實(shí)驗(yàn)一MS培養(yǎng)基的配制和滅菌

試驗(yàn)一MS培養(yǎng)基配制和滅菌實(shí)驗(yàn)一MS培養(yǎng)基的配制和滅菌第1頁一、試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)：學(xué)習(xí)、掌握植物組織固體培養(yǎng)基配制和滅菌方法。二、試驗(yàn)步驟：稱量→混合→調(diào)pH值→滅菌實(shí)驗(yàn)一MS培養(yǎng)基的配制和滅菌第2頁稱量：按每瓶培養(yǎng)基終體積50mL計(jì)，稱取適量瓊脂粉（6g/L）和蔗糖（30g/L），置于2L大燒杯中，加蒸餾水至需配培養(yǎng)基終體積3/4左右，加熱使之溶解?；旌希悍謩e加入一定量貯備液I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和生長調(diào)整物質(zhì)及其它特殊補(bǔ)加物，再加蒸餾水直至需配培養(yǎng)基終體積。調(diào)pH值：充分混合后，0.1mol/LNaOH調(diào)整培養(yǎng)基pH值至5.8。滅菌：封嚴(yán)培養(yǎng)容器口后，120℃滅菌20min后，將培養(yǎng)基取出，置于水平臺(tái)子上，在室溫下冷卻，備用。實(shí)驗(yàn)一MS培養(yǎng)基的配制和滅菌第3頁試驗(yàn)三外植體材料預(yù)處理、消毒及接種實(shí)驗(yàn)一MS培養(yǎng)基的配制和滅菌第4頁一、試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)：熟悉外植體材料預(yù)處理，掌握其消毒和接種方法。二、方法步驟：預(yù)處理

→酒精消毒→消毒劑消毒實(shí)驗(yàn)一MS培養(yǎng)基的配制和滅菌第5頁（一）對(duì)采來植物材料進(jìn)行適當(dāng)預(yù)處理。除去不需要部分，將所需部分切割至適當(dāng)大小，置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至幾小時(shí)，主要視植物材料清潔程度而定。這在污染嚴(yán)重時(shí)尤其有用。（二）用洗衣粉水（1~2角匙洗衣粉/100ml水）等浸洗上述植物材料約5min，再用自來水沖凈洗衣粉水。這是深入降低污染處理。同時(shí)配制消毒液：50%次氯酸鈉溶液。實(shí)驗(yàn)一MS培養(yǎng)基的配制和滅菌第6頁（三）

將接種用具、無菌水等從80℃烘箱中或直接從高壓滅菌器中取出，置于超凈工作臺(tái)上。打開超凈工作臺(tái)中紫外燈，在進(jìn)行紫外線滅菌處理最少30min后關(guān)掉紫外燈。（四）

操作人員洗手擦干，換上潔凈工作服，戴上帽子以免頭發(fā)散落以及帶來污染。坐到超凈臺(tái)前，并將裝有經(jīng)濕熱滅菌培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶、配好消毒液、洗凈瀝干植物材料置于超凈工作臺(tái)上，用70%酒精棉球擦手與器具外壁，即可對(duì)經(jīng)上述預(yù)處理植物材料進(jìn)行表面滅菌處理，自此以后各步均須在超凈工作臺(tái)上操作。實(shí)驗(yàn)一MS培養(yǎng)基的配制和滅菌第7頁（五）詳細(xì)首先將經(jīng)上述預(yù)處理、瀝干水植物材料放入廣口瓶或燒杯，向其中倒入新鮮配制、濃度一定而且加有一定量（通常為滅菌劑消毒液0.5%，或每100mL消毒液滴加10~15滴）Tween-80（土溫-80）等表面活性劑消毒液適量（液面高度超出植物材料最少0.5cm），開始計(jì)算滅菌時(shí)間。也可在使用上述滅菌劑之前，先將植物材料浸于70%乙醇滅菌10~30秒。

實(shí)驗(yàn)一MS培養(yǎng)基的配制和滅菌第8頁（六）在連續(xù)滅菌時(shí)間內(nèi)定時(shí)用玻璃棒輕輕攪動(dòng)，以促進(jìn)植物材料各部分與消毒液充分接觸，驅(qū)除氣泡，使滅菌徹底。在滅菌時(shí)間結(jié)束前1min時(shí)，即可開始用玻璃棒等輕輕壓住植物材料將消毒液慢慢倒入廢物缸，注意勿使植物材料滑出。接著馬上倒入適量無菌水，輕攪植物材料以清洗去除滅菌劑殘留。普通表面滅菌時(shí)間計(jì)算是從倒入消毒液開始，到倒入無菌水為止。無菌水清洗時(shí)間每次約3min；清洗5次。

實(shí)驗(yàn)一MS培養(yǎng)基的配制和滅菌第9頁（七）倒出、瀝去最終一次清洗用水，開始進(jìn)行植物材料切割及接種。逐一取出經(jīng)上述滅菌處理植物材料，置于下面墊有經(jīng)滅菌處理培養(yǎng)皿（或小白瓷碟）無菌紗布或?yàn)V紙上，左手拿小鑷子，右手拿解剖刀，切除各切段或切塊上被滅菌劑毒壞部分。如有必要，也可再行切分。在完成切割后，將解剖刀和小鑷子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精燈焰上灼燒滅菌之后放回原處，方便待冷卻后下一切割再用。

實(shí)驗(yàn)一MS培養(yǎng)基的配制和滅菌第10頁（八）接著，左手拿培養(yǎng)瓶，將培養(yǎng)容器口外壁在靠近酒精燈外焰處轉(zhuǎn)燎數(shù)秒，以將其可能帶有微生物等固定于原處；在酒精燈焰附近處，用右手拇指與食指配合將瓶塞打開，并將其夾于左手無名指與最小指之間；再將培養(yǎng)瓶口在酒精燈焰上輕轉(zhuǎn)灼燒滅菌；以右手拇指與食指配合，用大鑷子夾緊一外植體準(zhǔn)確送入培養(yǎng)容器，并將其輕輕地半插入固體培養(yǎng)基；將大鑷子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精燈焰上灼燒滅菌之后放回原處，方便待冷卻后下一操作再用；將培養(yǎng)瓶口及瓶塞分別在酒精燈焰上小心地輕轉(zhuǎn)灼燎數(shù)秒；蓋好瓶塞，旋緊，將其置于超凈工作臺(tái)適當(dāng)位置。

實(shí)驗(yàn)一MS培養(yǎng)基的配制和滅菌第11頁（九）

在完成了該第一只培養(yǎng)容器外植體接種操作后，用70%乙醇對(duì)超凈工作臺(tái)臺(tái)面進(jìn)行擦