微生物培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)基本操作技術(shù)

1、微生物培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)基本操作技術(shù)一、培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基是指人工配制的、適合于微生物生長(zhǎng)繁殖或累積代謝產(chǎn)物所需的各種營(yíng)養(yǎng)物的混合基質(zhì)。配制培養(yǎng)基是進(jìn)行微生物檢驗(yàn)工作的基礎(chǔ),甚至是任何與微生物有關(guān)工作的基礎(chǔ)。注意事項(xiàng) 滅菌鍋的使用加水蓋過底部鐵板放入東西關(guān)門調(diào)整溫度時(shí)間關(guān)緊泄壓閥滅菌結(jié)束後，等壓力降回零時(shí)才可打開門進(jìn)入滅菌鍋 之物品，蓋子不可關(guān)太緊或太鬆拿滅菌後物品請(qǐng)記得帶耐熱手套培養(yǎng)基中的主要成分及其作用：營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)： N源、C源、無機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子、水常用的N源：蛋白胨、牛肉膏、肉浸汁、酵母膏常用的C源：糖、醇類物質(zhì)（單糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖雙糖：蔗糖、麥芽糖、乳糖；多糖：淀粉、纖維素、菊糖；

2、醇類：甘露醇、衛(wèi)茅醇、甘油）水：用蒸餾水，不能用自來水 凝固劑：瓊脂、明膠、血清等抑制劑：1、作用：鑒定細(xì)菌、抑制雜菌的生長(zhǎng)繁殖，增加待檢菌的檢出率2、種類：鹽類：氯化鈉、氯化鋰、氰化鉀、亞碲酸鉀（鈉）、亞硒酸鈉等染色劑類：煌綠、薔薇酸、結(jié)晶紫、孔雀綠、孟加拉紅、玫瑰紅膽鹽類：豬（牛、羊）膽鹽、混合膽鹽、三號(hào)膽鹽、去氧膽酸鹽、膽石酸鹽抗菌素：青霉素、鏈霉素、桿菌肽、多粘菌素 指示劑1、作用：用于指示鑒別細(xì)菌可否利用分解糖醇類物質(zhì)和含氮化合物，產(chǎn)酸產(chǎn)堿的能力。2、常用的指示劑：酚紅、溴甲酚紫、中性紅、中國(guó)藍(lán)、甲基紅、復(fù)紅、伊紅、美藍(lán)、孔雀綠等。培養(yǎng)基的類型：根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來區(qū)分：1、液體培

3、養(yǎng)基 ：主要用于增菌培養(yǎng)、鑒別性培養(yǎng)2、固體培養(yǎng)基：用作微生物的分離、鑒定、檢驗(yàn)雜菌、計(jì)數(shù)、保藏、生物測(cè)定3、半固體培養(yǎng)基：觀察微生物的動(dòng)力，有時(shí)用來保藏菌種4、脫水(商品)培蕎基：脫水培養(yǎng)基也稱為商品培養(yǎng)基、預(yù)制干燥培養(yǎng)基。將各種營(yíng)養(yǎng)成分按比例配制完全,制成脫水的干粉狀,裝瓶出售;使用時(shí)只需按比例加人定量的水溶化、滅菌便可。根據(jù)培養(yǎng)基的用途來區(qū)分：增殖培養(yǎng)基 選擇培養(yǎng)基 鑒別培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)基： 在普通培養(yǎng)基中加入一些某種微生物特別喜歡的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以增加這種微生物的繁殖速度，逐漸淘汰其它微生物，這種培養(yǎng)基稱為增殖培養(yǎng)基。 能夠給微生物提供較適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)環(huán)境從而使微生物大量繁殖的培養(yǎng)基稱為增菌培養(yǎng)

4、基。增菌、運(yùn)送用培養(yǎng)基2、選擇培養(yǎng)基 ：在培養(yǎng)基中加入抑制劑以殺死或抑制不需要的菌種,分離對(duì)象因?qū)υ撘种苿┯锌剐远ＩL(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)基,稱之為選擇培養(yǎng)基。分離培養(yǎng)用的培養(yǎng)基3、鑒別培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入指示劑或化學(xué)藥品,目的菌經(jīng)培養(yǎng)后其代謝產(chǎn)物與化學(xué)試劑發(fā)生顯色反應(yīng),因而用肉眼可快速鑒別出目的菌,這樣的培養(yǎng)基稱之為鑒別培養(yǎng)基。例如:伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基(EMB)就是一種常用的鑒別性培養(yǎng)基。伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基用于食品、乳制品、水源和病源標(biāo)本中革蘭氏陰性腸道菌的分離和鑒別鑒別用培養(yǎng)基4、活體培養(yǎng)基：病毒、立克次氏體等專性寄生微生物不能在一般培養(yǎng)基上生長(zhǎng),常用雞胚、活細(xì)胞和動(dòng)物進(jìn)行培養(yǎng)。采用雞胚培養(yǎng)時(shí),將微生

5、物接到絨毛尿囊膜、尿囊、羊膜囊和卵黃囊中進(jìn)行培養(yǎng),即可得培養(yǎng)物。 細(xì)胞培養(yǎng)指將病毒接種到體外培養(yǎng)的活細(xì)胞上使其增殖。（三）培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項(xiàng) 培養(yǎng)基的制備記錄 培養(yǎng)基成分的稱取 培養(yǎng)基各成份的混合和溶化 培養(yǎng)基pH的初步調(diào)正 培養(yǎng)基的過濾澄清 培養(yǎng)基的分裝培養(yǎng)基的滅菌 培養(yǎng)基的質(zhì)量測(cè)試 培養(yǎng)基的保存 1、培養(yǎng)基的制備記錄每次制備培養(yǎng)基均應(yīng)有記錄，包括培養(yǎng)基名稱，配方及其來源，和各種成份的牌號(hào)，最終pH值、消毒的溫度和時(shí)間制備的日期和制備者等。記錄應(yīng)復(fù)制一份，原記錄保存?zhèn)洳?，?fù)制記錄隨制好的培養(yǎng)基一同存放、以防發(fā)生混亂。2、培養(yǎng)基成分的稱取培養(yǎng)基的各種成分必須精確稱取并要注意防止錯(cuò)亂

6、，最好一次完成，不要中斷。可將配方置于傍側(cè)，每稱完一種成分即在配方上面做出記號(hào)，并將所需稱取的藥品一次取齊，置于左側(cè)，每種稱取完畢后，即移放于右側(cè)。完全稱取完畢后，還應(yīng)進(jìn)行一次檢查。3、培養(yǎng)基各成份的混合和溶化指示劑應(yīng)在調(diào)節(jié)好pH值后再加入； 煮溶后要補(bǔ)加足水份；不能把培養(yǎng)基煮焦，焦化的不能使用。4、培養(yǎng)基pH的校正滅菌后pH值會(huì)下降0.10.2，在做培養(yǎng)基校正pH值時(shí)，應(yīng)比實(shí)際值高0.10.2；pH調(diào)整后，還應(yīng)將培養(yǎng)基煮沸。5、培養(yǎng)基的過濾澄清液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾法 瓊脂培養(yǎng)基,可用中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布過濾、培養(yǎng)基的分裝斜面： 1/管 半固體培養(yǎng)基：1/3管高層斜面：1/41/3管

7、 平板：1315ml7、培養(yǎng)基的滅菌（1）含糖類或明膠的培養(yǎng)基： 113滅菌15分鐘或115滅菌10分鐘。（2）無糖培養(yǎng)基： 121滅菌1520分鐘。（3）血液、體液和抗生素等以無菌操作技術(shù)抽取后再加入冷卻至約50左右的培養(yǎng)基中。（4）瓊脂斜面培養(yǎng)基應(yīng)在滅菌后冷至55-60時(shí)取出，再擺置成適當(dāng)斜面。8、培養(yǎng)基的質(zhì)量測(cè)試（）如發(fā)現(xiàn)破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養(yǎng)基沾染等、均應(yīng)挑出棄去。并測(cè)定其最終pH。（）將全部培養(yǎng)基放入361C恒溫箱培養(yǎng)過夜，如發(fā)現(xiàn)有菌生長(zhǎng)，即棄去。（）用有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)菌株接種12管或瓶培養(yǎng)基，培養(yǎng)2448小時(shí)，如無菌生長(zhǎng)或生長(zhǎng)不好。應(yīng)追查原因并重復(fù)接種一次，如結(jié)果仍同前，則

8、該批培養(yǎng)基即應(yīng)棄去，不能使用。9、培養(yǎng)基的保存 （1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基不能超過兩周（2）生化試驗(yàn)培養(yǎng)基不宜超過一周，（3）選擇性或鑒別性培養(yǎng)最好當(dāng)天使用，傾注的平板培養(yǎng)基不宜超過3天。二、無菌技術(shù)指在微生物實(shí)驗(yàn)工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施。 消毒滅菌技術(shù)是微生物檢驗(yàn)最基本的試驗(yàn)技術(shù)之滅菌：應(yīng)用物理或化學(xué)的方法殺死或除去物品上或環(huán)境中的所有微生物稱為滅菌。經(jīng)過滅菌以后的物品,應(yīng)該不存在具有生命力的微生物營(yíng)養(yǎng)體及其芽孢、孢子,即處于無菌狀態(tài),否則就是滅菌不徹底。消毒應(yīng)用物理或化學(xué)的方法殺死物體上或環(huán)境中絕大部分微生物(特別是病原微生物)。物品消毒處理后,雖仍有少數(shù)

9、微生物未被殺死,但已不致引起有害作用,故消毒實(shí)際上是不徹底的滅菌。具有消毒作用的物質(zhì)稱為消毒劑。消毒劑的殺菌作用是有限的,并不是所有的消毒劑都能將各種病原微生物殺死。無菌：指沒有具有生命力的微生物存在的意思。只有通過徹底滅菌,才能達(dá)到無菌要求。因此,滅菌是指對(duì)物品的作用,而無菌則是描述物品的狀態(tài)。滅菌是無菌的先決條件,無菌是滅菌后的結(jié)果滅菌方法：物理方法：加熱法、過濾除菌法 化學(xué)方法：化學(xué)消毒劑（一）無菌環(huán)境：無菌室 無菌柜 超凈工作臺(tái)1、無菌室：（1）無菌室的結(jié)構(gòu)：更衣間、緩沖間、操作間（2）無菌室的消毒和防污染每日（使用前）紫外線照射（12小時(shí)）.每周用甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時(shí)）.

10、每月用新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒。2、超凈工作臺(tái)超凈臺(tái)的使用與保養(yǎng):（1）風(fēng)速保持在0.32-0.48米/秒;（2）使用前開啟紫外燈照射30分鐘以上;（3）讓超凈臺(tái)預(yù)工作1015分鐘;（4）使用完畢后，用70%酒精將臺(tái)面和臺(tái)內(nèi)四周擦拭干凈.（二）無菌器材滅菌器材：玻璃器皿、培養(yǎng)基、無菌衣等. 消毒器材：無菌室內(nèi)的凳子、試管架、天平、工作臺(tái)、手等（三）無菌操作1、目的：（1）是保證待檢物品不被環(huán)境中微生物的污染； （2）是防止被檢微生物在操作中污染環(huán)境或感染操作人員。2、進(jìn)入無菌室前的準(zhǔn)備（1）定期檢查無菌環(huán)境的空氣是否符合規(guī)定；（2）用紫外線滅菌處理3060分鐘；（3）檢查無菌器

11、材是否備齊；（4）洗手消毒；（5）手部消毒后，再穿戴無菌工作服。3、檢驗(yàn)操作過程的無菌操作要求（1）在操作中不應(yīng)有大幅度或快速的動(dòng)作；（2）使用玻璃器皿應(yīng)輕取輕放。（3）在正火焰上方操作；（4）接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌；（5）在接種培養(yǎng)物時(shí)，協(xié)作應(yīng)輕、準(zhǔn)。（6）不能用嘴直接吸吹吸管。（7）帶有菌液的吸管、玻片等器材應(yīng)及時(shí)置于盛有5%來蘇爾溶液的消毒桶內(nèi)消毒。 斜面接種時(shí)的無菌操作 (1)接種環(huán)滅菌(2)開啟棉塞(3)管口滅菌(4)挑起菌苔(5)接種(6)塞好棉塞無菌操作 斜面接種取菌技巧1. 接種環(huán)前端鎳絲部分以酒精燈燒紅滅菌，後端鐵棒部分過火2. 試管前端過火 3. 打開試管蓋 4

12、. 試管傾斜，放入接種環(huán)5. 試管前端過火，蓋上試管蓋 6. 接種環(huán)燒紅滅菌無菌操作 平板接種取菌技巧自 Plate 上取單一菌落 (方法一：蓋子微開遮住培養(yǎng)基，避免空氣中菌體掉入) 方法二：plate 反面拿起)無菌操作 吸球取菌技巧：1. 擠出安全吸球內(nèi)空氣，插上滅過菌之玻璃吸管2. 向上為吸，向下為放無菌操作 移液器取菌技巧 1. 調(diào)整 Pipetman 刻度 (P1000 吸取範(fàn)圍 200 1000l)2. 插上滅過菌之 Tip (用力插緊) 3. 按鈕壓至第一段 (不可壓至最底) 4. 深入液面下 2 4 mm 5. 慢慢釋放按鈕，即可 吸取液體無菌操作 接菌技巧1. 試管前端過火

13、2. 打開試管蓋無菌操作 液體接菌技巧方法一：以接種環(huán)沾菌，放入新的培養(yǎng)基中接菌方法二：以安全吸球吸取菌液，放入新的培養(yǎng)基中，向下排出菌液方法三：以Pipetman 吸取菌液，按鈕壓至最底排出菌液三、微生物的接種與分離、純化技術(shù)（一）接種：將微生物接到適于它生長(zhǎng)繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。1、接種工具和方法1接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀2、常用的接種方法）劃線接種 ）點(diǎn)植接種 ）穿刺接種 ）傾注接種）涂布接種 ）液體接種 ）注射接種 ）活體接種(二)、分離純化1 稀釋傾注平板法 ： 1、先稀釋樣品，加入平板2、倒平板

14、時(shí)注意培養(yǎng)基溫度 3、混合均勻、平板劃線法：.斜線法 2.曲線法 3.方格法 4.放射法 5.四格法平板劃線法：1、倒平板，標(biāo)記培養(yǎng)基名稱，編號(hào)和實(shí)驗(yàn)日期。 2、劃線方法 四、微生物的培養(yǎng)方法（一）一般培養(yǎng)法（需氧培養(yǎng)）培養(yǎng)溫度:2537 ；接種后平板、試管、三角瓶，置于恒溫培養(yǎng)箱（二）、厭氧培養(yǎng)方法1、簡(jiǎn)易的厭氧培養(yǎng)法：（1）庖肉培養(yǎng)法（2）鐵絲圈厭氧培養(yǎng)法（3）焦性沒食子酸法2、厭氧罐法 3、厭氧手套箱法A、厭氧缸法：厭氧缸是普通的干燥缸，用物理化學(xué)的方法使缸內(nèi)造成厭氧環(huán)境，從而將厭氧菌培養(yǎng)出來。接種好標(biāo)本的平板或液體培養(yǎng)基試管，可放入?yún)捬醺變?nèi)培養(yǎng)。B、厭氧罐法：裝入待培養(yǎng)的對(duì)象，然后密閉

15、罐蓋，接著可采用抽真空灌氮抽真空灌氮抽真空灌混合氣(N2CO2H2=801010，V/V)。（三）二氧化碳培養(yǎng)法1、燭缸法 2、二氧化碳置換法3、化學(xué)法：每一升用重碳酸鈉0.4克與濃鹽酸0.35亳升加入4、二氧化碳培養(yǎng)箱法五、微生物培養(yǎng)特性觀察與記錄在固體培養(yǎng)基上，觀察： 菌落大小、形態(tài)、顏色、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等。在液體培養(yǎng)中：表面生長(zhǎng)情況（菌膜、環(huán)）混濁度及沉淀等。半固體培養(yǎng)基穿刺接種：觀察運(yùn)動(dòng)、擴(kuò)散情況。1. 菌落形態(tài)觀察菌落特征:(1)大小:大、中、小、針尖狀,可用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落的直徑(mm)。(2)顏色:黃、淺黃、乳白、灰白、紅、粉紅等。(3)干濕:干

16、燥、濕潤(rùn)、黏稠。(4)質(zhì)地:蠟狀、液滴狀、皺褶狀等。(5)形態(tài):圓形、不規(guī)則等。(6)表面:扁平、隆起、凹、凸、突臍狀等。(7)透明:透明、半透明、不透明。(8)邊緣:整齊、不整齊、圓鋸齒狀、裂葉、不定形。六、染色技術(shù)(一) 染色的基本原理微生物染色的基本原理是借助物理因素和化學(xué)因素的作用而進(jìn)行的。物理因素：如細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對(duì)染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透、吸附作用等?；瘜W(xué)因素：根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)和染料的不同性質(zhì)而發(fā)生的各種化學(xué)反應(yīng)。酸性物質(zhì)對(duì)于堿性染料較易吸附,且吸附作用穩(wěn)固;同樣,堿性物質(zhì)對(duì)酸性染料較易于吸附。如酸性物質(zhì)細(xì)胞核對(duì)于堿性染料就有化學(xué)親和力,易于吸附。(二) 染料的種類和選擇堿性染料：如美藍(lán)、

17、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅或孔雀綠等；酸性染料：如伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等；中性染料：是上述兩者的結(jié)合物,也叫復(fù)合染料,比如,伊紅美藍(lán)、伊紅天青等。(三) 染色方法單染色法即只用一種染料對(duì)細(xì)菌著色。此法手續(xù)簡(jiǎn)便,但一般只能顯示菌體的形態(tài),功能較單一。復(fù)染色法是使用兩種及兩種以上染料對(duì)細(xì)菌染色。常用的方法有革蘭氏染色法和抗酸染色法等。(四)染色的基本程序單細(xì)胞細(xì)菌染色為例1.涂片：(1)在潔凈無油脂的載玻片上滴一滴生理鹽水(如果是液體菌懸液,則可不滴)。(2)用滅菌接種環(huán)挑取菌落少許至載玻片的生理鹽水內(nèi),并輕輕涂布成薄薄的菌膜。若是菌液標(biāo)本,則用無菌接種針直接涂布成菌膜。2.干燥：涂布的標(biāo)本,一般在室溫下

18、自然干燥。 若需加速干燥，則可在酒精燈火焰上方利用其熱空氣加溫,切忌火烤和溫度過高。3.固定：細(xì)菌固定常用的是火焰加熱法 將干燥涂片迅速通過火焰23次,溫度不宜過高,以玻片背面觸及皮膚有熱感而不燙手為度。4.染色：染色的目的是增大標(biāo)本與環(huán)境的反差，便于在顯微鏡下觀察。以普通涂片標(biāo)本的染色為例,就是將所需染色液滴加在標(biāo)本上，以覆蓋涂膜為夠，達(dá)到所需染色時(shí)間，傾去染色液，水洗，吸干即可。5.媒染：有的染色還需要增加媒染劑。以增大染料與被檢標(biāo)本物質(zhì)的親和力，或使染料更好地固定于被染標(biāo)本。媒染劑可用于細(xì)菌標(biāo)本固定之后，也可包含在固定劑或染色液中，革蘭氏染色中的碘液就是媒染劑。6.脫色：使著色的染料脫去

19、顏色稱為脫色。能脫色的物質(zhì)稱為脫色劑。在染色中,使用脫色劑的作用有的是起溶媒作用,有的是影響細(xì)菌蛋白質(zhì)的電離度，改變電荷的性質(zhì)和數(shù)量，因而影響染料的染色質(zhì)量。利用脫色劑主要是檢查染料與細(xì)菌結(jié)合的穩(wěn)定程度，作為鑒定染色之用。如革蘭氏染色使用乙醇，就是鑒別不同的細(xì)菌。使用脫色劑時(shí)，就是將脫色劑滴在經(jīng)過染色的標(biāo)本上，作用一定時(shí)間后，傾去脫色劑，水洗即成。有的脫色一定要掌握好時(shí)間，否則不能達(dá)到理想目的。7.復(fù)染：在進(jìn)行鑒別染色時(shí),已經(jīng)進(jìn)行過脫色的標(biāo)本，常需要復(fù)染劑重復(fù)染色1次，使復(fù)染劑與初染顏色形成鮮明對(duì)比。復(fù)染不宜太強(qiáng)，以免覆蓋初染顏色。常用的細(xì)菌染色法1. 簡(jiǎn)單染色法：簡(jiǎn)單染色法是利用單一染料對(duì)細(xì)

20、菌進(jìn)行染色的一種方法。此法操作簡(jiǎn)便,適用于菌體一般形狀和細(xì)菌排列的觀察。常用堿性染料進(jìn)行簡(jiǎn)單染色。簡(jiǎn)單染色方法:涂片干燥固定染色水洗干燥鏡檢簡(jiǎn)單染色流程(1)涂片：取一塊干凈的載玻片,并在其中央滴一小滴生理鹽水(或無菌蒸餾水)。接種環(huán)在酒精燈上殺菌后從斜面挑取少量菌種(金黃色葡萄球菌或枯草桿菌)與玻片上的水滴混勻后,涂布成一均勻的薄層。涂布面一般以直徑1cm大小范圍為宜。(2)干燥與固定：涂片最好在室溫下使其自然干燥。亦可在酒精燈上微微加熱,加速水分蒸發(fā),但切勿過熱。固定時(shí),在酒精燈火焰外層盡快地來回通過23次,多為23s,以載玻片背面不覺燙手為宜,放置待冷后,進(jìn)行染色。(3)染色：在涂片上滴

21、染色液一滴,使染色液覆蓋涂片,染色約1min。(4)水洗：斜置載玻片,在來自水龍頭下用小股水線沖洗,直至洗下的水呈無色為止。(5)干燥：用吸水紙吸去涂片邊緣的水珠,置室溫下自然干燥或微微加熱,以加快干燥速度。注意用吸水紙時(shí)切勿將菌體擦掉。(6)鏡檢：用顯微鏡觀察,并用鉛筆繪出細(xì)菌形態(tài)圖。2. 革蘭氏染色法：革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌分類和鑒定的重要性狀。革蘭氏染色是一種復(fù)染色法(由兩種或多種染料染色的方法,稱復(fù)染色法,又叫鑒別染色法)。革蘭氏染色法(Gram stain)不僅能觀察到細(xì)菌的形態(tài)而且還可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類:染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,用G+表示;染色反應(yīng)呈紅色(復(fù)染顏色)

22、的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌,用G表示。革蘭氏染色需要的試劑主要有草酸銨結(jié)晶紫染液、碘液、石炭酸復(fù)紅染液、95%乙醇、番紅染液、香柏油、二甲苯。 染色流程：制片干燥固定初染水洗媒染水洗脫色水洗復(fù)染水洗干燥觀察革蘭氏染色流程(1)制片。取大腸桿菌和枯草桿菌(均以無菌操作)分別做涂片。方法與簡(jiǎn)單染色法相同(取菌一定不要太多和涂片太厚,否則導(dǎo)致菌體重疊,難以觀察)。(2)初染。用草酸銨結(jié)晶紫染色1min后水洗。(3)媒染。滴加碘液媒染1min后水洗。(4)脫色。將載玻片上水滴小心吸凈后,滴加95%乙醇脫色,至流出的乙醇不現(xiàn)紫色為止,需時(shí)2030s,隨即水洗;或?qū)⒁掖嫉螡M整個(gè)涂片,靜置約30s,水洗,這樣可節(jié)

23、約乙醇。(5)復(fù)染。用番紅染液復(fù)染約1.5min后水洗。(6)干燥。用吸水紙吸掉水滴,于室溫下自然干燥。(7)鏡檢。待標(biāo)本片干后置顯微鏡下,用油鏡觀察,注意細(xì)菌細(xì)胞的顏色,并用鉛筆繪出細(xì)菌形態(tài)圖。3. 芽孢染色法細(xì)菌芽孢含水量很低,具有厚而致密的壁,其通透性比營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞低,著色和脫色均較困難,折光性很強(qiáng)。除了用著色力強(qiáng)的染料外,還必須加熱,以促進(jìn)芽孢的著色,再使菌體脫色,而芽孢上的染料則難以滲出,故仍保留原有顏色,然后用另一種反差強(qiáng)烈的染料復(fù)染,使菌體和芽孢呈現(xiàn)出不同的顏色,明顯地襯托出芽孢來。具體方法有很多,如孔雀綠一番紅染色法等。細(xì)菌芽孢染色流程(1)制備菌液： 加12滴無菌水于小試管中,用

24、接種環(huán)從斜面上挑取23環(huán)蘇云金桿菌或者枯草桿菌的菌體于試管中并充分打勻,制成濃稠的菌液。(2)加染色液： 加5%孔雀綠水溶液23滴于小試管中,用接種環(huán)攪拌使染料與菌液充分混合。(3)加熱： 將此試管浸于沸水浴(燒杯),加熱1520min。(4)涂片： 用接種環(huán)從試管底部挑數(shù)環(huán)菌液于潔凈的載玻片上,做成涂面,晾干。(5)固定： 將涂片通過酒精燈火焰3次。(6)脫色： 用水洗直至流出的水中無孔雀綠顏色為止。(7)復(fù)染： 加番紅水溶液染色5min后,傾去染色液,不用水洗,直接用吸水紙吸干。（8）鏡檢： 先低倍,再高倍,最后用油鏡觀察。結(jié)果：芽孢呈綠色,芽孢囊和菌體為紅色。4. 鞭毛染色法細(xì)菌鞭毛極細(xì)

25、,其直徑般為1020nm,只有用電子顯微鏡才能觀察到。但是若采用特殊染色方法,則在普通光學(xué)顯微鏡下也能看到。鞭毛染色法有很多,但基本原理相同,即在染色前先經(jīng)媒染劑處理,讓它沉積在鞭毛上,使鞭毛直徑加粗,然后再進(jìn)行染色。常用的媒染劑是由單寧酸和鉀明礬或氯化鐵等配制而成的一種不太穩(wěn)定的膠體溶液,而染料可根據(jù)不同的方法有多種選擇。5. 莢膜染色法莢膜是由多糖類衍生物和多肽聚集而成的,能溶于水,且自身含水量很高。由于莢膜與染料間的親和力弱,不易著色,通常采用負(fù)染色法對(duì)莢膜染色,即設(shè)法使菌體和背景著色而莢膜不著色。因此,莢膜在菌體周圍呈現(xiàn)一個(gè)透明圈,從而可以清晰地觀察到莢膜的大小和形態(tài)。莢膜染色法主要有

26、番紅染色法、濕墨水法、干墨水法和Tyler法等1. 負(fù)染色法(1)制片： 取潔凈的載玻片一塊,加蒸餾水一滴,取少量膠質(zhì)芽孢桿菌的菌體放人水滴中混勻并涂布。(2)干燥： 將涂片放在空氣中晾干或用電吹風(fēng)冷風(fēng)吹干。(3)染色： 在涂面上加復(fù)紅染色液染色23min。(4)水洗： 用水洗去復(fù)紅染液。(5)干燥：。將染色片放空氣中晾干或用電吹風(fēng)冷風(fēng)吹干。(6)涂黑素： 在染色涂面左邊加一小滴黑素,用一邊緣光滑的載玻片輕輕接觸黑素,使黑素沿玻片邊緣散開,然后向右一拖,使黑素在染色涂面上成為一薄層,并迅速風(fēng)干。(7)鏡檢 先低倍鏡、再高倍鏡觀察。結(jié)果：背影灰色,菌體紅色,莢膜無色透明。2. 濕墨水法(1)制菌

27、液： 加1滴墨水于潔凈的載玻片上,挑少量膠質(zhì)芽孢桿菌的菌體與其充分混合均勻。(2)加蓋玻片： 放一清潔蓋玻片于混合液上,然后在蓋玻片上放一張濾紙,向下輕壓,吸去多余的菌液。加蓋玻片時(shí)不可有氣泡,否則會(huì)影響觀察。(3)鏡檢： 先用低倍鏡、再用高倍鏡觀察。結(jié)果：背景灰色,菌體較暗,在其周圍呈現(xiàn)一明亮的透明圈即為莢膜。3. 干墨水法(1)制菌液： 加1滴6%葡萄糖液于潔凈載玻片一端,挑少量膠質(zhì)芽孢桿菌的菌體與其充分混合,再加1滴墨水,充分混勻。（2）制片： 左手執(zhí)玻片,右手另拿一邊緣光滑的載玻片,將載玻片的一邊與菌液接觸,使菌液沿玻片接觸處散開,然后以30角,迅速而均勻地將菌液拉向玻片的一端,使菌液

28、鋪成一薄膜。(3)干燥： 空氣中自然干燥。(4)固定： 用甲醇浸沒涂片,固定1min,立即傾去甲醇。(5)干燥： 在酒精燈上方,用文火干燥,不可使玻片發(fā)熱。(6)染色： 用甲基紫染12min。(7)水洗： 用自來水輕洗,自然干燥。(8)鏡檢： 先用低倍鏡、再高倍鏡觀察。結(jié)果：背景灰色,菌體紫色,莢膜呈一清晰透明圈。6. 霉菌的染色霉菌菌絲較粗大,細(xì)胞易收縮變形,且孢子容易飛散,所以制標(biāo)本時(shí)常用乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液。此染色液制成的霉菌標(biāo)本片的特點(diǎn)是:細(xì)胞不變形,具有殺菌防腐作用,且不易干燥,能保持較長(zhǎng)時(shí)間,溶液本身呈藍(lán)色,有一定染色效果。七、微生物顯微技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室中常用的有:普通光學(xué)顯微鏡、暗視

29、野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡等。通常在我們觀察細(xì)菌、放線菌以及真菌等相對(duì)較大的微生物時(shí),可以采用普通光學(xué)顯微鏡。普通光學(xué)顯微鏡通常能將物體放15002000倍。八、微生物計(jì)數(shù)法顯微直接計(jì)數(shù)法：利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù),能立即得到數(shù)值,但死活細(xì)胞都計(jì)數(shù)在內(nèi)。平板計(jì)數(shù)法：是平板上長(zhǎng)成菌落后再計(jì)數(shù),反應(yīng)較真實(shí),但費(fèi)時(shí)太長(zhǎng)。（一）微生物直接計(jì)數(shù)法利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行直接計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)前需對(duì)樣品做適當(dāng)稀釋,然后將經(jīng)過適當(dāng)稀釋的菌懸液(或孢子懸液)放在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室內(nèi),按照在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目代入計(jì)算公式運(yùn)算后,即可得出單位體積微生物總數(shù)目。此法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速。用于

30、直接測(cè)數(shù)的菌懸液濃度一般不宜過低或過高(常大于106個(gè)/mL)。活躍運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌應(yīng)現(xiàn)用甲醛殺死或適度加熱以停止其運(yùn)動(dòng)。顯微計(jì)數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液,如有雜菌或雜質(zhì),常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計(jì)數(shù)板,一般細(xì)菌則采用彼得羅夫霍澤(Petrof Hausser)細(xì)菌計(jì)數(shù)板。兩種計(jì)數(shù)板的原理和部件相同,只是細(xì)菌計(jì)數(shù)板較薄,可以使用油鏡觀察。而血球計(jì)數(shù)板較厚,不能使用油鏡,計(jì)數(shù)板下部的細(xì)菌不易看清。每個(gè)方格網(wǎng)共分九個(gè)大方格,中間的方格即為計(jì)數(shù)區(qū)。計(jì)數(shù)區(qū)分為16個(gè)中方格,而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格，即計(jì)數(shù)區(qū)都由400個(gè)小方格組成。每毫升菌懸液中含有細(xì)胞數(shù)=每個(gè)小格

31、中細(xì)胞平均數(shù)(N) 系數(shù)( ) 菌液稀釋倍數(shù)(d)。 系數(shù)K=400 104血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的便用(1)稀釋菌液：根據(jù)待測(cè)菌懸液濃度,加無菌水適當(dāng)稀釋,目的是便于酵母菌懸液的計(jì)數(shù),以每小方格內(nèi)含有45個(gè)酵母細(xì)胞為宜,一般稀釋100倍即可。(2)準(zhǔn)備計(jì)數(shù)板：取清潔干燥的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板(使用前可通過顯微鏡檢驗(yàn)計(jì)數(shù)板上有無污物,若有,則需清洗后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)),在中央的計(jì)數(shù)室上加蓋專用的蓋玻片。(3)加樣：將稀釋后的酵母菌懸液搖勻,用滴管吸取一滴置于蓋玻片的邊緣(不宜過多),讓菌懸液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用緩緩滲入計(jì)數(shù)室,勿使氣泡產(chǎn)生,并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。 也可以將菌懸液直接滴加在計(jì)數(shù)區(qū)上,不

32、要使計(jì)數(shù)區(qū)兩邊平臺(tái)沾上菌懸液,以免加蓋蓋玻片后,造成計(jì)數(shù)區(qū)深度的升高。然后加蓋蓋玻片(勿使氣泡產(chǎn)生)。(4)計(jì)數(shù)：靜置片刻(一般為510min ,使酵母菌全部沉降到血細(xì)胞計(jì)數(shù)室內(nèi)。將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于載物臺(tái)上夾穩(wěn),先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)室后,再換成高倍鏡觀察并計(jì)數(shù)。 由于活細(xì)胞在顯微鏡下是透明的,光照強(qiáng)度過大時(shí)難以辨別,所以觀察時(shí)應(yīng)減弱光照的強(qiáng)度計(jì)算公式血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的清洗與保藏(1)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板使用后,取下蓋玻片,用自來水沖洗,切勿用硬物洗刷或抹擦,以免損壞網(wǎng)格刻度。洗后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干,或用95%的乙醇、無水乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑脫水使其干燥。(2)計(jì)數(shù)板沖洗后,還要通過鏡檢觀察每小格內(nèi)是否

33、殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈,則必須重復(fù)清洗直到干凈,干燥后方可放入盒內(nèi)保存。（二）稀釋平板計(jì)數(shù)法(或活菌計(jì)數(shù)法)在理論上可以認(rèn)為在高度稀釋條件下的每一個(gè)活的單細(xì)胞均能繁殖成一個(gè)菌落,因而可以用培養(yǎng)的方法使每個(gè)活細(xì)胞生長(zhǎng)成一個(gè)單獨(dú)的菌落,并通過長(zhǎng)出的菌落數(shù)去推算菌懸液中的活菌數(shù)。缺點(diǎn)是比較麻煩,費(fèi)工費(fèi)時(shí),而且在混合微生物樣品中只能測(cè)定占優(yōu)勢(shì)的并能在供試培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的類群,測(cè)定值常受各種因素的影響。一般細(xì)菌的平板菌落計(jì)數(shù)以30300個(gè)為宜（三）最大可能數(shù)計(jì)數(shù)法又稱液體稀釋培養(yǎng)計(jì)數(shù)法。本法適用于測(cè)定在一個(gè)混雜的微生物群中雖不占優(yōu)勢(shì),但卻具有特殊生理功能的類群。其特點(diǎn)：是利用待測(cè)微生物的特殊生理功

34、能的選擇性來擺脫其他微生物類群的干擾,并通過該生理功能的表現(xiàn)來判斷該群微生物的存在和豐度。本法特別適合于測(cè)定土壤微生物中特定生理群(如氨化菌、硝化菌、纖維素分解菌、自生固氮菌、根瘤菌、硫化細(xì)菌和反硫化細(xì)菌等)的數(shù)量和檢測(cè)牛奶及其他食品中特殊微生物類群的數(shù)量。其缺點(diǎn)是只能進(jìn)行特殊生理群的測(cè)定,結(jié)果偏差較大（四）比濁法原理：根據(jù)在一定的濃度范圍內(nèi),菌懸液中的微生物細(xì)胞濃度與液體的光密度成正比,與透光度成反比。 可使用光電比色計(jì)測(cè)定。由于細(xì)胞濃度僅在一定范圍內(nèi)與光密度成直線關(guān)系,因此,待測(cè)菌懸液的細(xì)胞濃度不應(yīng)過低或過高,培養(yǎng)液的色調(diào)也不宜過深,顆粒性雜質(zhì)的數(shù)量應(yīng)盡量減少。本法常用于觀察和控制在培養(yǎng)過

35、程中微生物的菌數(shù)消長(zhǎng)情況。如,細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定和發(fā)酵罐中的細(xì)菌生長(zhǎng)量控制等。其優(yōu)缺點(diǎn)與直接測(cè)數(shù)法相同。（五）濃縮法(膜過濾法)本法適用于檢測(cè)微生物數(shù)量很少的水和空氣等樣品。測(cè)定時(shí)讓定量的水或空氣通過特殊的微生物收集裝置(如微孔濾膜等),富集其中的微生物,然后將濾膜干燥、染色,并經(jīng)處理使膜透明,再在顯微鏡下計(jì)算膜上(或一定面積中)的細(xì)菌數(shù)?；?qū)⑹占奈⑸锵疵摵鬁y(cè)數(shù),再換算成原來水或空氣中的數(shù)量。九、菌種保藏技術(shù)根據(jù)菌種的生理生化特點(diǎn),創(chuàng)造一個(gè)有利于其休眠或代謝活動(dòng)處于最低的環(huán)境條件,即低溫、干燥、缺乏氧氣和養(yǎng)料,以及添加保護(hù)劑等,使微生物的代謝活動(dòng)處于最低的狀態(tài),但又不至于死亡,從而達(dá)到保藏

36、的目的。依據(jù)不同的菌種或不同的需求,應(yīng)該選用不同的保藏方法。一般情況下,斜面保藏、半固體穿刺、液體石蠟保藏法和砂土管保藏法較為常用,也比較容易制作。（一）常規(guī)保藏方法1、斜面保藏法操作步驟：標(biāo)記試管接種培養(yǎng)保藏將菌種轉(zhuǎn)接在適宜固體斜面培養(yǎng)基上,待其充分生長(zhǎng)后, 置4 冰箱中保藏。保藏時(shí)間依微生物的種類而定。霉菌、放線菌及芽孢菌保存24個(gè)月移種1次,酵母菌間隔兩個(gè)月,普通細(xì)菌1個(gè)月,假單胞菌兩周傳代1次。2、半固體穿刺保藏法按穿刺接種方式培養(yǎng)菌種,菌種長(zhǎng)好后用膠塞封嚴(yán),置4 的冰箱存放。操作步驟：標(biāo)記試管穿刺接種培養(yǎng)保藏。貼標(biāo)簽。取無菌的半固體肉湯蛋白胨直立柱數(shù)支,貼上標(biāo)簽,注明細(xì)菌菌名、培養(yǎng)基名稱和接種日期。穿刺接種。用接種針以無菌方式