蛋白質(zhì)制備資料

1、第二章蛋白質(zhì)制備(zhbi)蛋白質(zhì)別離純化(chn hu)的一般程序蛋白質(zhì)的粗別離(fnl)蛋白質(zhì)的層析別離蛋白質(zhì)的電泳別離蛋白質(zhì)的結(jié)晶內(nèi) 容 提 要第五講第一頁，共三十二頁。自由(zyu)界面電泳區(qū)帶電泳(din yn)Tiselius微量電泳(din yn)顯微電泳等電聚焦蔗糖密度梯度等速電泳按支持物紙上電泳醋酸纖維薄膜電泳薄層電泳非凝膠電泳和凝膠電泳二、電泳的類型第二頁，共三十二頁。使用(shyng)形式水平式垂直(chuzh)式板形柱形雙向電泳連續(xù)(linx)流動電泳使用目的分析型制備型操作原理一般電泳等速電泳等電聚焦免疫電泳自由電泳擴(kuò)散嚴(yán)重，分辨率差，操作煩瑣。區(qū)帶電泳分辨率高，設(shè)備

2、簡單，操作方便。第三頁，共三十二頁。水平式電泳(din yn)板狀電泳(din yn)第四頁，共三十二頁。三、聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGPAG是根據(jù)物質(zhì)所帶電荷及其分子大小、形狀的差異，在電場作用下產(chǎn)生不同泳動速度(sd)而別離的技術(shù)，它有靜電效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，分辨率很高。一盤狀電泳(din yn)PAG電泳(din yn)連續(xù)式電泳不連續(xù)式電泳盤狀電泳凝膠與電極槽液的pH和離子濃度相同使用的膠濃度、pH、電壓都是不連續(xù)的盤狀電泳的特點：不連續(xù)性PAG加兩性電解質(zhì)加SDS等電聚焦電泳SDS-PAG電泳第五頁，共三十二頁。2.pH不連續(xù)(linx)濃縮(nn su)膠pH為6.7，別離膠pH8.9

3、，電極緩沖液的pH8.3。3.系統(tǒng)(xtng)緩沖不連續(xù)4.電壓梯度不連續(xù)制備凝膠用Tris-HCl緩沖液，電極緩沖液為Tris-Gly。由于Cl-和Gly-離子的泳動速度不同，造成電壓梯度不連續(xù)。+NH3CH2COO-NH2CH2COO-+H+1.膠濃度不連續(xù)兩種凝膠濃縮膠別離膠濃度一般為3%，其孔徑大，高度23cm濃度一般為7.530%，其孔徑小，高度56cm第六頁，共三十二頁。濃縮(nn su)膠別離(fnl)膠樣品(yngpn)+-A.電泳前B.電泳開始蛋白質(zhì)在濃縮膠C.慢離子移動到別離膠中兩種凝膠系統(tǒng)和各種離子在電泳過程中的運動示意圖溴酚藍(lán)氯離子蛋白質(zhì)甘氨酸第七頁，共三十二頁。盤狀電

4、泳(din yn)的優(yōu)點：蛋白質(zhì)以一個很窄的區(qū)帶進(jìn)入別離膠，別離得到(d do)的區(qū)帶也很窄，因此分辨率高。二SDS-PAG電泳(din yn)SDS-PAG電泳是專門用來測定分子量的技術(shù)。SDS-十二烷基磺酸鈉是陰離子去污劑，它能與蛋白質(zhì)的疏水局部相結(jié)合，并把大多數(shù)蛋白質(zhì)拆成組成它們的亞基形式。+-使用SDS對樣品變性上樣，通電染色，觀察條帶大小降低遷移方向蛋白質(zhì)的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳局部別離的蛋白質(zhì)SDS包裝的蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠第八頁，共三十二頁。SDSseparates proteins by MWSDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定(cdng)蛋白質(zhì)分子量 SDS學(xué)名為十二烷基磺酸鈉第

5、九頁，共三十二頁。盤狀電泳(din yn)的缺點：SDS與蛋白質(zhì)分子結(jié)合后，發(fā)生(fshng)構(gòu)象變化，解離成亞單位，失去原有活性。三凝膠等電聚焦(jjio)IEF和常規(guī)電泳比較， SDS-PAG電泳的操作特點：緩沖液樣品或稱電聚焦，是一種高分辨率的蛋白質(zhì)別離技術(shù)，也可用于蛋白質(zhì)等電點的測定。等電聚焦的關(guān)鍵問題是用載體兩性電解質(zhì)形成pH梯度、穩(wěn)定集中別離了的蛋白質(zhì)區(qū)帶，別離蛋白質(zhì)的鑒定和pH的測量。在磷酸緩沖液中參加0.2%的SDS和0.2%的巰基乙醇電泳前蛋白質(zhì)要溶解在1% SDS和1%巰基乙醇的磷酸緩沖液中，100加熱25分鐘。第十頁，共三十二頁。等電聚焦電泳：兩性電解質(zhì)載體(zit)由多

6、烯多胺與丙烯酸加成后得到，在電場作用下能形成連續(xù)的梯度。第十一頁，共三十二頁。1.載體(zit)兩性電解質(zhì)使用脂肪族多氨基(nj)多羧基物質(zhì)作介質(zhì)，在電場中可獲得理想的平滑pH梯度。2.抗對流(duli)介質(zhì)常用的是聚丙烯酰胺凝膠PAG。3.電泳條件pH范圍越窄，分辨力越高。聚焦效果與電壓有關(guān)，電壓高，分辨力也高。pH范圍電流（mA）電壓（v）聚焦時間（小時）開始開始終止終止3.59.5 80 25 400 1000 1.52.56.0 100 30 600 900 2.05.08.5 80 25 800 1500 1.52.07.510.5 50 15 500 1000 2.5在不同pH范圍

7、內(nèi)凝膠薄層等電聚焦所用的電流、電壓和聚焦時間作用維持連續(xù)線性pH梯度的穩(wěn)定性；穩(wěn)定別離了的蛋白質(zhì)區(qū)帶。第十二頁，共三十二頁。4.pH和pI的測定(cdng)可用染色法觀察蛋白質(zhì)，用外表(biomin)電極直接測pH值。等電聚焦(jjio)的優(yōu)缺點：分辨率高；靈敏度高。時間短，操作簡便，還可測出等電點。適合少量樣品的分析鑒定。不適于制備別離。因要求用無鹽溶液，蛋白質(zhì)會沉淀。在等電點附近沉淀和變性的蛋白質(zhì)不能用此法。第十三頁，共三十二頁。四雙向電泳二維凝膠電泳雙向凝膠電泳技術(shù)(jsh)被廣泛用于鑒定新蛋白質(zhì)。等電聚焦(jjio)凝膠pH410pH4pH10大小(dxio)降低遷移方向蛋白質(zhì)條帶SD

8、S-聚丙烯酰胺凝膠蛋白質(zhì)的雙向電泳第十四頁，共三十二頁。五用PAG電泳別離的大分子的檢測(jin c)檢出方法(fngf)：1.考馬斯亮藍(lán)染色法此染料靈敏度比氨基(nj)黑高，最低檢出極限為0.31g。2.銀染色法是利用銀離子與蛋白質(zhì)以鹽或配價絡(luò)鹽的形式結(jié)合，后由甲醛將銀離子復(fù)原成可見的銀顆粒。3.熒光染色技術(shù)熒光胺與伯胺專一結(jié)合后得到熒光加成產(chǎn)物，可用于PAG上蛋白質(zhì)的檢測且靈敏快速。第十五頁，共三十二頁。4.酶活性染色法是利用(lyng)酶的專一催化反響進(jìn)行染色。分兩種：酶的底物或產(chǎn)物有熒光，反響(fnyng)后可檢測熒光的消失和出現(xiàn)。酶催化反響直接或間接地與化學(xué)反響耦聯(lián)，而這個化學(xué)反響能

9、產(chǎn)生顏色很深的不溶性產(chǎn)物(chnw)，故能指示該酶在凝膠上的位置。5.專一性配體結(jié)合檢測法具有熒光或放射性的配體與凝膠上的蛋白質(zhì)專一結(jié)合后，可用熒光檢測法或放射自顯影法檢測結(jié)合的配體。6.用熒光標(biāo)記的抗體檢測用熒光標(biāo)記待檢蛋白質(zhì)的抗體，標(biāo)記抗體進(jìn)入凝膠后那么與待檢蛋白質(zhì)結(jié)合，洗去未結(jié)合的抗體后，經(jīng)紫外光照射，即可檢出熒光的位置。7.凝膠上蛋白質(zhì)的定量檢出放射化學(xué)和電泳相結(jié)合，可以定量測定。用微量光密度計也可對凝膠進(jìn)行掃描定量測定。第十六頁，共三十二頁。四、凝膠免疫電泳凝膠免疫電泳：將利用瓊脂作支持介質(zhì)(jizh)的區(qū)帶電泳別離和專一性免疫沉淀反響相結(jié)合的免疫化學(xué)方法。一免疫電泳原理(yunl)

10、R-+免疫電泳原理(yunl)示意圖此法的特點是把電泳和免疫擴(kuò)散結(jié)合起來，具有很高的靈敏度和分辨率，樣品需要量少，操作簡便。免疫血清第十七頁，共三十二頁。二火箭(hujin)免疫電泳免疫擴(kuò)散與免疫電泳相結(jié)合，測定(cdng)混合蛋白質(zhì)中某一蛋白質(zhì)的量。-+-電 泳前電 泳后火箭(hujin)免疫電泳示意圖此法可測量微量抗原物質(zhì)，也可測量微量抗體物質(zhì)。第十八頁，共三十二頁。三交叉(jioch)免疫電泳雙向免疫電泳是常規(guī)凝膠電泳和火箭(hujin)免疫電泳的結(jié)合，是一種定量蛋白質(zhì)的有效方法。-+-ABC交叉(jioch)免疫電泳步驟示意圖此法的精確性，取決于沉淀峰的形狀、清晰的度、沉淀峰重疊的數(shù)目

11、以及界限是否明確。第十九頁，共三十二頁。五、高效(o xio)毛細(xì)管電泳能用于別離多種生物(shngw)分子，也可用于手性化合物的別離。一毛細(xì)管電泳(din yn)特點高壓電源檢測器記錄儀毛細(xì)管毛細(xì)管入口毛細(xì)管入口緩沖液-+負(fù)極正極毛細(xì)管電泳儀圖解第二十頁，共三十二頁。高效(o xio)毛細(xì)管電泳特點：別離效率高、分析速度快、應(yīng)用(yngyng)范圍廣、樣品用量少。二影響(yngxing)毛細(xì)管電泳的因素遷移時間和峰面積是重要指標(biāo)。三毛細(xì)管電泳的操作形式1.毛細(xì)管區(qū)帶電泳CZE是毛細(xì)管電泳中最根本的一種操作形式。所有組分都向負(fù)極移動，移動速度為：正離子中性粒子負(fù)離子2.毛細(xì)管電動力學(xué)層析MEC

12、C在MECC中粒子的運動主要靠電滲作用。第二十一頁，共三十二頁。3.毛細(xì)管等電聚焦(jjio)CIEFCIEF是把等電聚焦過程(guchng)移到毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行。4.毛細(xì)管凝膠電泳CGE按填充(tinchng)介質(zhì)填充聚丙烯酰胺凝膠無膠篩分CGE優(yōu)點：抗對流、無滲流、高效高別離能力，重復(fù)性和穩(wěn)定性好。六、印漬轉(zhuǎn)移法Western blotting是將凝膠電泳后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到特殊的膜上，然后用親和反響或免疫反響或結(jié)合反響測定蛋白質(zhì)的技術(shù)。是鑒定蛋白質(zhì)純度的方法之一。轉(zhuǎn)移方法電泳法非電泳法多采用電泳法填充聚丙烯酰胺和5%交聯(lián)劑采用涂漬的毛細(xì)管柱，降低電滲作用第二十二頁，共三十二頁。第五節(jié) 蛋白質(zhì)的結(jié)

13、晶(jijng)一、根本原理決定(judng)因素?zé)崃W(xué)平衡(pnghng)因素動力學(xué)因素溶解度控制晶核過程和晶核生長在適宜的過飽和狀態(tài)下，溶質(zhì)分子通過擴(kuò)散、旋轉(zhuǎn)、碰撞等運動形式，形成晶核。然后溶質(zhì)分子以相互對撞的方式有序而反復(fù)地堆砌到晶核上，晶體形成，從溶液中析出。第二十三頁，共三十二頁。二、結(jié)晶(jijng)條件一蛋白質(zhì)純度(chnd)樣品純度(chnd)越高，結(jié)晶越容易。樣品純度(chnd)通常不低于50%。二蛋白質(zhì)濃度結(jié)晶母液濃度越高，結(jié)晶時機(jī)越大。一般濃度在1050mg/mL。(三溫度通常選擇4冷室或25 溫箱進(jìn)行結(jié)晶。(四結(jié)晶時間從幾個小時到幾個月不等。五pH值結(jié)晶溶液的pH值一般

14、選擇在被結(jié)晶蛋白質(zhì)的等電點附近。六金屬離子和離子強(qiáng)度金屬離子能引起或有助于蛋白質(zhì)結(jié)晶過程。第二十四頁，共三十二頁。七晶核晶核數(shù)越少，越容易生成(shn chn)大晶體。八沉淀劑較理想(lxing)的蛋白質(zhì)沉淀劑是聚乙二醇和2-甲基-2，4-戊二醇。三、結(jié)晶(jijng)方法結(jié)晶方法鹽析法有機(jī)溶劑法等電點結(jié)晶脫鹽結(jié)晶溫差結(jié)晶金屬離子第二十五頁，共三十二頁。第六節(jié) 提純(tchn)過程中的定量選擇(xunz)分析方法的標(biāo)準(zhǔn)方法的特異性要強(qiáng)方法的靈敏度要高方法的準(zhǔn)確度要高方法的使用方便快速一、雙縮脲法二、福林-酚試劑(shj)法三、紫外吸收法四、考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法用于需要快速，但不需要十分

15、精確的測定。較靈敏，適合測定2040g/mL的蛋白質(zhì)溶液雖精確度不高，但操作簡便，樣品可回收?？焖?、靈敏度高，重復(fù)性好。第二十六頁，共三十二頁。第七節(jié) 蛋白質(zhì)的純度(chnd)標(biāo)準(zhǔn)一、電泳(din yn)法常用(chn yn)于蛋白質(zhì)純度鑒定。二、層析性質(zhì)的考查如果制劑是純的，那么各分級局部的比活力應(yīng)當(dāng)恒定。如果所有局部的比活力都相同，認(rèn)為該樣品是均一的。三、免疫化學(xué)法靈敏度高，應(yīng)用廣泛。四、蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)分析法一個純蛋白質(zhì)，所有氨基酸都成整數(shù)比。純度鑒定方法色譜純電泳純結(jié)晶純第二十七頁，共三十二頁。五、超速離心沉降(chnjing)分析法此法優(yōu)點是時間(shjin)短、用量少。缺點是靈敏度較

16、差。第二十八頁，共三十二頁。總結(jié)蛋白質(zhì)別離純化的一般(ybn)程序前處理(chl)粗分級別離細(xì)分級別離蛋白質(zhì)的層析分離離子交換(l z jio hun)層析(IEX)柱層析技術(shù)凝膠過濾層析疏水相互作用層析HIC親和層析免疫親和層析共價層析固定化金屬離子親和層析染料配體親和層析吸附層析聚焦層析高效液相層析HPLC第二十九頁，共三十二頁。聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAG盤狀電泳(din yn)SDS-PAG電泳(din yn)交叉(jioch)免疫電泳凝膠免疫電泳雙向電泳高效毛細(xì)管電泳印漬轉(zhuǎn)移法火箭免疫電泳凝膠等電聚焦蛋白質(zhì)結(jié)晶蛋白質(zhì)純度測定毛細(xì)管區(qū)帶電泳CZE毛細(xì)管電動力學(xué)層析MECC毛細(xì)管等電聚焦CIEF毛細(xì)管凝膠電泳CGE蛋白質(zhì)的電泳別離第三十頁，共三十二頁。課 外 作 業(yè)1.蛋白質(zhì)純化(chn hu)方法有幾種類型？2.層析方法有幾種(j zhn)？各種層析方法的根本原理是什么？3.A、B、C3種蛋白質(zhì)的等電點分別為9.0、8.0、4.0，將這3種蛋白質(zhì)混合(hnh)在一起，上到CM-Sepharose Fast Flow 陽離子交換柱上，采用0.05mol/L檸檬酸緩沖液pH5.0平衡吸附，請問：在此條件下，哪種蛋白質(zhì)不被吸附，被吸附的蛋白質(zhì)哪種先被鹽溶