微核形成與細(xì)胞周期關(guān)系的初步研究

PAGEword文檔可自由復(fù)制編輯word文檔可自由復(fù)制編輯題目：微核形成與細(xì)胞周期關(guān)系的初步研究學(xué)生姓名：XX學(xué)號(hào)：XXXX學(xué)部（系）：信息學(xué)部專業(yè)年級(jí)：06生物技術(shù)指導(dǎo)教師：XXX職稱或?qū)W位：工程師20目錄TOC\o"1-2"\h\z\u摘要………………4關(guān)鍵詞…………4Abstract…………4Keywords………………………51 .選題背景……………………51.1課題來(lái)源…………51.2國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究……………51.3目的和意義………………………81.4課題設(shè)計(jì)指導(dǎo)思想……………82 .方案論證……………………82.1方案的設(shè)計(jì)原理………………82.2方案論證……………………93 .材料與方法…………………103.1材料與儀器……………………103.2實(shí)驗(yàn)步驟…………114 .結(jié)果與討論…………………144.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果…………144.2結(jié)果與分析……………………175 .結(jié)論與心得…………………175.1結(jié)論………………175.2心得………………17致謝……………18附錄……………19附－1實(shí)驗(yàn)藥品………………………19附－2實(shí)驗(yàn)儀器………………………19參考文獻(xiàn)………………………20微核形成與細(xì)胞周期關(guān)系的初步研究摘要微核是真核生物細(xì)胞中的一種異常結(jié)構(gòu),他是各種理化因子，如輻射、化學(xué)藥物對(duì)分裂細(xì)胞作用的結(jié)果。一般認(rèn)為微核是起源于落后染色體與喪失著絲粒的斷片，在有絲分裂末期形成。但是另一些實(shí)驗(yàn)則表明間期細(xì)胞也可形成微核。本課題通過(guò)體外培養(yǎng)人的外周血淋巴細(xì)胞，在細(xì)胞周期的特定時(shí)期注射環(huán)磷酰胺20ug/ml，觀察淋巴細(xì)胞微核形成與細(xì)胞周期的關(guān)系;實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了細(xì)胞周期的各時(shí)期都可能有微核形成。關(guān)鍵詞：環(huán)磷酰胺；淋巴細(xì)胞；細(xì)胞周期;微核MicronucleusformationandcellcyclestudiesontherelationshipbetweenAbstractMicronucleusaretheabnormalstructure,whichusuallyaretheresultofallkindsofphysical-chemicallyfactorssuchasradiation，chemicalmedicinetomitoticcells.Micronucleusisgenerallybelievedthatbehindtheoriginandlossofcentromerechromosomefragment,formedinlatemitosis.However,whilesomeotherexperimentsoncellsthatcanformbetweenthemicronucleus..Thistopicthroughinvitroofperipheralbloodlymphocyte,Inthecellcycleofspecificperiod20ug/mlcyclophosphamideinjection,Observelymphocytemicronucleusformationandthecellcycle.Theresultsconfirmedthecellcyclemayhavedifferentperiodsmicronucleusformation.KeyWords:Cyclophosphamide;Lymphocytes;Cellcycle；Micronucleus.選題背景課題來(lái)源生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心李奇志老師國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究1.2.1微核的研究狀況微核是指位于細(xì)胞漿中獨(dú)立于主核的核小體，其染色同主核，但比主核淡，其直徑小于主核1／3，主要由外界損害因素(生物、物理、化學(xué))作用細(xì)胞后，導(dǎo)致細(xì)胞染色體丟失或斷裂，從而在胞漿中形成1個(gè)或數(shù)個(gè)小核[1]。因此，微核試驗(yàn)在對(duì)外來(lái)化合物(如藥品、食品添加劑、農(nóng)藥、化妝品、環(huán)境污染物等)遺傳毒性和職業(yè)暴露人群遺傳損害監(jiān)測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)生態(tài)環(huán)境檢測(cè)方面，在診斷和預(yù)防肝癌、食管癌、肺癌等惡性腫瘤方面得到了大量的應(yīng)用。微核試驗(yàn)最大的優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單、快速，而國(guó)內(nèi)外大量的對(duì)比試驗(yàn)研究，比較一致的看法是該方法在敏感性、特異性和準(zhǔn)確性方面，與經(jīng)典的染色體畸變分析方法基本相當(dāng)[2]。因而，特別適合作為大量化合物和現(xiàn)場(chǎng)人群初篩的實(shí)驗(yàn)方法。微核試驗(yàn)創(chuàng)建于20世紀(jì)70年代中期(1973～1975)[3,4]，目前許多國(guó)家和國(guó)際組織，已將其規(guī)定為新藥、食品添加劑、農(nóng)藥、化妝品等毒理安全性評(píng)價(jià)的必做實(shí)驗(yàn)[5~8]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和滲透到微核研究中，大大拓展了微核試驗(yàn)的檢測(cè)和應(yīng)用范圍，已發(fā)展成為能同時(shí)檢測(cè)染色體斷裂、丟失、分裂延遲、分裂不平衡、基因擴(kuò)增、不分離、DNA損傷修復(fù)障礙、Hprt基因突變、凋亡、細(xì)胞分裂不平衡等多種遺傳學(xué)終點(diǎn)的檢測(cè)，因而近年來(lái)國(guó)際上有人提出了新微核試驗(yàn)概念[9]，從而大大拓展了微核試驗(yàn)的應(yīng)用范圍[10,11]。當(dāng)然，要實(shí)現(xiàn)一個(gè)實(shí)驗(yàn)多個(gè)遺傳損害終點(diǎn)的檢測(cè)，需要更多的新的技術(shù)手段配合，如FISH技術(shù)、圖象分析技術(shù)等等，這也對(duì)我國(guó)的實(shí)驗(yàn)室條件和研究水平提出了更高的要求。由于大量新的化合物的合成，原子能應(yīng)用，各種各樣工業(yè)廢物的排出，使人們很需要有一套高度靈敏，技術(shù)簡(jiǎn)單的測(cè)試系統(tǒng)來(lái)監(jiān)視環(huán)境的變化。只有真核類的測(cè)試系統(tǒng)更能直接推測(cè)誘變物質(zhì)對(duì)人類或其它高等生物的遺傳危害，在這方面，微核測(cè)試是一種比較理想的方法。目前國(guó)內(nèi)外不少部門(mén)已把微核測(cè)試用于輻射損傷、輻射防護(hù)、化學(xué)誘變劑、新藥試驗(yàn)、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等各方面。微核試驗(yàn)已成為檢測(cè)藥物、放射線、有毒物質(zhì)的遺傳毒性，反映其對(duì)人體細(xì)胞或體外培養(yǎng)細(xì)胞遺傳學(xué)損傷的一個(gè)重要方法。近幾年，隨著DNA碎片的分析、細(xì)胞凋亡的研究、單克隆抗體的應(yīng)用、人類基因組學(xué)研究和腫瘤基因組解剖計(jì)劃進(jìn)一步豐富了微核理論。1.2.2微核形成的機(jī)理微核形成的機(jī)理微核形成的機(jī)理，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為微核主要來(lái)源于染色體畸變中的無(wú)著絲粒斷片和單條或多條染色體。曹佳等采用電鏡、BrdU標(biāo)記、DNA探針雜交等技術(shù)[12~14]，對(duì)微核結(jié)構(gòu)、功能進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)部分淋巴細(xì)胞微核具有一定的結(jié)構(gòu)和功能，部分微核具有DNA復(fù)制能力，不同誘變劑誘導(dǎo)的微核具有不同的染色體組成，并有一定的規(guī)律性。如非整倍體斷裂劑(化學(xué)誘變劑)誘導(dǎo)的微核，主要由丟失的整條染色體組成；染色體斷裂劑(物理因素)誘導(dǎo)的微核，主要由染色體斷片組成。①化學(xué)誘變學(xué)說(shuō)：當(dāng)細(xì)胞受到化學(xué)誘變劑作用后，造成染色體斷裂或有絲分裂器(主要指紡錘絲)的損傷，在細(xì)胞分裂后期，此斷片和染色體不能被納入子細(xì)胞核，形成游離在胞質(zhì)中的小核(微核)。紡錘絲毒性類藥物如秋水仙堿、HO一221等直接抑制動(dòng)物細(xì)胞紡錘絲的形成，阻止細(xì)胞分裂中期紡錘絲將染色體拉至細(xì)胞的兩端。Ando等n應(yīng)用抗腫瘤藥(HO一221)抑制紡錘絲微管組裝，破壞紡錘絲，結(jié)果在染色體分析時(shí)誘導(dǎo)出多倍體和亞二倍體細(xì)胞，未見(jiàn)染色體斷裂，鼠體內(nèi)細(xì)胞也常被誘導(dǎo)出較大的微核。有機(jī)苯能引起微核增多且有明顯的致癌作用，苯三酚(1，2，4一苯三酚，BT)在氧化成醌時(shí)產(chǎn)生活性氧損傷DNA和其它一些細(xì)胞大分子，實(shí)驗(yàn)中BT能使淋巴細(xì)胞微核率上升2倍，使HK一60細(xì)胞微核率上升8倍，且總微核數(shù)兩類細(xì)胞呈劑量相關(guān)性增高，BT不僅引起染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的變化，而且通過(guò)產(chǎn)生新氧間接引發(fā)點(diǎn)突變。此外，我們用不同濃度的重金屬砷、鉛、錳、汞溶液對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞染毒試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)微核在一定濃度范圍內(nèi)呈顯著升高趨勢(shì)；通過(guò)對(duì)電焊工、油漆工、汽車司機(jī)、煉油廠職工這些有害因素接觸人群微核的檢測(cè)，我們也發(fā)現(xiàn)其微核率明顯高于健康對(duì)照組；我們通過(guò)對(duì)化療患者外周血淋巴細(xì)胞微核監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其化療前、化療中和化療后有明顯的變化(設(shè)健康對(duì)照組)，可見(jiàn)化療藥物具有明顯的致畸致突變作用。②細(xì)胞組成成分缺乏學(xué)說(shuō)：有作者對(duì)9位健康志愿者進(jìn)行了葉酸限量試驗(yàn)，從基礎(chǔ)用量的195mg／d，減少到56mg／d，維持5w，然后慢慢補(bǔ)充葉酸，減量后的雙核淋巴細(xì)胞和全系淋巴細(xì)胞內(nèi)的微核頻率均增高，且著絲點(diǎn)陽(yáng)性和陰性的微核都增加。當(dāng)葉酸補(bǔ)充后，兩類細(xì)胞微核率明顯下降，著絲點(diǎn)陽(yáng)性微核變化更為顯著。實(shí)驗(yàn)表明，低葉酸血癥在臨床貧血癥狀之前，就出現(xiàn)了血液和口腔黏膜細(xì)胞遺傳物質(zhì)損傷口引?？梢?jiàn)其二者之間呈負(fù)相關(guān)，而血漿半胱氨酸濃度與微核率呈正相關(guān)，低維生素D導(dǎo)致血液細(xì)胞遺傳物質(zhì)損傷[15]，微核率升高。由此可見(jiàn)，DNA合成過(guò)程所需原料的缺乏(關(guān)鍵酶、核苷酸以及膜完整性所需成分等)均可導(dǎo)致微核升高。③染色體畸變斷片學(xué)說(shuō)：主要指電離輻射(包括X，中子，a)，體內(nèi)外細(xì)胞受照射后，導(dǎo)致遺傳物質(zhì)損傷，可誘發(fā)微核形成，由此可見(jiàn)這也是微核形成的一個(gè)重要因素[16，17]。研究資料表明，電離輻射誘發(fā)的微核主要是斷片形成的，其原因是電離粒子穿透染色體或其附近時(shí)，是染色體分子電離發(fā)生化學(xué)變化而斷裂形成斷片，最終形成微核，主要是有氧增強(qiáng)自由基增多所致。微核又是細(xì)胞凋亡產(chǎn)物，當(dāng)程序性死亡基因被激活，隨之Ca依賴性內(nèi)切酶激活切割DNA，形成細(xì)胞核碎片，形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為核深染，染色質(zhì)邊緣分布的帽形核，最后導(dǎo)致無(wú)數(shù)微核。經(jīng)過(guò)我們多年對(duì)放射工作者、核生產(chǎn)廠礦及核爆試驗(yàn)人員外周血淋巴細(xì)胞微核觀察，發(fā)現(xiàn)放射工作人員淋巴細(xì)胞微核細(xì)胞率、微核陽(yáng)性檢出率均顯著高于正常健康對(duì)照組，受意外照射人員微核明顯增高，淋巴細(xì)胞微核細(xì)胞率、微核陽(yáng)性檢出率與放射工齡呈陸線正相關(guān)關(guān)系，與個(gè)人年受照射劑量呈直線正相關(guān)，與個(gè)人累積受照劑量直線正相關(guān)。④膜損傷學(xué)說(shuō)：有的學(xué)者認(rèn)為，輻射作用于核膜的某一部位，使之變薄、穿孔，由于張力的作用，使核內(nèi)容物從受損膜部位向外突出、延伸、收縊，最終連絲斷裂而形成微核。國(guó)際上普遍認(rèn)為微核來(lái)源于染色體斷片或丟失的整條染色體，根據(jù)這一理論，細(xì)胞必須經(jīng)過(guò)分裂后，才能觀察到微核。但國(guó)內(nèi)薛開(kāi)先采用放射自顯影、間期細(xì)胞及各周期微核定量分析等手段，于1986年首先提出了間期細(xì)胞可以以核芽突方式形成微核學(xué)說(shuō)。曹佳使用BrdU標(biāo)記和電鏡技術(shù)，也證實(shí)了這一途徑可以解釋部分微核的形成[13,18,19]。兩學(xué)者的工作同時(shí)認(rèn)為：這一途徑與染色體斷片和染色體丟失形成微核理論并不矛盾，都是遺傳物質(zhì)的丟失，具有相同的遺傳毒理效應(yīng)。根據(jù)這一新的論點(diǎn)，在人群監(jiān)測(cè)中采集的外周血不需培養(yǎng)，即可直接在外周血淋巴細(xì)胞中觀察到微核的存在。⑤基因突變學(xué)說(shuō)：這里主要指病毒感染，可引起基因突變，蛋白質(zhì)和酶的變化，從而影響DNA的復(fù)制，誘發(fā)染色體畸變形成微核。DNA損傷和修復(fù)在機(jī)體維持動(dòng)態(tài)的平衡，通過(guò)研究自發(fā)微核率與性別、年齡的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)人體微核呈偏態(tài)分布，說(shuō)明細(xì)胞存在自發(fā)突變，微核隨年齡增加，不受性別影響，此外，逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和核酶的研究，加深了我們對(duì)中心法則的認(rèn)識(shí)，拓寬了RNA病毒致癌、致病的研究。病毒癌基因、細(xì)胞癌基因和癌基因活化機(jī)制，以及細(xì)胞凋亡機(jī)制的深入研究，也是對(duì)此學(xué)說(shuō)的有力證明。無(wú)論何種學(xué)說(shuō)，都認(rèn)為微核是核物質(zhì)，并有DNA合成能力。微核與細(xì)胞DNA修復(fù)，許多學(xué)者使用抗氧化劑、自由基清除劑與化學(xué)誘變劑共同作用于細(xì)胞來(lái)進(jìn)行研究。GIri等[20]研究認(rèn)為，維生素C有預(yù)防順鉑誘導(dǎo)鼠致畸的作用，聯(lián)合該兩類藥物，發(fā)現(xiàn)鼠骨髓細(xì)胞微核，染色體畸變等指標(biāo)明顯低于單獨(dú)使用順鉑。有趣的是他們還發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療過(guò)程中鼠骨髓細(xì)胞谷胱甘肽(GSH)水平也明顯增高，可解釋維生素C保護(hù)活體細(xì)胞免受順鉑誘導(dǎo)畸變的部分機(jī)理。此外，一些學(xué)者研究了腫瘤患者放療后外周血淋巴細(xì)胞微核的觀察以及與染色體畸變的關(guān)系[21,22]、安多霖對(duì)食管癌放療中扶正、升白作用的臨床觀察、引阿多拉膠囊降低飛行員高微核率臨床研究、烏龍茶降低氟化鈉和三氧化二砷誘發(fā)的小鼠骨髓細(xì)胞微核率的究、不同添加物對(duì)香煙煙霧水溶物引起蠶豆根尖細(xì)胞微核率的影響、香煙煙霧水液誘發(fā)蠶豆根尖細(xì)胞微核的研究。這些研究表明，抗氧化劑和自由基清除劑對(duì)化學(xué)誘變劑所引起的DNA損傷，微核率升高有明顯的抑制作用，間接的增強(qiáng)DNA修復(fù)和復(fù)制能力。當(dāng)細(xì)胞微核作為一種評(píng)價(jià)指標(biāo)用于輻射損傷、藥物篩選、腫瘤防治的實(shí)驗(yàn)研究,使它形成“微核測(cè)定法”被肯定以來(lái),人們就越來(lái)越關(guān)心和重視細(xì)胞微核在各種因素作用下形成機(jī)理的探討。目的和意義微核實(shí)驗(yàn)從建立開(kāi)始就因?yàn)槠潇`敏、穩(wěn)定，且能檢測(cè)染色體完整性改變和染色體分離改變兩種遺傳學(xué)終點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用，隨分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)已成為可檢測(cè)多終點(diǎn)的分子毒理學(xué)方法。在非整倍體毒劑檢測(cè)、致突變物篩選和外來(lái)化合物生物毒作用機(jī)制研究等領(lǐng)域有廣閼的應(yīng)用前景。誠(chéng)然，目前微核實(shí)驗(yàn)還存在：用于檢測(cè)微核著絲粒和端粒的DNA探針的特異性和靈敏性不十分滿意、尚不能全面分析微核來(lái)源于哪條染色體、微核自動(dòng)化分析費(fèi)用高等局限性；然而，隨新DNA探針的不斷發(fā)現(xiàn)、多色熒光原位雜交和計(jì)算機(jī)輔助的激光共焦顯微分析技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)微核實(shí)驗(yàn)?zāi)芨?xì)致、快捷地檢測(cè)微核的染色體來(lái)源。評(píng)價(jià)外來(lái)化臺(tái)物的毒性作用。微核試驗(yàn)已成為檢測(cè)藥物、放射線、有毒物質(zhì)的遺傳毒性，反映其對(duì)人體細(xì)胞或體外培養(yǎng)細(xì)胞遺傳學(xué)損傷的一個(gè)重要方法。近幾年，隨著DNA碎片的分析、細(xì)胞凋亡的研究、單克隆抗體的應(yīng)用、人類基因組學(xué)研究和腫瘤基因組解剖計(jì)劃進(jìn)一步豐富了微核理論，但研究范圍仍局限于幼紅細(xì)胞、成熟淋巴細(xì)胞及體外細(xì)胞株。隨著微核試驗(yàn)檢測(cè)范圍的進(jìn)一步拓寬，新微核試驗(yàn)正向我們走來(lái)，我國(guó)學(xué)者應(yīng)加強(qiáng)對(duì)這一方法的研究，加大新技術(shù)示范與推廣的力度，以縮小與國(guó)際同行研究的距離。1.4課題設(shè)計(jì)指導(dǎo)思想 本試驗(yàn)的目的是為了掌握微核試驗(yàn)的基本原理和基本技能，通過(guò)研究環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)人的外周血淋巴微核形成，判斷微核在細(xì)胞周期的哪個(gè)時(shí)期形成或哪個(gè)時(shí)期微核率（MNF）最大。2方案論證2.1方案的設(shè)計(jì)原理 本試驗(yàn)選取人的外周血淋巴細(xì)胞作為試驗(yàn)對(duì)象，觀察環(huán)磷酰胺對(duì)其影響以及微核的產(chǎn)生，判斷微核在細(xì)胞周期的哪個(gè)時(shí)期形成或哪個(gè)時(shí)期微核率（MNF）最大，以及微核的一些性質(zhì)研究。2.2方案論證2.2.1微核實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象已從骨髓紅細(xì)胞擴(kuò)展到多種在體細(xì)胞和離體培養(yǎng)細(xì)胞。過(guò)去認(rèn)為紅細(xì)胞成熟過(guò)程中能把主核排出胞外．微核滯留在胞內(nèi)，易于識(shí)別，而外周血中的含微核紅細(xì)胞又常被脾臟清除，所以常規(guī)微核實(shí)驗(yàn)以小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞為研究對(duì)象。80年代后發(fā)現(xiàn)小鼠脾臟不能有效清除含微核紅細(xì)胞．小鼠外周血紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果與骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)有較好的一致性。顯然前者更簡(jiǎn)便。并可對(duì)同一動(dòng)物進(jìn)行多次采樣分析。目前，該方法已被國(guó)際組織普遍接受，日本學(xué)者還直接分離小鼠血中微核進(jìn)行有關(guān)微核染色體組成的研究[23]。最近還發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞也可把微核排出胞外。并且被排出的微核主要來(lái)源于整條染色體[24]。隨技術(shù)發(fā)展，已能有效識(shí)別有核細(xì)胞中的微核。人外周血淋巴細(xì)胞、實(shí)體組織活檢細(xì)胞、組織脫落細(xì)胞(口腔、泌尿道)微核率等能在一定程度上反映射線及外來(lái)化合物等對(duì)某些器官造成的遺傳毒性損害，對(duì)腫瘤的研究、診斷均有較大參考價(jià)值，許多研究把它們作為生物劑量監(jiān)測(cè)指標(biāo)。生殖細(xì)胞(主要是精子)微核率，由于其特殊的遺傳地位，亦有較多研究報(bào)道。培養(yǎng)細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)避免了個(gè)體差異因素的影響，易于控制實(shí)驗(yàn)條件，操作簡(jiǎn)便。體外培養(yǎng)的血淋巴細(xì)胞、各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、原代腫瘤細(xì)胞、肝細(xì)胞及蠶豆根尖、紫露草等植物細(xì)胞等已廣泛用于微核實(shí)驗(yàn)研究?？傊筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的細(xì)胞進(jìn)行微核實(shí)驗(yàn)研究。2.2.2實(shí)驗(yàn)研究的方法①細(xì)胞動(dòng)力學(xué)阻滯微核分析:1985年Feneeh等建立了該方法，用胞質(zhì)分裂阻滯劑阻斷胞質(zhì)分裂，但不影響胞核分裂，有絲分裂細(xì)胞呈特殊形態(tài)的雙核細(xì)胞，未發(fā)生核分裂的細(xì)胞則維持單核細(xì)胞形態(tài)。檢測(cè)致突變固索作用后的雙核細(xì)胞率和雙核細(xì)胞做核率，可同時(shí)獲得致突變因素對(duì)細(xì)胞的遺傳毒性損害和對(duì)細(xì)胞周期影響的信息。這一方法倍受青睞．迅速得到廣泛應(yīng)用，不僅與后面提及的免疫熒光和原位雜交技術(shù)配合運(yùn)用，可以準(zhǔn)確分辨微核來(lái)源，判斷姐妹染色單體在子代細(xì)胞的分市。而且，通過(guò)觀察雙核細(xì)胞的兩個(gè)子代核間是否有染色質(zhì)橋，可檢測(cè)染色體分離障礙；用阿糖胞苷抑制DNA切除修復(fù)，觀察雙核細(xì)胞微核率的變化，可檢測(cè)DNA雙鏈損傷情況及DNA切除修復(fù)缺陷；觀察含6一琉基嘌呤的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的雙核和多核細(xì)胞率．可以檢測(cè)HPRT基因突變情況[25]。②免疫熒光微核分析:硬皮病患者血清中含有抗著絲粒(antikinetochoreantibodies)，能特異性地與人和一些哺乳動(dòng)物的著絲粒蛋白結(jié)合，通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)微核中是否存在著絲粒蛋白，可初步判斷微核來(lái)自于整條染色體還是染色體斷片。由于硬皮病患者常有明顯的CREST征(即鈣質(zhì)沉著、雷諾現(xiàn)象、食管能動(dòng)性障礙和指、趾硬皮病等)，這種方法也稱CREST染色。1986年Vig[26]等首先報(bào)道了這一方法，其后很多研究采用了這種方法，我們也用這種方法分析了昆明山海棠和丙烯酰胺誘導(dǎo)的微核[27,28]。由于這種方法檢測(cè)的是著絲粒蛋白，如果化合物能使著絲粒蛋白失活或合成受抑，就會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。已有研究表明．絲裂霉素c(mitomyeinc)、5一氮胞嘧啶(5一azacyti—dine)、地西泮(diazepam)、甲胺嘧啶(pyrimethamine)和氫釀(hydroq~none)等均可通過(guò)上述途徑導(dǎo)致著絲粒陽(yáng)性微核率下降。然而，這種方法簡(jiǎn)便易行，當(dāng)受試化合物對(duì)著絲粒蛋白無(wú)影響時(shí)，還是相當(dāng)準(zhǔn)確可靠，所以受到不少學(xué)者推崇。③熒光原位雜交微核分析:用著絲粒DNA探針或同時(shí)應(yīng)用著絲粒和端粒DNA探針，通過(guò)熒光原位雜交，檢測(cè)做核著絲粒和端粒信號(hào)，可準(zhǔn)確判斷微核來(lái)源于整條染色體還是染色體斷片，推測(cè)微核所含染色體和斷片的數(shù)目。應(yīng)用染色體特異性DNA探針，可檢測(cè)姐妹染色單體在于代細(xì)胞的分布(包括染色體丟失和染色體不分離)，分辨微核內(nèi)是否含有某幾條染色體。從而深入分析誘導(dǎo)微核形成的理化因素的遺傳毒性及毒作用靶位等。④原位啟動(dòng)DNA合成微核分析:用寡核苷酸引物，通過(guò)少數(shù)幾輪PCR原位擴(kuò)增目的DNA序列。并摻入地高辛標(biāo)記的dUTP，如熒光原位雜交一樣地度微核內(nèi)的著絲?；蚨肆３尸F(xiàn)熒光信號(hào)。Russo等用這種方法檢測(cè)了絲裂霉素C和秋水仙素誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞著絲粒和端粒組成，認(rèn)為這種方法靈敏度高，重復(fù)性好．并且更快捷。⑤對(duì)微核細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測(cè):凋亡是一種由遺傳調(diào)控的細(xì)胞生理性死亡機(jī)制，由于一些癌基因和抑癌基因參與了凋亡的調(diào)控，引起了人們的廣泛關(guān)注。尤其是P53基因，它既參與了DNA損傷所致的細(xì)胞周期阻滯和凋亡，也是維持基因組穩(wěn)定性所必需。有研究認(rèn)為P53還與微核形成有關(guān)。細(xì)胞遺傳物質(zhì)受損傷可能出現(xiàn)：仍能正常分裂、微核和非整倍體形成、發(fā)生凋亡?？梢?jiàn)，凋亡也是遺傳毒性損傷后續(xù)效應(yīng)的一個(gè)重要指標(biāo)，評(píng)估化合物遺傳作用時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞凋亡率檢測(cè)有重要意義。3材料與方法3.1材料與儀器3.1.1環(huán)磷酰胺粉末（針劑），生理鹽水，0.5％KCl溶液，蒸餾水，甲醇，冰醋酸，Giemsa原液，1mg/mlBrdu，PHA粉末（針劑），1ug/ml秋水仙素，滅活小牛血清。3.1.2試劑瓶，燒杯，量筒，玻璃棒，注射器，滴管，10ml離心管，鑷子，酒精燈，手套，口罩，離心機(jī)，電子天枰，光學(xué)顯微鏡，37℃培養(yǎng)箱，超凈臺(tái)，酒精燈，移液搶，冰箱,試管架，定時(shí)鐘，脫脂玻片，火柴等3.2實(shí)驗(yàn)步驟3.2.1溶液的配置一．常規(guī)溶液(一)1/15mol/LPBS(磷酸緩沖液PhosphateBufferSolution，PBS)甲液：1/15mol/LNa2HPO4溶液Na2HPO49.465g蒸餾水加至1000ml乙液：l/15mol/LKH2PO4溶液KH2P049.07g蒸餾水加至1000m1分裝在棕色瓶?jī)?nèi)，于4℃冰箱中保存，用時(shí)甲、乙兩液各按不同比例混合，即可得所需pH的緩沖液,見(jiàn)下表:pH甲液ml乙液mIpH甲液ml乙液mI5.295.595.916.246.476.642.55.010.020.030.040.097.595.090.080.070.060.06.816.987.177.387.738.0450.060.070.080.090.095.050.040.030.020.010.05.0(二)10μg／ml秋水仙素秋水仙素lOmg生理鹽水100ml裝入茶色瓶中，為貯備液，4℃冰箱中保存。甩時(shí)取貯備液1ml加生理鹽水9ml即可。(三)Giemsa染液1．貯備液Giemsa粉1g純甘油66ml甲醇66ml先將Giemsa粉置于研缽中加少量甘油，充分研磨，呈無(wú)顆粒的糊狀。再將全部甘油加入，放入56℃2．工作液臨用時(shí)將貯備液與pH6.8的磷酸鹽緩沖液按照1:20混合。二、細(xì)胞培養(yǎng)液(一)0.01mol／LPBS(磷酸鹽緩沖液PhosphateBufferSaline，PBS)pH7.2。0.2mol／L磷酸氫二鈉液(甲液)：NaH2PO4·12H2O35.814g雙蒸水加至500ml0.2mol／L磷酸二氫鈉液(乙液):NaH2PO4·12H2O15.601g雙蒸水加至500ml取甲液36ml，乙液14ml和NaCl8.2克，加雙蒸水至1000ml。混勻待完全溶解分裝，經(jīng)高壓滅菌后保存于4℃(二)Hanks液1．原液甲NaCl160gKCl8gMgSO4·7H2O2gMgCI2·6H2O2g溶于800ml餾水中。CaCl2(無(wú)水)2.8g溶于100ml蒸餾水中。將兩種液體混合后，加水至1000ml用濾紙濾過(guò)，再加2ml氯仿防腐，置4℃原液乙Na2HPO4·12H2O3.04gKH2PO41.2g葡萄糖20.0g溶于800ml蒸餾水中，用濾紙過(guò)濾，然后加0.5％酚紅80ml，再加水至1000ml，最后加入2ml氯仿防腐，置4℃(三)1640培養(yǎng)液(含lO％小牛血清)RPMI-1640粉10.39g雙蒸水加至1000ml通入適量的C02氣體，邊通入CO2邊慢慢攪拌，使其(呈透明)完全溶解。用NaHCO31.5克雙抗100u/ml10ml滅活小牛血清110ml混勻上述液體，立即用G6抽濾除菌分裝，置4℃(四)BrdU溶液(200ug/m1)用無(wú)菌青霉素瓶，在室溫下稱取1.0mg，在無(wú)菌條件下加入滅菌生理鹽水9.0ml，溶解，混勻，用黑紙包嚴(yán)，避光置冰箱冰格中保存。最好用時(shí)現(xiàn)配。（五）環(huán)磷酰胺溶液從冰箱中取一只注射用環(huán)磷酰胺粉末（劑量為0.02g），用20ml的超凈水溶解，使得環(huán)磷酰胺濃度為10mg/ml。由于使用時(shí)的濃度為1mg/ml，因此使用時(shí)稀釋10倍即為成為配制成1mg/ml環(huán)磷酰胺溶液。（六）制片固定液甲醇：冰醋酸(3：1)混合液，現(xiàn)配先用。（七）外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液的配置將兩瓶肝素40ml,每瓶加10ml小牛血清，配置成20%的小牛血瓶培養(yǎng)液，封口，放入4℃冰箱儲(chǔ)存3.2.2取血抽取健康男性的靜脈血各5ml,分別加入到3個(gè)培養(yǎng)瓶（裝有50ml20%的小牛血瓶培養(yǎng)液），血液加入培養(yǎng)液后搖勻（不能太劇烈）分裝。因此每個(gè)時(shí)期有三組。1、G0期：分裝8ml加血液的培養(yǎng)液，不加PHA，接種后立刻加入1mg/ml環(huán)磷酰胺0.2ml，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h收獲。2、在剩下的血液培養(yǎng)液中加入一支PHA（先用2ml超凈水溶解）。①、G1期：分裝10ml加血液的培養(yǎng)液，立刻加入1mg/ml環(huán)磷酰胺0.2ml在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22h收獲。②、S.G2期：分裝20ml加血液的培養(yǎng)液接種后在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h收獲。其中培養(yǎng)20h-24h后，加入1mg/ml環(huán)磷酰胺0.4ml;收獲前2.5-3h，加入1ug/ml秋水仙素1.05ml;收獲前30min，加入1mg/mlBrdu0.33ml。③、M期：分裝10ml加血液的培養(yǎng)液接種后在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)46h，加入1mg/ml環(huán)磷酰胺0.2ml，收獲前2.5-3h，加入1ug/ml秋水仙素0.53ml,收獲前30min加入1mg/mlBrdu0.17ml。3.2.31、收集培養(yǎng)物：培養(yǎng)時(shí)間滿時(shí)取出培養(yǎng)瓶，輕輕去掉瓶蓋，用帶帽滴管吸去每瓶上清液(1.0ml)，然后兩瓶平行標(biāo)本合并移入l0ml離心管內(nèi)。如培養(yǎng)物取出時(shí)已混，則兩瓶混勻后移入l0ml離心管中，與對(duì)照平衡后1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，吸去上清留底液。2、低滲：往已有2ml培養(yǎng)物離心管內(nèi)加入0.5％KCl溶液8ml，混合后放37oC保溫低滲10分鐘。3、預(yù)固定：低滲后加固定液0.5ml，混勻后1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，用滴管去掉上清(要盡量把上清去凈，但不能丟失沉淀物)。4、固定：將沉淀物輕輕混勻后，沿離心管壁加入固定液并迅速輕輕與沉淀物混合，有塊狀物要打散，然后加固定液至3～4ml，蓋上蓋，放37℃保溫固定15分鐘。固定后以1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，取出后去上消(要盡量把上清去凈，但不能丟失沉淀物)，如此反復(fù)再固定2次。5、制片：第三次固定后去上清，留沉淀物0.2～0.4ml，混勻后用滴管吸取分別滴在己預(yù)冷的玻片左右各三分之一處，輕輕吹散，然后通過(guò)火焰固定，即為未染色標(biāo)本，備用。3.2.4本試驗(yàn)采取Giemsa染色，待骨髓片自然晾干之后，用新鮮配制的PH7.4的磷酸鹽緩沖液的10%的Giemsa染液染色10~15min，染色完畢后用蒸餾水沖洗，自然晾干即可。3.2.5先以低倍鏡，選擇細(xì)胞分布均勻、疏密適度、形態(tài)完整、染色良好的區(qū)域，然后再在高倍鏡下對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行拍照。4結(jié)果與討論4.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1.1環(huán)磷酰胺（誘導(dǎo)微核照片micronucleusmicronucleusmicronucleusmicronucleus圖4-6Go期hp（1）100ⅹ10圖4-7Go期hp（2）100ⅹ10micronucleusmicronucleus圖4-1G1期hp（1）100ⅹ10圖4-2G1期hp（2）100ⅹ10

micronucleusmicronucleusmicronucleusmicronuclesus圖4-3微核增值期hp（1）100ⅹ10圖4-4S期hp（2）100ⅹ10micronucleusmicronuclesusmicronucleus

圖4-5G2期hp100ⅹmicronucleusmicronucleusmicronucleus圖4-8M期hp（1）100ⅹ10圖4-9M期hp（2）100ⅹ10micronucleusmicronucleus4.1.2微核計(jì)數(shù)4.1.3淋巴細(xì)胞細(xì)胞周期各時(shí)期的微核率4.2結(jié)果與分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:①細(xì)胞周期各階段均可有不同程度的微核形成,其中最多的是G1期,其次是G2期，其他各時(shí)期均可能形成較少量的微核。②S期細(xì)胞的微核率較G1期有極顯著的下降,這提示大部分G1期的微核細(xì)胞不能進(jìn)人S期,使細(xì)胞增殖中止,這可能是抗癌藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制之一。③圖4-8M期微核照片一定程度上證明了微核起源于落后染色體與喪失著絲粒的斷片。結(jié)論與心得5.1結(jié)論細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)期均可形成微核,其中微核最多的時(shí)期是G1期,其次是G2期。S期細(xì)胞的微核率較G1期有極顯著的下降,這表明大部分G1期的微核細(xì)胞不能進(jìn)人S期,使細(xì)胞增殖中止，這為預(yù)防治療癌癥腫瘤有很深遠(yuǎn)的意義。5.2心得5.2.1在制片的過(guò)程中，要將玻片事先放入冰箱，準(zhǔn)備好冰片。制片以滴片的方式進(jìn)行，使用冰片是因?yàn)楸男Ч糜谄胀úＦ?.2.1.2本試驗(yàn)采取Giemsa染色，在染色時(shí)應(yīng)注意將染色液覆蓋滿整個(gè)玻片，使得染色過(guò)程進(jìn)行得更為充分。同時(shí)也要在玻片下面墊上紙片，以免Giemsa染液對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)造成污染。染色時(shí)間應(yīng)該不低于15分鐘，用蒸餾水沖洗染液時(shí)，應(yīng)該讓蒸餾水以細(xì)小的水流均勻的從玻片一端沖下，并且不能讓水流直接接觸被染色的細(xì)胞，以免將細(xì)胞沖走。5.2.2尚存在的問(wèn)題經(jīng)過(guò)了資料查找與總結(jié)，方案的提出與修改，以及實(shí)驗(yàn)這幾個(gè)階段，最終得出了一些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，但是在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了許多的問(wèn)題和大量有待于改進(jìn)的地方。5.2.2.1染色方法的使用進(jìn)行微核試驗(yàn)時(shí)，一般會(huì)選擇Giemsa染色，feulgen染色以及吖啶橙熒光染色這三種染色方法。本試驗(yàn)中采取的是簡(jiǎn)單，易操作的Giemsa染色，雖然這種方法尤其突出的優(yōu)勢(shì)，但是也存在一些不足。一般來(lái)說(shuō)，這種染色不能分辨細(xì)胞中的DNA、RNA以及其他的嗜堿性顆粒，因此容易產(chǎn)生假陽(yáng)性現(xiàn)象，高估嗜多染紅細(xì)胞中微核產(chǎn)生的水平。由于試驗(yàn)時(shí)間，實(shí)驗(yàn)室條件等因素的限制，本試驗(yàn)只采取了一種染色方法。希望在以后的試驗(yàn)中，能夠采取幾種不同染色的方法同時(shí)進(jìn)行觀察。例如可以將Giemsa染色和吖啶橙熒光染色分別運(yùn)用到同一試驗(yàn)中，以便更準(zhǔn)確的觀察試驗(yàn)結(jié)果。5.2.2.3探究微核試驗(yàn)中染色體損傷的機(jī)制本試驗(yàn)屬于傳統(tǒng)的微核試驗(yàn)，只能觀察化學(xué)毒性物質(zhì)對(duì)于淋巴細(xì)胞的遺傳毒性作用，無(wú)法鑒別毒性藥物是屬于非整倍體劑還是染色體斷裂劑。如果將免疫熒光技術(shù)引入這項(xiàng)傳統(tǒng)的微核試驗(yàn)之中，突顯出染色體的著絲粒部分，則可以通過(guò)鑒別細(xì)胞中的微核是由染色體斷片還是含著絲粒的染色體片段或一條甚至多條染色體組成，來(lái)鑒別化學(xué)毒性物質(zhì)的種類。希望在今后的試驗(yàn)中引入熒光免疫技術(shù)，確定遺傳毒性物質(zhì)的種類以及染色體受損傷的最主要的原因和機(jī)制。致謝感謝我畢業(yè)設(shè)計(jì)的導(dǎo)師李奇志老師，感謝她給了我在試驗(yàn)教學(xué)中心進(jìn)行畢業(yè)設(shè)計(jì)的機(jī)會(huì)。在選題確定之后，無(wú)論是從早期資料收集，文獻(xiàn)查閱，進(jìn)行開(kāi)題報(bào)告，還是正式試驗(yàn)階段，李老師都給予了悉心的指導(dǎo)。除了在整個(gè)畢業(yè)設(shè)計(jì)階段對(duì)我的畢業(yè)設(shè)計(jì)工作的巨大幫助外，李老師還在生活中的方方面面給予我不少關(guān)懷。畢業(yè)設(shè)計(jì)的過(guò)程中，在李老師的帶領(lǐng)下，我學(xué)到關(guān)于實(shí)驗(yàn)的新知識(shí)，動(dòng)手能力顯著增強(qiáng)，從中受益匪淺，對(duì)自己接下來(lái)的研究生之路更有信心。在此，我要向李老師表示誠(chéng)摯的感謝。感謝實(shí)驗(yàn)室的馮老師，云老師，周老師等老師和工作人員，在我畢業(yè)設(shè)計(jì)期間對(duì)我給予的各種幫助。感謝和我在同一實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行畢業(yè)設(shè)計(jì)的劉國(guó)華同學(xué)在我實(shí)驗(yàn)期間給予我的關(guān)心與幫助。感謝與我同住一個(gè)寢室的王勇同學(xué)和劉毅同學(xué)，你們?cè)谖业恼麄€(gè)畢業(yè)設(shè)計(jì)階段給予我了許多關(guān)心，謝謝你們的熱心幫助。感謝生物技術(shù)專業(yè)的王珂同學(xué)，周瑜同學(xué)，以及劉菲同學(xué)，謝謝你們對(duì)我的無(wú)私幫助。感謝我的父母，感謝你們對(duì)我的關(guān)愛(ài)，對(duì)我學(xué)習(xí)以及生活方面巨大的關(guān)懷與支持。值此論文完成之際，我衷心感謝在學(xué)習(xí)、畢設(shè)期間所有熱心幫助過(guò)我的人們謝謝大家！附錄附－1實(shí)驗(yàn)藥品藥品名稱性質(zhì)化學(xué)式來(lái)源甲醇分析純CH3OH國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司冰醋酸分析純CH3COOH武漢市洪山中南化工試劑有限公司環(huán)磷酰胺化學(xué)純C3H7O2中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司氯化鈉化學(xué)純NaCl中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司氯化鉀化學(xué)純KCl中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司附－2實(shí)驗(yàn)儀器儀器名稱型號(hào)來(lái)源光學(xué)顯微鏡E-100南京冀飛科技有限公司電子天平KD-BML浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司高速離心機(jī)M800江蘇金壇市億通電子有限公司參考文獻(xiàn)[1]曹佳，林真，余爭(zhēng)平．微核試驗(yàn)一原理、方法及其在人群監(jiān)測(cè)和毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[M]．北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2000：1—9．[2]HeddleJA，CiminoMC，HayashiM，eta1．Micronucleiasanindexofcytogeneticdamage：Past，PresentandFuture[J]．EnvironMoleMutagen，1991，18：277—291．[3]HeddleJA．Arapidinvivotestforchromosomaldamage[J]．MutatRes，1973，18：l87一l90．[4]SchmidW．Themicronucleustest[J]．MutatRes，1975，31：9—15．[5]歐洲經(jīng)合組織化學(xué)物質(zhì)毒性實(shí)驗(yàn)指南．哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)(1995)，見(jiàn)：曹佳主編．微核試驗(yàn)[M]．北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2000，264—272．[6]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政局．新藥(西藥)臨床研究指導(dǎo)原則匯編(毒理學(xué))[M]．1993：216—217．[7]AngelaE，eta1．Mutagenicitytestschemesandguidelines：U．S．EPAofficeofpollutionpreventionandtoxicsandofficeofpesticideprograms[J]．EnvironMoleMutagen，1993，21(1)：38—45．[8]SofuniT．Japaneseguidelinesformutagenicitytesting[J]．EnvironMoleMutagen，1993，21(1)：2—7．[9]FenechM．Theadvantangesanddisadvantangesofthecytokinesisblockmicronucleusmethod[J]．MutatRes，1997，392(1～2)：11—18．[10]楊明杰，曹佳．微核實(shí)驗(yàn)的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]．癌變·畸變·突變，2000，12(4)：237—241．[11]王爽，諸葛堅(jiān)，余應(yīng)年．微核與微核試驗(yàn)在遺傳毒理學(xué)中的應(yīng)用[J]．癌變·畸變·突變，2000，12(4)：253-256．[12]劉勝學(xué)，曹佳，楊錄軍，等．7一射線誘發(fā)人淋巴細(xì)胞微核形成與細(xì)胞周期關(guān)系的初步研究[J]．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，17(5)：378—381．[13]曹佳，劉勝學(xué)，程天民，等．射線誘發(fā)微核的超微結(jié)構(gòu)電鏡觀察[J]．衛(wèi)生毒理學(xué)雜志，1998，12(1)：338—340．[14]YangMJ，CaoJ．ChromosomalcompositionofmicronucleiinmouseNIH3T3cellstreatedwithacrylamidde，extractoftripterygiumhypoglaucum(1eve1)hutch。mitomycinCandcolchicine，detectedbymulticolorFISHwithcentrometricandtelomericDNAprobes[J]．Mutagenesis，2001，16(2)：112—116．[15]