分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 教學(xué)安排

1、教學(xué)日歷實(shí)驗(yàn)周教學(xué)內(nèi)容1實(shí)驗(yàn)總論(實(shí)驗(yàn)規(guī)范訓(xùn)練、分子生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介和實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備等）2質(zhì)粒DNA的提取及其定性定量分析3PCR基因擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的回收4DNA重組（限制性酶切和連接）5DNA重組（連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化克隆菌株）6重組子的篩選7陽性重組子轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株、基因組DNA的分離8重組基因的原核表達(dá)、基因組DNA的分離9表達(dá)蛋白的檢測(cè)（活性測(cè)定）10Western（電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉）、 Southern(酶切）11Western（顯色）、Southern(轉(zhuǎn)膜、雜交、檢測(cè)）12植物總RNA的提取和RT-PCR（RT）13RT-PCR（PCR）、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)14設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)15設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)16設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)17設(shè)

2、計(jì)實(shí)驗(yàn)課外作業(yè)一、緒論分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的誕生和發(fā)展1.簡(jiǎn)要概括分子生物學(xué)的發(fā)展歷程。2.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展給生命科學(xué)帶來的影響如何？3. 近幾年新發(fā)展的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)有哪些？原理是什么？有何用途？4. 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)在各學(xué)科起著怎樣的作用？二、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本知識(shí)簡(jiǎn)介1.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常用的工具酶有哪些？它們的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、功能及用途是什么？2.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常用的載體有哪些？它們的特點(diǎn)是什么？每種載體在分子生物實(shí)驗(yàn)中的功能是什么？3.克隆載體和表達(dá)載體有何不同點(diǎn)？4.如何保證克隆基因的保真性？5.如何選擇合適的載體？6.都有哪些受體細(xì)胞？受體細(xì)胞的特點(diǎn)什么？7.載體和受體（宿主）細(xì)

3、胞之間的關(guān)系是什么？8.如何選擇合適的受體細(xì)胞？9.如何獲得和鑒定目的基因？10.外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法有哪些？各有什么優(yōu)缺點(diǎn)？11.如何篩選重組子？ 三、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備及其使用1.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常規(guī)儀器都有哪些？它們的適用范圍是什么？2.離心機(jī)在使用時(shí)應(yīng)該注意什么？3.除了常規(guī)儀器設(shè)備外，還有那些儀器設(shè)備可用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)？四、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化1.感受態(tài)細(xì)胞有何特點(diǎn)？如何保證它的質(zhì)量？2.為什么要設(shè)置陰性對(duì)照？3.如陰性對(duì)照中長(zhǎng)出菌，原因？4.在Amp培養(yǎng)板中，菌的密度過高或培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)會(huì)在陽性菌的周圍長(zhǎng)出一些小的衛(wèi)星菌落，它們是 Amps的，

4、原因？5.影響轉(zhuǎn)化效率的因素有哪些？6.還有哪些方法可以將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞？各有什么優(yōu)缺點(diǎn)？五、質(zhì)粒DNA的提取及其定性定量分析1.如何去除下列物質(zhì)（蛋白、基因組DNA、RNA、糖類、脂類、小分子物質(zhì)）？2.用什么方法能夠定量核酸？3.分離基因組DNA和質(zhì)粒DNA有哪些不同之處？4.如何提高核酸電泳的分辨率？5.EB染色的特點(diǎn)和注意事項(xiàng)是什么？6.核酸分離過程中酚、氯仿、異戊醇的作用是什么？7.在TE緩沖液中為什么要加入EDTA？8.純化的核酸時(shí)如有酚和蛋白質(zhì)的污染的話，對(duì)它的后期操作有何影響？9.有哪些因素影響核酸的沉淀？六、PCR基因擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的回收1.怎樣保證PCR擴(kuò)增的特異性和

5、產(chǎn)率？2.如何設(shè)計(jì)PCR引物？3.在PCR引物中引入酶切位點(diǎn)時(shí)應(yīng)注意什么？4.PCR擴(kuò)增體系中為什么要有鎂離子？5.如何優(yōu)化PCR擴(kuò)增體系？6.如何優(yōu)化PCR擴(kuò)增的條件？7.核酸回收時(shí)應(yīng)該注意什么？8.如何提高瓊脂糖凝膠電泳的分辨率？9.核酸的染色方法有哪些？各有什么優(yōu)缺點(diǎn)？使用時(shí)應(yīng)該注意什么？10.影響核酸的OD260、OD280的因素有哪些？ 七、DNA重組（限制性酶切和連接）1.什么是DNA重組？它包括哪些因素？ 2.如何提高DNA的重組效率？ 3.篩選重組子的方法有哪些？ 4.對(duì)核酸進(jìn)行限制性酶切時(shí)應(yīng)注意什么？ 5.轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)化重組DNA有什么不同？ 八、外源基因在大腸桿菌中的

6、誘導(dǎo)表達(dá)和檢測(cè)1.外原基因在原核生物中表達(dá)時(shí)，如何控制和優(yōu)化表達(dá)條件？2.外原基因的融合表達(dá)和非融合表達(dá)各有什么優(yōu)缺點(diǎn)？3.超聲波破碎菌體時(shí)需要注意些什么？九、哺乳動(dòng)物基因組DNA的分離及定性定量分析和Southern1.提取基因組DNA時(shí)應(yīng)注意些什么？2.分離基因組DNA和質(zhì)粒DNA有哪些不同之處？3.大分子基因組DNA的凝膠電泳應(yīng)注意什么？ 4. Southern雜交時(shí)，如何減少非特異性結(jié)合？5. 探針的標(biāo)記方法有哪些？6. 如何獲得探針？7. Southern雜交后的檢測(cè)方法有哪些？十、植物總RNA的提取及其定性定量分析1.在進(jìn)行RNA實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)該注意哪些方面？2.在純化RNA時(shí)，DEPC

7、的作用是什么？3.為什么最后要去掉殘留的DEPC？4.如何分離提取脂類和糖類含量高的組織的總RNA？5.如何分離提取RNA酶含量或活性含量高的組織的總RNA？6.如何分離提取mRNA？7.還有其它簡(jiǎn)單的方法提取RNA嗎？ 十一、蛋白質(zhì)印跡1.Western時(shí)應(yīng)注意什么？2.如何提高SDSPAGE的分辨率？3.Western的檢測(cè)方法有哪些？它們各有什么優(yōu)缺點(diǎn)？4.如何提高Western檢測(cè)的靈敏度？5.Western和其它分子雜交有什么異同點(diǎn)？ 授課方式教學(xué)分小班（20-27人左右）進(jìn)行，課程分為三個(gè)階段：第一個(gè)階段在理論上讓學(xué)生全面地認(rèn)識(shí)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本技術(shù)原理，在實(shí)踐上讓學(xué)生熟悉分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的基本要求及儀器設(shè)備的操作要領(lǐng)，學(xué)生參與實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備工作。以教師講解、學(xué)生進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室做實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作為主。第二階段是學(xué)習(xí)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本技術(shù)，以能熟練地應(yīng)用基本理論和掌握實(shí)驗(yàn)技能為主要目的。采用的方式是實(shí)驗(yàn)前學(xué)生預(yù)習(xí)、實(shí)驗(yàn)教師講解理論并圍繞技術(shù)操作等問題進(jìn)行一定的討論，實(shí)驗(yàn)中教師隨時(shí)輔導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)后實(shí)驗(yàn)教師組織總結(jié)討論。第三階段安排在學(xué)期的最后，要求學(xué)生用學(xué)到的知識(shí)和技能，利用本實(shí)驗(yàn)室