生物技術的免疫原性和免疫毒性課件

1、生物技術藥物的免疫毒性和免疫原性研究Kaiyong LIU 華南農(nóng)業(yè)大學生物技術藥物生物技術藥物 包括體內(nèi)診斷、治療與預防用途； 來源于細菌、酵母、昆蟲、植物和哺乳動物細胞 蛋白質、多肽及其衍生物、核酸 如細胞因子、生長因子、融合蛋白、酶、激素、單抗、載體等特殊性 結構、生產(chǎn)工藝、保存條件、同源性、作用靶點明確等固有的特點免疫毒性/免疫原性免疫毒性 是指受試品引起免疫抑制或增強、過敏反應或自身免疫反應，可能與藥理活性相關（如抗排斥藥物）或不相關（如部分抗腫瘤藥物）。免疫原性 指藥物刺激機體形成特異性抗體或致敏淋巴細胞的性質。 研究意義意義重大：如 免疫抑制，感染，腫瘤 免疫增強，放大自身免疫反

2、應或過敏反應。 免疫原性，是藥物本身具有的性質，有免疫原性不一定導致毒性，但可以影響對藥物毒性、毒代或藥效的客觀評價。 但在規(guī)范及指導原則方面，缺乏共識，實驗方法也不統(tǒng)一免疫毒性研究內(nèi)容一常規(guī)的免疫毒性指標包括： 白細胞總數(shù)及其分類計數(shù) 球蛋白和白/球比值 補體水平 淋巴器官/組織的大體解剖 胸腺和脾臟的器官重量 免疫病理：胸腺、脾臟、引流淋巴組織常規(guī)的免疫毒性檢測結果 引流淋巴組織檢查圖猴經(jīng)口免疫HIV-BPV 假病毒后回腸粘膜下集合淋巴小結：對照組，：高劑量組常規(guī)的免疫毒性檢測 免疫抑制/增強全血細胞變化、白細胞變化或淋巴細胞變化等。免疫器官重量改變或組織學檢查顯示相關器官或組織細胞密度變

3、化血清免疫球蛋白變化用藥組感染發(fā)生率升高用藥組腫瘤發(fā)生率增多(除遺傳毒性、激素效應或肝酶誘導外)額外的免疫毒性試驗方案增設衛(wèi)星組、增加免疫學指標或改變給藥方案等。發(fā)育免疫毒性：在成年動物中發(fā)現(xiàn)免疫抑制作用后，需要評價發(fā)育免疫毒性作用，如觀察母代暴露于藥物后仔代的淋巴系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、細胞因子等，兩種以上功能檢測等。不僅是免疫抑制！常規(guī)階梯或分層或標準試驗組合不一定合理，需個體化額外的免疫毒性試驗方法 免疫功能檢測 Macrophage/Neutrophil熒光標記的膠珠觀察phagocytosis等 NK反映天然免疫功能TDARSRBC or 鑰孔血藍蛋白 (KLH），用ELISA等CTL51C

4、r釋放法，ELISPOT法CytokinesELISA法及胞內(nèi)細胞因子檢測額外的免疫毒性試驗方法免疫功能檢測hypersensitivity目前預測IV型變態(tài)反應 Buehler試驗、豚鼠最大化試驗（GPMT）、小鼠耳腫脹試驗、小鼠局部淋巴結試驗(LLNA)autoimmunity PLNA（報告抗原TNP-Ficoll、TNP-Ovalbumin） host resistance 抗感染或抗腫瘤發(fā)生（整體，必要時）注：GPMT與人一致性約70%，LLNA約72% 免疫功能檢測 分泌IFN細胞圖猴經(jīng)口免疫HIV-BPV 假病毒后外周血p24特異性的分泌IFN的淋巴細胞數(shù)量 免疫細胞表型檢測 C

5、D22陽性比例圖 食蟹猴靜脈注射SM03嵌合抗體后CD22標記陽性細胞率的變化 CD22陽性細胞比例（%）免疫毒性試驗結果分析統(tǒng)計學意義與生物學意義（尤其單一指標）變化程度與劑量/暴露關系與擬用臨床劑量的關系療程關系涉及動物種屬數(shù)量和受影響的終點可能繼發(fā)于其他因素 (e.g., stress,）可能的細胞靶點和（或）作用機制引起這些變化的劑量與產(chǎn)生其他毒性的劑量關系可逆性免疫毒性靶器官的分析線索靶分子在免疫器官或組織的分布受試品或其代謝產(chǎn)物的分布相關指標的變化 常規(guī)免疫指標、細胞因子變化等。免疫毒性機制推測受體或藥靶直接引起的毒性反應（on-target) 如干擾素引起骨髓抑制受體或藥靶介導的

6、間接毒性反應 如rhIL-12能誘導干擾素的分泌非特異機制 如rhTNK-tPA引起肝細胞劑量依賴性的脂肪變性。免疫原性研究內(nèi)容免疫原性(immunogenicity) 指誘導宿主產(chǎn)生免疫應答的能力，具有這種能力的物質稱為免疫原(immunogen）。產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細胞能力。影響因素 分子大小，10 000，5 00010 000，1000 5000 分子結構，蛋白質多糖核酸類脂 宿主因素、免疫方式免疫原性研究意義免疫原性影響重復給藥毒性試驗結果的分析：中和藥物活性、改變藥物的清除、半衰期和組織分布 （neutralize drug activity and alter drug c

7、learance, plasma half-life, and tissue distribution）建立免疫分析方法，供臨床試驗應用免疫原性研究內(nèi)容抗體檢測方法學驗證免疫反應檢測 抗體滴度、抗體的出現(xiàn)時間、出現(xiàn)抗體的動物數(shù)、劑量關系、抗體滴度的動態(tài)變化、抗體的中和活性、?？贵w與藥代/藥效和安全關系的評價 同期的藥效/藥代（毒代）/毒性反應的變化、補體激活與否、免疫復合物在肝腎的沉積、是否需要終止給藥、臨床意義分析等抗體檢測方法間接法 包被單抗或生物素，再加藥物。放射免疫沉淀法（RIP） 液相法，中等或高通量水平表面等離子體共振 液相法，不需結合物（酶標記抗體），能檢測到不同親和力的抗體和各

8、亞型抗體電化學發(fā)光法 液相法，可檢測各種抗體亞型抗體檢測方法考察方法學考察靈敏度：500-1000ng/ml，低滴度抗體檢出受試物干擾：如有文獻報道，如血清中受試物濃度大于0.15g/ml，則難以檢測到抗受試物抗體。一般從1：10開始稀釋或對樣品進行處理。長效?精確度：利用陽性對照品重復測量 陰性對照血清一般需從15只動物或50人中抽取抗體檢測結果描述抗體滴度結果表示 數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，取對數(shù)后達正態(tài)分布，需用幾何均數(shù)表示抗體檢測結果 抗體的出現(xiàn)時間、出現(xiàn)抗體的動物數(shù)、劑量關系、抗體滴度的動態(tài)變化抗體中和活性檢測常用依賴細胞株抗病毒致細胞病變（CPE）克隆細胞株靶基因檢測等。游離或與抗體結合的

9、受試品對中和活檢測的干擾（偶聯(lián)抗體的瓊脂糖凝膠珠吸附）抗體中和活性的檢測 CPE法圖 猴經(jīng)口免疫HIV-BPV 假病毒后血清對 HIV-1 HN 024的中和活性抗體中和活性檢測方法 靶基因表達抗體產(chǎn)生對藥效相關指標的影響圖 注射表達EPO基因裸質粒8周后貧血大鼠HCT、EPO水平及中和活性的檢測抗體產(chǎn)生對藥代的影響臨床上連續(xù)應用重組水蛭素5以上可使74%的患者產(chǎn)生抗水蛭素抗體（AHAb）?？贵w產(chǎn)生對藥代的影響0481317210.010.1110TPO ( ng / mL）-)時間 (天 )圖 猴皮下連續(xù)注射rhTPO 2 g.kg-1.d-120 d后血清rhTPO濃度(實測值和抗體滴度(

10、, 血清稀釋倍數(shù)的倒數(shù)）抗體產(chǎn)生對毒性反應的影響圖 食蟹猴sc 2周和4周PEG-IFN后白細胞計數(shù)、抗體滴度和血清中和活性 *中和抗體產(chǎn)生對給藥方案的意義中和抗體影響了大多數(shù)動物的藥理和（或）毒性反應，則可以考慮終止給藥。中和抗體水平，在體外能中和安全劑量達到的血藥濃度的作用時，可以考慮終止給藥。需結合藥動學資料?？?結生物技術藥物免疫毒性評價 重視，個體化原則，采用新方法生物技術藥物免疫原性評價 強調(diào)規(guī)范，分析與毒性反應等關系CD28激動劑TGN1412的期臨床試驗事件德國公司研制的抗CD28超級激動劑TGN1412（人源化單抗）用于治療白血病等，在1期臨床試驗中，單次靜脈注射12-16h

11、，6例均出現(xiàn)嚴重不良反應（多器官衰竭）。CD28激動劑TGN1412的期臨床試驗事件研究發(fā)現(xiàn)注射受試品后很快導致前炎癥因子釋放（細胞因子風暴），心肺功能衰竭。猴長毒：CD4+ 和CD8+ T細胞一過性升高,血清IL-2、IL-5、IL-6中度升高，但沒有出現(xiàn)細胞因子釋放綜合征。CD28激動劑TGN1412的期臨床試驗事件的教訓期臨床試驗方案的教訓：僅10min間隔免疫毒性的種屬差異及免疫毒性評價和分析的重要性（Toxicol in Vitr）。猴并非一定是相關動物，動物記憶T細胞少。主要參考文獻EMEA. Guideline on Comparability of Medicinal Prod

12、ucts Containing Biotechnology-derived Proteins as Active Substance: Nonclinical and Clinical IssuesICH. preclinical safety evaluation ofbiotechnology-derived pharmaceuticalss6ICH. immunotoxicity studies for human pharmaceuticals s8FDA.Immunotoxicology Evaluation of Investigational New Drugs呂秋軍等. 生物技術藥物臨床前安全性評價研究