發(fā)酵過程控制

第四節(jié)發(fā)酵過程泡沫形成與控制一、泡沫形成及對發(fā)酵影響普通來說，泡沫是氣體在液體中粗分散體，屬于氣液非均相體系。美國道康寧企業(yè)對泡沫這么定義：體積密度靠近氣體，而不靠近液體“氣/液”分散體。發(fā)酵過程起泡，有利于增加氣液接觸面積，但過多泡沫是有害。1.泡沫定義/4/211發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第1頁2.泡沫產生及其影響在微生物深層培養(yǎng)過程中，因為通氣、攪拌、代謝氣體逸出，以及培養(yǎng)基中糖、蛋白質、代謝物等穩(wěn)定泡沫表面活性物質存在（玉米漿、蛋白陳、花生餅粉、黃豆餅粉、酵母粉、糖蜜等是主要發(fā)泡原因），使發(fā)酵液中產生一定數量泡沫，這是正?，F象。

不過大量泡沫出現，會引發(fā)一些無須要副作用：降低了發(fā)酵罐裝料系數；

增加了菌群非均一性，影響了菌群整體效應；增加了污染雜菌機會；“跑液”造成產物損失；消沫劑加入將給提取工序帶來困難。/4/212發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第2頁3.發(fā)酵過程中泡沫改變規(guī)律發(fā)酵早期，泡沫穩(wěn)定性高，這與高表觀黏度和低表面張力相關；伴隨菌體對碳、氮源利用，造成泡沫穩(wěn)定蛋白質分解，培養(yǎng)液黏度降低，促進表面張力上升，泡沫降低。在發(fā)酵后期菌體自溶，可溶性蛋白質濃度增加，又促使泡沫上升。

/4/213發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第3頁4.泡沫形成原因氣液接觸：產生泡沫首要條件是氣體和液體發(fā)生接觸。助泡劑存在：在未加助泡劑水中產生泡沫，其壽命在0.5秒之內。在純凈氣體、純凈液體之外，必須存在第三種物質，才能產生氣泡。對純凈液體來說，這第三種物質是助泡劑。助泡劑使與液體親和性弱一端朝著氣泡內部，與液體親和性強一端伸向液相，這么定向吸附層起到穩(wěn)定泡沫作用。起泡速度高于破泡速度：體系起泡程度是起泡難易和泡沫穩(wěn)定性兩個原因綜合效果。泡沫產生速度小于破滅速度，則泡沫不停降低，最終呈不起泡狀態(tài)；泡沫產生速度等于破滅速度，則泡沫數量將維持在某一平衡狀態(tài)；泡沫產生速度高于破滅速度，泡沫量將不停增加。/4/214發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第4頁5.發(fā)酵過程泡沫產生原因通氣、攪拌程度：通氣大、攪拌強烈可使泡沫增多，所以在發(fā)酵前期因為培養(yǎng)基營養(yǎng)成份消耗少，培養(yǎng)基成份豐富，易起泡。通氣量應先小，逐步加大；攪拌轉速也如此。培養(yǎng)基配比與原料組成：培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，黏度大，產生泡沫多而持久，前期難開攪拌。例，在50L罐中投料10L，成份為淀粉水解糖、豆餅水解液、玉米漿等，攪拌900rpm，通氣，泡沫生成量為培養(yǎng)基2倍。菌種、種子質量和接種量：菌種質量好，生長速度快，可溶性氮源較快被利用，泡沫產生幾率就少。若菌種生長慢，能夠加大接種量。滅菌質量：培養(yǎng)基滅菌質量不好，糖、氮被破壞，抑制微生物生長，使種子菌絲自溶，產生大量泡沫。/4/215發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第5頁6.起泡危害降低生產能力：在發(fā)酵罐中，為了容納泡沫，預防溢出而降低罐裝載量。引發(fā)原料浪費：假如設備裝液后余留容積不足以容納產生泡沫，氣泡會引發(fā)原料流失，造成浪費。影響菌呼吸：假如氣泡穩(wěn)定，不易碎，那么伴隨微生物呼吸，氣泡中充滿二氧化碳，而又不能與空氣中氧進行交換，影響菌呼吸。引發(fā)染菌：因為泡沫增多而引發(fā)逃液，于是在排氣管中粘上培養(yǎng)基，就會長菌。伴隨時間延長，雜菌會長入發(fā)酵罐而造成染菌。/4/216發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第6頁二、泡沫控制方法機械消泡化學消泡在攪拌軸上方安裝消泡漿，借旋風離心場而消泡。優(yōu)點：不需要引進外界物質如消沫劑，可降低培養(yǎng)液性質復雜程度，也可節(jié)約原材料，降低污染機會。缺點：不能從根本上消除泡沫穩(wěn)定原因；消泡效果不如消泡劑快速可靠；需要一定設備并消耗一定動力。利用消泡劑降低液膜機械強度或降低液膜表面粘度進行消泡。作用：一是破泡，二是抑泡。優(yōu)點：消泡效果好、作用快，尤其是合成消泡劑效率高、用量少。缺點：消泡劑選擇不妥會影響菌體生長或代謝；操作上會增加染菌機會；添加過量會影響氧傳遞。

/4/217發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第7頁三、消泡劑1.消泡劑作用機理泡沫原來是極不穩(wěn)定，只因助泡劑穩(wěn)泡作用才難以破滅。/4/218發(fā)酵過程控制羅氏假說1941年哈金斯（HarkinssW.D）提出，以鋪展系數S值正負判斷消泡劑能否在泡沫上擴展。1948年魯賓遜（Robinson,J.V）和伍茲（Words,W.W）提出，以浸入系數E值正負判斷消泡劑能否進入泡沫表面。美國膠體化學家羅斯（Ross,S.），四十年代初就開始研究泡沫問題。羅斯提出一個假說：在溶液中，溶解狀態(tài)溶質是穩(wěn)泡劑。當加入不溶狀態(tài)溶質浸入系數與鋪展系數均為正值時即是消泡劑。這種假說為解釋消泡劑作用機理奠定了基礎。發(fā)酵過程控制第8頁與穩(wěn)泡原因相關幾個消泡機理a.消泡劑可使泡沫液局部表面張力降低，因而造成泡沫破滅；b.消泡劑能破壞膜彈性而造成氣泡破滅；C.消泡劑能促使液膜排液，因而造成氣泡破滅。/4/219發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第9頁2.破泡劑與抑泡劑區(qū)分消泡劑可分為破泡劑和抑泡劑破泡劑：加到已形成泡沫中，使泡沫破滅添加劑。如低級醇、天然油脂。這類消泡劑伴隨時間延續(xù)，效率快速降低。抑泡劑：發(fā)泡前預先添加而阻止發(fā)泡添加劑。聚醚及有機硅等屬于抑泡劑。普通是分子與泡液親和性很弱難溶或不溶液體。/4/2110發(fā)酵過程控制溶解度大破泡劑，消泡作用只發(fā)揮一次；溶解度小破泡劑，消泡作用可連續(xù)一段時間；假如破泡劑溶解度深入降低，即成為抑泡劑。破泡劑與抑泡劑相互關系發(fā)酵過程控制第10頁3.對消泡劑要求在起泡液中不溶或難溶：不溶或難溶，才易于聚集在氣液界面，易于濃縮在泡膜上，才能在較低濃度下發(fā)揮作用。用于水體系消泡劑，須為強疏水弱親水。表面張力低于起泡液：表面張力低于起泡液，消泡劑微粒才能在泡膜上浸入及擴展。與起泡液有一定程度親和性：由于消泡過程實際上是泡沫瓦解速度與泡沫生成速度競爭，所以消泡劑必須能在起泡液中快速分散，以便迅速在起泡液中較廣泛范圍內發(fā)揮作用。要使消泡劑擴散較快，消泡劑活性成分須與起泡液具有一定程度親和性。消泡劑活性成分與起泡液過親，會溶解；過疏又難于分散。只有親疏適宜，效力才會好。與起泡液不發(fā)生化學反應：若消泡劑與起泡液發(fā)生反應，一方面消泡劑會喪失作用，其次可能產生有害物質，影響微生物生長。揮發(fā)性小，作用時間長。/4/2111發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第11頁4.慣用消泡劑種類和性能天然油脂天然油脂是最早用消泡劑，它起源輕易，價格低，使用簡單，普通來說沒有顯著副作用。種類：豆油、菜油、魚油等。但若保藏不好，油脂易變質，使酸值增高，對發(fā)酵有毒性。另外，有些油是發(fā)酵產物前體，如豆油是紅霉素前體，魚油是螺旋霉素前體。近年來出于對環(huán)境保護重視，天然產物消泡劑地位有所提升，而且還在研究新天然消泡劑。/4/2112發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第12頁酒糟榨出液：羅伯茨在啤酒試驗時發(fā)覺：全麥芽浸出漿桶中最終倒出沉積物能破滅泡沫。于是聯想到，是否能夠由制作全麥芽浸出漿以后酒糟壓榨出有效消泡劑？經過試驗，由酒糟中壓榨出大約40%液體，在50℃真空蒸餾，濃縮19倍，果然得到可用于麥芽汁發(fā)酵過程消泡劑。效果很好，沒有副作用。經分析證實，酒糟榨出液中存在C8~C18全部脂肪酸，存在極性類脂物，尤其是卵磷脂等物質，這些物質相互協(xié)同消泡作用比這些物質單獨消泡作用強得多。啤酒花油：研究發(fā)覺向啤酒中添加1~5ppm啤酒花油，能夠有效減輕氣泡溢出造成損失。經分析，啤酒花油含有具消泡活性物質：石竹烯、荷蘭芹萜烯、香葉烯和蒎烯等。/4/2113發(fā)酵過程控制實例發(fā)酵過程控制第13頁聚醚類消泡劑聚醚類消泡劑種類很多，慣用主要是甘油三羥基聚醚。GP型消泡劑：在甘油分子上加成聚合環(huán)氧丙烷，得到聚氧丙烯甘油，稱為GP型消泡劑。用于鏈霉素發(fā)酵，代替天然油脂，加入基礎料中，效果很好。GPE型消泡劑（泡敵）：在GP型消泡劑聚丙二醇鏈節(jié)末端再加成環(huán)氧乙烷，成為鏈端是親水基聚氧乙烯氧丙烯甘油，稱為GPE型消泡劑（泡敵）。按照環(huán)氧乙烷加成量為10%、20%、……50%分別稱為GPE10、GPE20、……GPE50。用于四環(huán)素發(fā)酵，效果很好，消泡效果相當于豆油10~20倍。/4/2114發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第14頁特點：GP型消泡劑：親水性差，在發(fā)泡介質中溶解度小，所以宜使用在稀薄發(fā)酵液中。它抑泡能力比消泡能力優(yōu)越，適宜在基礎培養(yǎng)基中加入，以抑制整個發(fā)酵過程泡沫產生。GPE型消泡劑：親水性很好，在發(fā)泡介質中易鋪展，消泡能力強，但溶解度也較大，消泡活性維持時間短，所以用在粘稠發(fā)酵液中效果很好。有一個新聚醚類消泡劑，在GPE型消泡劑鏈端用疏水基硬脂酸酯封頭，便形成兩端是疏水鏈，中間隔有親水鏈嵌段共聚物。這種結構分子易于平臥狀聚集在氣液界面，因而表面活性強，消泡效率高。這類化合物叫GPES型消泡劑。/4/2115發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第15頁高碳醇高碳醇是強疏水弱親水線型分子，在水體系里是有效消泡劑。C7~C9醇是最有效消泡劑。C12~C22高碳醇借助適當乳化劑配制成粒度為4~9μm，含量為20~50%水乳液，也可作為水體系消泡劑。還有些醇酯，如苯乙醇油酸酯、苯乙酸月桂醇酯等在青霉素發(fā)酵中含有消泡作用，后者還可作為前體。/4/2116發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第16頁硅酮類最慣用是聚二甲基硅氧烷，也稱二甲基硅油。它表面能和表面張力低，在水及普通油中溶解度低且活性高。純粹聚二甲基硅氧烷，不經分散處理難以作為消泡劑?？赡苁且驗樗c水有高界面張力，鋪展系數低，不易分散在發(fā)泡介質上。將二甲基硅油混入SiO2氣溶膠，組成復合物作為消泡劑。方法：將疏水處理后SiO2氣溶膠混入二甲基硅油中，經一定溫度、一定時間處理即得。添加乳化劑：在硅油和SiO2氣溶膠復合物中添加一個或兩種乳化劑，加熱溶勻，與增稠劑水溶液混合后乳化，作為消泡劑。乳化劑有甘油單硬脂酸酯、Tween60、Tween80、Spen60、Spen65。增稠劑有羧甲基纖維素鈉鹽。這類消泡劑廣泛用于抗生素發(fā)酵及食品工業(yè)。/4/2117發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第17頁消泡劑總結消泡劑天然油脂

聚醚類高級醇類硅酮類玉米油、米糠油、豆油、棉子油、魚油、豬油等。消沫能力較差，使用時最好用新鮮油脂。聚氧丙烯甘油（GP）和聚氧乙烯氧丙烯甘油（GPE，又稱泡敵）用量為0.03%~0.035%。消沫能力比植物油大10倍以上。GP型消泡劑，適宜在稀薄發(fā)酵液中使用；GPE型消泡劑在粘稠發(fā)酵液中效果很好。十八醇是慣用一個，與冷榨豬油一起控制青霉素發(fā)酵泡沫，效果很好。聚二醇，消沫效果持久，尤其適合用于霉菌發(fā)酵。聚二甲基硅氧烷及其衍生物：常與分散劑(SiO2)一起使用，較適合用于微堿性放線菌和細菌發(fā)酵。羥基聚二甲基硅氧烷：含烴基親水性硅酮消泡劑，如AntifoamA。/4/2118發(fā)酵過程控制值得注意是：消泡劑有選擇性。消泡劑用多了有毒性，而且還影響通氣和氣體分散，所以要適量添加。發(fā)酵過程控制第18頁小結/4/2119發(fā)酵過程控制1.發(fā)酵過程起泡利弊（1）有利之處：氣體分散，增加氣液接觸面積；（2）有害之處：降低生產能力，引發(fā)原料浪費，影響菌呼吸，引發(fā)染菌。2.消泡劑作用機理（1）羅氏假說（2）泡沫液局部表面張力降低（3）破壞膜彈性（4）促使液膜排液3.慣用消泡劑天然油脂、聚醚類消泡劑、高碳醇、硅酮類發(fā)酵過程控制第19頁

第五節(jié)染菌防治染菌：發(fā)酵過程中除了生產菌以外，體系中存在其它微生物生長。/4/2120發(fā)酵過程控制發(fā)酵染菌率計算總染菌率：指一年發(fā)酵染菌批（次）數與總投料批（次）數之比。染菌批次數應包含染菌后培養(yǎng)基經重新滅菌，又再次染菌批次數在內。這是習慣計算方法，也是我國統(tǒng)一計算方法。

總染菌率=發(fā)酵過程控制第20頁一、染菌影響發(fā)酵過程污染雜菌，會嚴重影響生產，是發(fā)酵工業(yè)致命傷。造成大量原材料浪費，在經濟上造成巨大損失；擾亂生產秩序，破壞生產計劃；碰到連續(xù)染菌，尤其在找不到染菌原因時往往會影響人們情緒和生產主動性；影響產品外觀及質量。/4/2121發(fā)酵過程控制（一）染菌對發(fā)酵影響不一樣產品發(fā)酵生產，可污染不一樣種類和性質微生物。不一樣污染時間、不一樣污染路徑、不一樣染菌數量、不一樣培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件可產生不一樣后果。發(fā)酵過程控制第21頁1.染菌對不一樣品種發(fā)酵影響放線菌：生長最適pH為7左右，所以染細菌為多；霉菌：生長pH為5左右，所以染酵母菌為多。青霉素發(fā)酵：染菌，絕大多數雜菌都能直接產生青霉素酶，而另一些雜菌則可被青霉素誘導而產生青霉素酶。不論在發(fā)酵前期、中期或后期，污染能產生青霉素酶雜菌，會使青霉素快速破壞。鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素、卡那霉素：雖不象青霉素發(fā)酵染菌那樣一無所得，但也會造成不一樣程度危害，比如干擾生產菌正常代謝；改變pH；降低產量?；尹S霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素：抑制霉菌，但對細菌幾乎沒有抑制和殺滅作用。疫苗：現在疫苗多采取深層培養(yǎng)，這是一類不加提純而直接使用產品。在其深層培養(yǎng)過程中，一旦污染雜菌，不論死菌、活菌或內外毒素，都應全部廢棄。所以，發(fā)酵罐容積越大，污染雜菌后損失也越大。/4/2122發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第22頁2.污染不一樣種類和性質微生物影響污染噬菌體：噬菌體感染力很強，傳輸蔓延快速，也較難防治，故危害極大。污染噬菌體后，可使發(fā)酵產量大幅度下降，嚴重造成斷種，被迫停產。污染其它雜菌：有些雜菌會使生產菌自溶產生大量泡沫，即使添加消泡劑也無法控制逃液，影響發(fā)酵過程通氣攪拌。

有雜菌會使發(fā)酵液發(fā)臭、發(fā)酸，致使pH下降，使不耐酸產品破壞。尤其是染芽孢桿菌，因為芽孢耐熱，不易殺死，往往一次染菌后會重復染菌。/4/2123發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第23頁3.不一樣時間染菌對發(fā)酵影響污染時間是指用無菌檢測方法確定污染時間，不是雜菌進入培養(yǎng)液時間。雜菌進入培養(yǎng)液后，需有足夠生長、繁殖時間才能顯現出來，顯現時間與污染菌量相關。/4/2124發(fā)酵過程控制種子培養(yǎng)期染菌：生產菌一開始不占優(yōu)勢，因而防御雜菌能力低，輕易污染雜菌。假如在此階段染菌，應將培養(yǎng)液全部廢棄。發(fā)酵前期染菌：發(fā)酵前期最易染菌，且危害最大。原因是發(fā)酵前期菌量不多，與雜菌沒有競爭優(yōu)勢，抵抗雜菌能力弱。預防染菌辦法：能夠用降低培養(yǎng)溫度、調整補料量、調pH值、縮短培養(yǎng)周期等辦法給予補救。假如前期染菌，且培養(yǎng)基養(yǎng)料消耗不多，能夠重新滅菌，補加一些營養(yǎng)，重新接種再用。發(fā)酵過程控制第24頁發(fā)酵中期染菌：發(fā)酵中期染菌會嚴重干擾產生菌代謝。雜菌大量產酸，培養(yǎng)液pH下降；糖、氮消耗快，發(fā)酵液發(fā)粘，菌絲自溶，產物分泌降低或停頓，有時甚至會使已產生產物分解；有時也會使發(fā)酵液發(fā)臭，產生大量泡沫。辦法：降溫培養(yǎng)、降低補料，親密注意代謝改變情況。假如發(fā)酵單位抵達一定水平能夠提前放罐，或者在抗生素生產中能夠將高單位發(fā)酵液輸送一部分到染菌罐，抑制雜菌。發(fā)酵后期染菌：發(fā)酵后期發(fā)酵液內已積累大量產物，尤其是抗生素，對雜菌有一定抑制或殺滅能力。所以，假如染菌不多，對生產影響不大；假如染菌嚴重，破壞性較大，能夠提前放罐。/4/2125發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第25頁（二）發(fā)酵染菌對提煉和產品質量影響1.發(fā)酵染菌對過濾影響染菌發(fā)酵液普通發(fā)粘，菌體大多數自溶，所以在發(fā)酵液過濾時不能或極難形成濾餅，造成過濾困難。即使采取加熱、冷卻、添加助濾劑等辦法，使部分蛋白質凝聚，效果也不理想。污染雜菌種類對過濾影響程度有差異：污染霉菌時，影響較?。欢廴炯毦鷷r極難過濾。因為過濾困難，過濾時間拉長，影響發(fā)酵液儲罐和過濾設備周轉使用，破壞了生產平衡。染菌發(fā)酵液還會因過濾困難而大幅度降低過濾收率，直接影響提煉總收率。/4/2126發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第26頁2.發(fā)酵染菌對提煉影響染菌發(fā)酵液中含有比正常發(fā)酵液更多水溶性蛋白和其它雜質。采取有機溶劑萃取提煉工藝，則極易發(fā)生乳化，極難使水相和溶劑相分離，影響深入提純。采取離子交換樹脂提取工藝，如鏈霉素、慶大霉素，染菌后大量雜菌黏附在離子交換樹脂表面，或被離子交換樹脂吸附，大大降低離子交換樹脂交換容量，而且有雜菌極難用水沖洗潔凈，洗脫時與產物一起進入洗脫液，影響深入提純。/4/2127發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第27頁造成染菌原因很多，但總結幾十年經驗，對絕大部分染菌原因是比較清楚，但在實際生產中發(fā)酵染菌率仍比較高，能夠說產生這種現象大多數是因為工作中“明知故犯”“不負責任”和“僥幸心理”造成。比如，滅菌蒸汽壓不足不能滅菌；設備有滲漏不能進罐等都是眾所周知，但因為有僥幸心理還是照樣滅菌、進罐，結果以污染雜菌而告終。現將國內外幾家抗生素工廠發(fā)酵染菌原因歸納以下。/4/2128發(fā)酵過程控制二、染菌原因發(fā)酵過程控制第28頁日本工業(yè)技術院發(fā)酵研究所抗生素發(fā)酵染菌原因分析

項目百分率%種子帶菌或懷疑種子帶菌

9.64接種時罐壓跌零0.19培養(yǎng)基滅菌不透0.79總空氣系統(tǒng)有菌19.96泡沫冒頂

0.48夾套穿孔

12.36盤管穿孔

5.89接種管穿孔

0.39閥門滲漏

1.45攪拌軸密封滲漏

2.09罐蓋漏

1.54其它設備滲漏

10.13操作原因

10.15

原因不明

24.94/4/2129發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第29頁上海第三制藥廠染菌原因分析項目百分率%種子帶菌14.15盤管穿孔14.20閥門滲漏23.30空氣系統(tǒng)有菌10.0管理不善25.80其它7.49原因不明5.78/4/2130發(fā)酵過程控制管理不善而染菌31個罐批中，經分析有25.08％是因為以下原因所致。

項目百分率%進罐前未做設備嚴密度檢驗

25.8接種違反操作規(guī)程

25.8檢修缺乏驗收制度

19.35操作不熟練

19.35配料違反工藝規(guī)程

6.45調度不妥

3.25發(fā)酵過程控制第30頁造成染菌主要原因設備滲漏：設備滲漏包含夾套穿孔、盤管穿孔、接種管穿孔、閥門滲漏、攪拌軸滲漏、罐蓋漏和其它設備漏等。加強設備本身及從屬零部件嚴密度檢驗，對預防染菌是十分主要。空氣帶菌：國內外空氣除菌技術雖已經有較大改進，但依然沒有使染菌率降低到理想程度。因為空氣除菌系統(tǒng)較為復雜，步驟多，偶遇不慎便會造成空氣除菌失敗。種子帶菌：加強種子管理，嚴格無菌操作。種子本身帶菌是能夠克服。種子培養(yǎng)過程染菌與發(fā)酵一樣有許多原因。滅菌不徹底：環(huán)境中雜菌數量因季節(jié)而有很大差異（溫度、氣候）；原材料儲存和保管；發(fā)酵罐、培養(yǎng)基配制罐等設備清洗質量——有沒有滅菌死角。技術管理不善：技術管理就是要對發(fā)酵每個步驟嚴格控制，發(fā)酵中稍有不慎就可能染菌，所以不能有僥幸心理而放松管理。/4/2131發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第31頁三、無菌情況檢測環(huán)境無菌檢驗：塵埃粒子檢測、無菌平板檢測。種子及發(fā)酵液無菌情況檢測：酚紅肉湯培養(yǎng)基檢測、平板劃線、顯微鏡觀察。/4/2132發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第32頁四、染菌情況分析染菌原因有各種，對于實際情況怎樣分析呢？單罐染菌：不是系統(tǒng)問題，而是該罐本身問題。比如，種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底、罐有滲漏、分過濾器失效等。多罐染菌：系統(tǒng)問題，如空氣過濾系統(tǒng)有問題，尤其是總過濾器長久沒有檢驗，可能受潮失效；移種或補料分配站有滲漏或滅菌不徹底。前期染菌：種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底。中后期染菌：補料料液滅菌不徹底或補料管道、閥門滲漏，普通不會是種子問題。/4/2133發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第33頁五、染菌防治——加強生產技術管理1.預防種子帶菌制備種子時對沙土管及搖瓶嚴格加以控制。沙土制備時要屢次間歇滅菌。注意接種時無菌操作。子瓶、母瓶移種和培養(yǎng)：無菌操作。無菌室和搖床間都要保持清潔。無菌室內要供給恒溫恒濕無菌空氣，還要裝紫外燈用以滅菌，或用化學藥品滅菌。/4/2134發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第34頁無菌室要求在無菌室中裝有紫外燈，打開紫外燈，照半小時，關燈后15分鐘再接種。用消毒藥水，如新潔而滅配成1/1000濃度擦桌子、拖地，開啟超凈臺通風。接種時必須在超凈臺上操作，超凈臺裝有一臺鼓風機，進風口有一粗過濾器，出風口有高效過濾器，確保無菌風從超凈臺吹出，外界有菌空氣不可能進入接種區(qū)域，確保無菌條件。接種人員必須穿好無菌服，戴好口罩，手用酒精棉球擦潔凈。/4/2135發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第35頁2.預防設備滲漏發(fā)酵設備及附件因為腐蝕、物料與設備摩擦造成磨損以及加工制作不良等原因會造成設備及附件滲漏。設備一旦滲漏，就會造成染菌，比如冷卻盤管、夾套穿孔滲漏，有菌冷卻水便會經過漏孔進入發(fā)酵罐中造成染菌。閥門滲漏也會使帶菌空氣或水進入發(fā)酵罐而造成染菌。設備上漏隙假如肉眼能看見，輕易發(fā)覺，也輕易治理；但有微小泄漏，肉眼看不見，必須經過一定試漏方法才能發(fā)覺。/4/2136發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第36頁試漏方法水壓試漏法：在被測設備出口處裝上壓力表，將水壓入設備，待設備中壓力上升到要求壓力，關閉進出水，看壓力是否下降。壓力下降則有滲漏。但有些滲漏很小，看不出何處漏水，能夠用稀堿溶液壓入設備，然后用蘸有酚酞紗布揩試設備外壁，只要酚酞能變紅處即為滲漏處。閥門滲漏能夠用集氣桶試漏：先在集氣桶中裝滿水，然后關閉全部閥門，向發(fā)酵罐中通入空氣，使罐壓上升到要求壓力。因為集氣桶連通各管道，觀察哪根管子冒泡，就證實連通這根管子閥門漏氣。/4/2137發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第37頁3.預防培養(yǎng)基滅菌不徹底培養(yǎng)基滅菌方法——高壓蒸汽滅菌分批滅菌：121℃，30分鐘連續(xù)滅菌：罐溫125－130℃，30－45分鐘/4/2138發(fā)酵過程控制蒸汽下進上出連續(xù)滅菌設備流程發(fā)酵過程控制第38頁培養(yǎng)基滅菌前含有大量雜菌，滅菌時假如蒸汽壓力不足，就達不到要求溫度。滅菌時產生大量泡沫或發(fā)酵罐中有污垢堆積，就會窩藏大量雜菌，造成滅菌不徹底。為何蒸汽滅菌時會產生大量泡沫？（1）假如滅菌時升溫太快，培養(yǎng)基急劇膨脹，發(fā)酵罐內空氣排出較慢，就會產生大量泡沫（2）泡沫上升到發(fā)酵罐頂，泡沫中耐熱菌就不能與蒸汽直接接觸，未被殺死。（3）防治方法：遲緩開啟蒸汽閥門，或加入少許消泡劑。滅菌時還會因設備安裝或污垢堆積造成一些“死角”。蒸汽不能有效到達這些死角，常會窩藏耐熱芽孢桿菌。所以設備安裝要注意不能造成死角，發(fā)酵設備要經常清洗，鏟除污垢。/4/2139發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第39頁4.預防空氣引發(fā)染菌空氣過濾除菌設備流程空壓機儲罐二級冷卻加熱器空氣過濾粗過濾/4/2140發(fā)酵過程控制空氣冷卻器列管穿孔泄露，冷卻水會滲透到空氣中，造成染菌。棉花-活性炭過濾器長久使用后，棉花和活性炭體積被壓縮而松動，造成過濾器失效。過濾器用蒸汽滅菌時，若被蒸汽冷凝水潤濕就會降低或喪失過濾效能，滅菌完成應馬上遲緩通入壓縮空氣，將水分吹干。超細纖維紙作過濾介質，滅菌時必須將管道中冷凝水放干，以免介質受潮失效。在生產實踐中，空氣管道大多與其它物料管道相接，要安裝止逆閥，以預防其它物料竄入空氣管道污染過濾器，造成過濾介質失效。止逆閥發(fā)酵過程控制第40頁5.發(fā)酵染菌后辦法染菌后培養(yǎng)基必須滅菌后才可排放到下水道。不然，因為各罐管道相通，會造成其它罐染菌，而且直接排放下水道也會造成空氣污染而造成其它罐批染菌。滅菌方法：可通蒸汽滅菌；也可加入過氧乙酸等化學滅菌劑。凡染菌罐要查找染菌原因：對癥下藥，該罐也要徹底清洗，進行空罐消毒，才可繼續(xù)使用。染菌厲害時，車間環(huán)境要用石灰消毒，空氣用甲醛熏蒸。若發(fā)生噬菌體染菌，空氣必須用甲醛蒸汽消毒。/4/2141發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制第41頁六、噬菌體污染防治1.噬菌體污染對發(fā)酵影響發(fā)酵過程中假如受噬菌體侵染，普通發(fā)生溶菌，隨之出現發(fā)酵遲緩或停頓。而且受噬菌體感染后，往往會重復連續(xù)感染，使生產無法進行，甚至使種子全部喪失。/4/2142發(fā)酵過程控制噬菌體污染表現：鏡檢可發(fā)覺菌體數量顯著降低，菌體不規(guī)則，嚴重時完全看不到菌體，且在短時間內菌體自溶：發(fā)酵液稀薄，發(fā)酵液DO回升。發(fā)酵pH值逐步上升，4~8小時之內可達8.0以上，不再下降。發(fā)酵液殘?zhí)歉?，有刺激性臭味，粘度大，泡沫多。?/p>