中國藥科大學(xué)生物制藥工藝學(xué)實驗設(shè)計

1、 3/3中國藥科大學(xué)生物制藥工藝學(xué)實驗設(shè)計 重組門冬酰胺酶II的制備,純化和測定（中國藥科大學(xué)1044606李于采薇 1044631王沫力） 1目的基因的制備 1.1制備模板： 用接種環(huán)挑取 E.coli CPU210009菌體少許，在裂解液（1% TrioX-100，2mmol/LTris-HCl PH8.5，2mmol/L EDTA）1ml中振散，95加熱處理10min吸取5uL作為PCR反應(yīng)模板。 1.2 PCR反應(yīng)： 用一對與大腸桿菌門冬酰胺酶基因（）兩側(cè)序列互補(bǔ)的寡核苷酸，作引物，以大腸桿菌野生株的染色體為模板，建立PCR反應(yīng)體系，并進(jìn)行PCR反應(yīng)。 ：5- GGCCATGGAGTT

2、TTTCAAAAAGACGGCACTTGC - 32: 5- GGAAGCTTAGACTGATTGAAGATCTGCTGG 3模板13.5ul 引物I 0.5ul 引物II 0.5ul 10buffer 2.5ul 25mM Mgcl2 1.2ul 2.5nM dNTP 1.6ul Taq DNA聚合酶0.7ul PCR反應(yīng)條件：(循環(huán)28次) 94C 1min；60C 2min ；72C 1min 注意： 1.PCR產(chǎn)物通過核酸電泳進(jìn)行初步分子量的觀測。 2.然后送樣測序，與NCBI中基因序列對比后，得到準(zhǔn)確的目的基因片段。 2重組質(zhì)粒的構(gòu)建 2.1載體的制備 購得含pET28a的菌種，LB

3、培養(yǎng)基37C，200rpm過夜培養(yǎng)后，使用質(zhì)粒小提試劑盒提取pET28a,并通過核酸電泳檢測其分子量。 2.2酶切體系： PCR產(chǎn)物10ul pET28a 37ul 10Tango 3ul 10Tango 5ul NcoI 1.5ul NcoI 4ul HindI 1.5ul HindI 4ul ddH2O 18ul 注意：ddH2O用于補(bǔ)足反應(yīng)體系，加入量應(yīng)根據(jù)加入的模板DNA的量進(jìn)行調(diào)節(jié) 混勻后，瞬時離心，置于37C中酶切3h。酶切結(jié)束后，迅速將反應(yīng)產(chǎn)物在45C水浴中放置5min,再于冰上放置2min冷卻，可防止自連。對酶切后的PCR產(chǎn)物和pET28a再次進(jìn)行純化，并與第一次純化前的樣品，

4、以及酶切后未純化的樣品一起上核酸電泳檢測。 2.3連接 PCR產(chǎn)物14ul pET28a 3ul 10ligse buffer 2ul T4連接酶1ul 將上述混勻后，封口，放置過夜。 3.轉(zhuǎn)化 3.1感受態(tài)細(xì)胞的制備 取保種的E.coli CPU210009菌體至少500ul,接種于10ml LB液體培養(yǎng)基中,37下振蕩培養(yǎng)12小時至14小時,直至對數(shù)生長后期(相當(dāng)渾濁)取該菌液100ul接種于液體培養(yǎng)基中,37振蕩培養(yǎng)1.5小時至OD600=0.4左右，將菌液分裝于1.5ml EP管中,冰上放置15分鐘,后迅速于4下5000g離心10分鐘,棄去上清,用預(yù)冷的的0.1M CaCl2溶液400

5、ul輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置30分鐘后, 4下5000g 離心10分鐘,棄去上清，加入預(yù)冷的含0.1M 的CaCl2溶液80ul輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置5分鐘，即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。 3.2將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞 取1ml感受態(tài)細(xì)胞，冰上放置10到15分鐘，加入待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒（每200ul感受態(tài)細(xì)胞加入質(zhì)粒體積不超過10ul），輕輕放置45分鐘。隨后，在42水浴中熱擊90秒，熱擊后迅速置于冰上冷卻5分鐘。加入1mlLB液體培養(yǎng)基，混勻后37震蕩培養(yǎng)1小時后，5000轉(zhuǎn)10分鐘離心。將菌液棄去500ul上清，剩余500ul搖勻后，涂布于含氨芐西林的固體LB平板上，要不停涂抹直至菌液完全被吸干，后蓋上蓋

6、子，培養(yǎng)基面向上，37培養(yǎng)12-18小時。通過平板的抗性篩選，得到具有抗性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化的E.coli CPU210009單菌落。 3.3陽性重組子的篩選 將涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上長出的單菌落用牙簽逐個挑入方格化的新鮮LB培養(yǎng)基上，為每個克隆編號。平板37C溫箱中過夜，待菌落形成后用滅菌牙簽逐個挑選少量菌體，移入預(yù)先加有0.1mmol/L硼酸緩沖液（ph 8.4）50ul的酶標(biāo)板反應(yīng)孔里，待菌體分散后每孔加入0.04mmol/L天門冬酰胺底物溶液50ul，37C保溫15min，加入奈氏試劑50ul，呈深紅棕色孔內(nèi)相應(yīng)的單菌落即為陽性轉(zhuǎn)化子。 3.4發(fā)酵培養(yǎng)： 配制培養(yǎng)基： 牛肉膏5

7、g 蛋白胨10g NaCl 5g 瓊脂15-20g 水1000ml PH 7.41 高壓蒸汽滅菌20分鐘 篩選后呈陽性的重組工程菌于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h,溫度保持37。 菌種經(jīng)過斜面培養(yǎng)后，接種到液體培養(yǎng)基中，于37、250r/min下?lián)u瓶培養(yǎng)16h。 4.重組酶的分離純化： 41蔗糖溶液抽提 將菌體懸浮于破壁液( 45%蔗糖, 10 mmol/ L EDTA, 200 mg/ L 溶菌酶) 中, 在30攪拌70 min 后攪拌下傾入大量水中, 加入MnCl2沉淀菌體碎片和核酸, 離心, 取上清液即得酶提取液。 4.2硫酸銨分級沉淀和乙醇分級沉淀 酶提取液中加入硫酸銨至55% 飽和度, 離心

8、除去沉淀, 上清液中加入硫酸銨至90%飽和度, 離心收集沉淀, 沉淀物使溶解并透析脫鹽。脫鹽酶液中加入乙醇至33%( v/ v) , 離心除去沉淀的雜蛋白, 上清液部分加乙醇至40%( v/ v) , 得沉淀A。沉淀A 部分用50 mmol/L PBS( pH6. 4) 懸浮, 離心后于上清液中加乙醇至45%( v/ v) , 得沉淀B, 沉淀B 用5 mmol/L PBS( pH6.4) 溶解即得純度較高的酶。 4.3 DEAE-纖維素柱層析分離 DEAE-纖維素DE52柱4.530 cm, 經(jīng)5 mmol/L PBS( pH6.4) 平衡后上樣, 用相同緩沖液洗滌至基線平穩(wěn), 改用50 m

9、mol/L PBS( pH6.4) 洗脫, 收集顯示酶活性組分, 冷凍干燥后即得高純度的L-門冬酰胺酶凍干粉。 離子交換分離條件：在用DEAE-纖維素DE52層析時, 大部分雜質(zhì)不被交換吸附。只要用5 mmol/ L PBS 洗脫, 就可除去大部分雜質(zhì), 被吸附住的雜質(zhì)用50 mmol/ L PBS難以洗脫, 故可得到高純度的產(chǎn)品。 5.酶活力測定： （一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取6只試管按下表操作： （二）樣品的測定： 1.精確稱取樣品5mg（如效價高可減少）左右置乳缽中，加5ml （先加少量）PH8.4硼酸-硼酸鈉緩沖液研磨至完全溶解。再用上述緩沖液稀釋至大約4000倍。 2.取0.04mol/L的L-門冬酰胺1ml，0.1mol/L PH8.4硼酸-硼酸鈉緩沖液1ml，酶液0.2ml于試管中，于37水浴保溫10min，加15%三氯乙酸0.5ml終止反應(yīng)，經(jīng)4000r/min離