA)、D一葡萄糖(glc)、D一半乳糖(ga1)、 D一木糖(xy1)、一L一阿拉伯糖(am) 、一L一鼠李糖(rha)，6種單糖以及乙?；蠖乖碥?A cety1- soyasaponin ) 所組成。 大豆皂苷依據其皂苷元的結構可分為A族、B族、E族、DDMP族大豆皂苷。大豆皂苷的理化性質 物理

3、性質 純大豆皂苷為白色粉末, 具有辛辣味和微苦味, 對人體各部位的粘膜具有強烈的刺激性。大豆皂苷是兩親性化合物, 具有親水和親油兩種性質。大豆皂苷還可溶于水, 易溶于熱水、稀醇、熱甲醇和熱乙醇中, 而且在含水丁醇或戊醇中的溶解度較好, 但它不溶或難溶于乙醚、苯等極性小的有機溶劑。大豆皂苷具有熱穩(wěn)定性, 熔點很高, 一般在熔融前就分解, 無明顯的熔點。 化學性質 大豆皂苷顯酸性, 加入甲酸能改善分離度。大豆皂苷溶液加入硫酸銨、醋酸鉛等中性鹽類可產生沉淀。大豆皂苷與苯肼反應生成紅棕色沉淀, 與五氯化銻反應顯紫藍色, 在冰醋酸- 乙酰氯溶液中呈紅色, 于氯仿- 硫酸中呈現綠色熒光 。故可應用這些性質

4、, 來檢測食物中的大豆皂苷的含量。應用前景 大豆皂苷是一種具有潛在應用價值的天然生理活性物質, 具有抗癌、調節(jié)免疫功能、防治心血管疾病、抗菌、抗病毒、護肝等多重生理功效。除用作藥物外, 皂苷還可以作為高級化妝品和食品添加劑,如作為殺菌劑、抗氧化劑、發(fā)泡劑等在化妝品和食品工業(yè)中具有廣泛的應用, 以及作為表面活性劑應用于化學化工行業(yè)。 我國是大豆生產大國, 資源非常豐富。每年用于加工豆制品和榨油所消耗的大豆數量非常巨大, 但目前對大豆的利用僅限于提取油脂和蛋白質, 存在于葉子和副產品中的大豆皂苷常常被大量丟棄, 十分可惜。若能充分利用大豆廢料中像皂苷這樣的特殊成分, 必將獲得較大的經濟和社會效益。

5、 葡聚糖凝膠色譜法分離大豆皂苷和大豆異黃酮 大豆皂苷與大豆異黃酮存在結構與分子質量的差異，大豆皂苷為三萜類糖苷，大豆異黃酮中有一定量的異黃酮糖苷， 大豆皂苷分子質量在7661 436，大豆異黃酮分子質量在254532。 兩種總體化合物分子立體結構之間存在較大的差異，因此可以采用葡聚糖凝膠色譜分離技術對兩種總體化合物進行初步的分離。 大豆皂苷的分離純化 葡聚糖凝膠色譜也稱為分子排阻色譜， 凝膠柱系由均勻裝填的多孔凝膠微粒組成， 小分子可以進入孔隙之中，大分子不能進入孔內，只能隨流動相在凝膠顆粒間隙中流動，最先被淋洗出來，因此作為分子篩使用，分離大小不同的分子。 這一技術為蛋白質等生物大分子提供了

6、非常溫和的分離方法。本試驗中采用甲醇為洗脫溶劑，利用葡聚糖凝膠色譜法分離得到高純度的總大豆皂苷，為后續(xù)大豆皂苷單體制備提供很好的原料。1 葡聚糖凝膠色譜法分離大豆皂苷和異黃酮 利用葡聚糖凝膠色譜法分離大豆皂苷和大豆異黃酮，濕法填裝葡聚糖凝膠色譜柱（49mm310mm）。稱取400mg 大豆皂苷粗提物，溶解于1mL 甲醇。進樣體積150 L，采用甲醇為洗脫劑，設定洗脫流速3mL/min，選定監(jiān)測波長為215nm，根據制備圖譜接收了5 個組分峰。旋轉蒸發(fā)，回收甲醇，冷凍干燥得粉末樣品。 分離純化方法 圖1 為采用1.2.2 節(jié)方法分離大豆皂苷和大豆異黃酮215nm 處紫外吸收譜圖。由葡聚糖凝膠色譜

7、法的原理、各類皂苷和異黃酮的紫外吸收特征以及分子結構和分子質量的差異， 結合HPLC 圖1 為分離大豆皂苷和大豆異黃酮215nm 處紫外吸收譜圖。由葡聚糖凝膠色譜法的原理、各類皂苷和異黃酮的紫外吸收特征以及分子結構和分子質量的差異， 結合HPLC分析， 初步推斷峰1 為A 類大豆皂苷， 峰2 為DDMP 類及B 類大豆皂苷，峰3、峰4 和峰5 為異黃酮峰。2 高效液相色譜法制備大豆皂苷單體 制備型高效液相色譜技術以獲得大量的單成分為目的，具有分離條件比較溫和，分離檢測過程中一般沒有樣品被破壞，裝置簡單有效等優(yōu)點，在天然藥物的研究中發(fā)揮了重要作用。 利用制備型高效液相色譜儀，通過優(yōu)化流動相、梯度

8、洗脫程序、進樣量，以總大豆皂苷為原料，進行大豆皂苷單體制備。根據譜圖手動收集各個峰組分，旋轉蒸發(fā)，回收乙腈，冷凍干燥得粉末狀樣品，進行HPLC 純度檢測及UPLC-MS 分析。被稱為對維生素補充劑的“定案”。文章作者，來自美國約翰霍普金斯醫(yī)學院以及英國華威大學，還有一位是該雜志的高級副主編，“均為醫(yī)學界翹楚”。各種分離純化方法的比較 對身體而言，永不相負的萬靈藥并不是補劑，而是均衡膳食與規(guī)律運動。 HPLC 分析按照圖1 接收的5 個峰組分，并與大豆皂苷粗提物的HPLC 分析譜圖進行對比， 結果如圖2 所示。由HPLC 保留時間可以確定峰1 和峰2 是皂苷；峰3、峰4 和峰5 是異黃酮，不含任

9、何種類的皂苷，由此看出，凝膠色譜可以很好地將大豆異黃酮和大豆皂苷分離， 能得到較高純度的大豆皂苷粗分產物， 這將有利于大豆皂苷單體的制備。3 大豆皂苷單體純度分析和結構鑒定 采用最優(yōu)HPLC 制備條件進行大豆皂苷單體的分離純化，得到如圖3 所示的譜圖： 對身體而言，永不相負的萬靈藥并不是補劑，而是均衡膳食與規(guī)律運動。 HPLC 檢測皂苷單體純度 HPLC 分析結果表明，制備得到9 種純度90%以上的大豆皂苷，其中99%以上的大豆皂苷單體4 種。有些成分因含量極少， 由于滯后性或者后續(xù)處理， 其純度不高。盡管所有的提取及處理溫度都在40 以下，但是因DDMP 類皂苷的穩(wěn)定性差， 仍然有部分DDM

10、P 類皂苷降解為B 類皂苷。4 UPLC-MS 鑒定大豆皂苷單體 利用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯用檢測確定高效液相色譜制備得到的各個峰組分。 UPLC 條件： 分離柱Acquity C18 BEH（250mm10.0mm，0.17um）； 流動相為A：0.1%（體積分數）甲酸-水，B：0.1%（體積分數）甲酸-乙腈，流速0.3mL/min； 梯度洗脫程序 03min，1040%B；38min，4070%B； 812min，70100% B；1220min，100%B； 2020.5min，10010%B；20.522min，100%B。 質譜條件： 毛細管電壓3.2 kV， 取樣錐電

11、壓35V，二級錐孔電壓5V，離子源溫度110，脫溶溫度350 ，脫溶劑氣流量600.0 L/Hr，質核比掃描范圍1001 500。對身體而言，永不相負的萬靈藥并不是補劑，而是均衡膳食與規(guī)律運動。 根據制備出的單體的質量，選擇了1、4、6、8、9、10、11、12、13、14、15、17 號峰進行了UPLC-MS 結構鑒定。由于在制備時通過紫外吸收特征得出峰2 和峰7 為異黃酮峰；峰3 和峰5 出現的穩(wěn)定性差；而峰16 最終收集得到的質量很少，故而以上各峰未進行檢測。 根據制備出的單體的質量，選擇了1、4、6、8、9、10、11、12、13、14、15、17 號峰進行了UPLC-MS 結構鑒定。

12、由于在制備時通過紫外吸收特征得出峰2 和峰7 為異黃酮峰；峰3 和峰5 出現的穩(wěn)定性差；而峰16 最終收集得到的質量很少，故而以上各峰未進行檢測。 如圖4 所示， 其中395.6649 是大豆皂苷ac3-Ab（1394）分子結合一個氫原子形成的，975.5149是ac3-Ab 分子失去C-22 位末端的Ara （133）和Glc（162）及其上的3 個乙?；?，再結合一個氫原子形成的， 可以推斷1 號峰為大豆皂苷ac3-Ab。同理分析其余各峰的質譜圖，確定峰4、峰6、峰8及峰13 分別為大豆皂苷Aa、Ab、Ae、Be。9 號峰和10 號峰、11 和12 號峰質譜圖基本相同，分析后判斷分別為大豆皂

13、苷Af 和大豆皂苷Bb。參考文獻 1 KITAGAWA I. Revised structures of soyasapogenols A, B and E,oleanene- sapogenols from soybean J.Chem Pharm Bull, 1982, 30( 6) : 2294- 22972 胡學煙, 王興國.大豆皂甙的研究進展( 1) J. 中國油脂, 2001, 26( 4) : 29- 33.3 吳立軍.天然藥物化學M.北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1988.4 田晶, 翟濱, 徐龍權, 等.兩種大豆皂甙提取方法的比較J.大連輕工業(yè)學院學報, 2002, 21( 3) : 172- 174.5 魏靜, 張春紅.比色法測定大豆總皂甙的研究J.糧油加工, 2006( 10) : 60- 62.6 王艷宏, 李永吉.大孔吸附樹脂在皂苷研究中的應用J. 中醫(yī)藥學刊, 2004, 22( 2) : 373- 374.7 呂永, 何庭玉.油茶皂素提取純化及定量方法研究進展J. 湖南林業(yè)科技, 2004, 31(