中文銀納米簇檢測尿酸

基于銀納米簇?zé)晒忖绶z測尿酸摘要以DNA為模板的銀納米團(tuán)簇作為熒光探針，利用熒光“tumofT超靈敏檢測生物底物尿酸。在這里，我們利用簡單易行、無毒無害的方法合成熒光強(qiáng)度高且穩(wěn)定性好的水溶性C-AgNCs,其平均粒徑約為2.5nm,且在565nm處有穩(wěn)定的熒光發(fā)射。檢測機(jī)理為，尿酸在尿酸氧化酶的催化作用下，被溶解在溶液中的氧氣所氧化，可產(chǎn)生過氧化氫，利用過氧化氫對C-AgNCs的猝滅作用，從而間接測定尿酸的含量。實驗結(jié)果表明，該C?AgNCs在565nm左右有很強(qiáng)的熒光發(fā)射且熒光穩(wěn)定性好。在最優(yōu)實驗條件下，尿酸濃度在0.05700IIM范圍內(nèi)時，體系熒光強(qiáng)度與尿酸濃度的對數(shù)之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其最低檢測濃度為50nM。該方法靈敏度高，選擇性好，線性范圍寬，檢測限低，并可被用于復(fù)雜環(huán)境中尿酸的測定。由此，該方法不但有希望廣泛應(yīng)用于有過氧化氫產(chǎn)生的氧化還原反應(yīng)底物的檢測；而且，由于該納米傳感器穩(wěn)定的熒光發(fā)射及良好的生物相容性，如若對其進(jìn)一步修飾，將有助于其在體內(nèi)體外分析中得到廣泛應(yīng)用。關(guān)鍵字：C-AgNCs：為。2檢測：尿酸檢測；銀納米簇猝滅Poly(cytosine)-tempiatedsilvernanoclusters(C-AgNCs)asafluorescentprobe,wereusedtopresentafluorescenceturn-offassayforbiologicalsubstrates,whichweremoreamenabletoultrasensitiveassayofuricacid.Here,byasimpleandnontoxicmethod,thewatersolubleC-AgNCsweresynthesizedwithanaveragesizeof2.5nmandastableemissionat565nm.Thesensingmechanismwasmainlybasedonthenotion,thatwas,theoxidationofuricacidstimulatedbyuricaseandcoupledwiththeformationofH2O2,bywhicheffectivefluorescencequenchingofC-AgNCs.Underoptimizedconditions,detectionofuricacidhasalinearconcentrationrangeof0.05towithadetectableminimumconcentrationof0.051iMTherefore,C-AgNCsasfluorescentprobecandetectsubstratesbasedonH^O7-generatingredoxreactionandisfurthermodifiedforanalyticalapplicationsinvivoduetoitssuperioropticalpropertiesandgoodbiocompatibilityKeywords:C-AgNCs,Fluorescencequenclung;H2O2,Uneacid.尿酸Q,6,8-三羥基噪吟，UA）和其他的羥基喋吟是人體內(nèi)噪吟代謝的主要最終產(chǎn)物臼。尿酸是由黃噪吟和次黃喋嗆在黃噪吟氧化酶催化作用下轉(zhuǎn)換生成的。人體內(nèi)血清中尿酸的正常水平范圍為0.12Y）.45mM,尿排泄中約為2nlM凡體液中尿酸濃度的變化可能會導(dǎo)致許多疾病和病理障礙包括痛風(fēng)⑶、關(guān)節(jié)炎［4】、腎臟疾病1習(xí)、心血管疾病回、神經(jīng)系統(tǒng)疾病口】、高血壓、高尿酸血癥、Lesch-Nyan綜合癥等。以子癇前期為例，子癇前期是一種發(fā)生在懷孕期間的高血壓疾病，是孕產(chǎn)婦死亡的主要原因同。目前全球大約10-15%的孕產(chǎn)婦死于子癇前期叨。如果子癇前期出現(xiàn)在懷孕的中期或晚期，那么除了早產(chǎn)嬰兒將沒有其他治療該疾病的方法。到目前為止，源于子癇前期的兩種癥狀（高血壓和尿液中蛋白質(zhì)含量高），該疾病的診斷主要是根據(jù)血壓和尿蛋白測試口叫然而，通常只有在子癇前期晚期的診斷中才使用這些測試。近年來，為了降低孕產(chǎn)婦和嬰兒死亡率，科研人員致力于發(fā)展子癇前期早期診斷的新方法05〕。研究證明,尿酸是尿液和血清樣本中一種重要的生物標(biāo)志物，可能是妊娠高血壓（子癇前期）早期測試的關(guān)鍵口3」習(xí)。血清中尿酸濃度約為0.4mM時表明病人患有輕度或中度的高血壓和蛋白尿，尿酸的濃度大于0.4mM時病人患有重度子癇前期口可。因此，尿酸水平是診斷和治療這些疾病的一個重要的分子標(biāo)志物，尤其在檢驗科能夠擁有一套簡單可靠的方法用于定期檢測尿酸是非常必需的。目前，各種技術(shù)被應(yīng)用于生物環(huán)境中尿素的檢測，包括電化學(xué)方法07-功,化學(xué)發(fā)光法"241,熒光法必］，色譜分析法［26-28］,等。在這些方法中，化學(xué)發(fā)光法易受顏色干擾；色譜法操作麻煩、費(fèi)時耗力；電化學(xué)方法因其高靈敏度,低成本，快速的響應(yīng),兼容性小型化，低人力需求，兼容精密加工技術(shù)等優(yōu)點而得到極大的關(guān)注。各種電化學(xué)方法如聚合物修飾電極［29叫,化學(xué)修飾電極［32-33］,酶修飾電極［34］,和電化學(xué)預(yù)處理口習(xí)均可被用來檢測UA。然而，監(jiān)測尿酸的主要障礙是其他電話性成分的干擾，如抗壞血酸（AA）,其氧化電勢在各種電極上均與尿酸一樣。此外，修飾電極經(jīng)常存在吸附、污染等干擾。因此，建立一種靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)，簡單靈便的方法，是尿酸檢測的當(dāng)務(wù)之急。為了檢測尿酸含量，尿酸傳感器得到廣泛研究，尤其是在納米技術(shù)領(lǐng)域。貴金屬（如Au,Ag,Pt）納米簇由于其獨(dú)特的物理和光學(xué)性質(zhì)常常被用來構(gòu)建生物傳感器。金屬納米簇?fù)碛泻芏鄡?yōu)點，例如合成簡單方便，亞納米尺寸，光穩(wěn)定性好，大的Stokes位移，熒光發(fā)射波長可調(diào)和低毒性等。在這些金屬納米簇中，AgNCs在熒光生物傳感器方面的應(yīng)用最為廣泛。至今，DNA,硫醇類，聚合物，多肽類，蛋白質(zhì)類等多種支撐材料被用來合成銀納米簇。其中，由于DNA單鏈中的胞喀咤與銀離子之間有強(qiáng)的親和力，這使其成為合成銀納米簇的優(yōu)越模板，并得到了大量關(guān)注。通過DNA堿基序列、鏈的長度或鏈的二級結(jié)構(gòu)的改變，就可得到熒光發(fā)射波長從紫外到近紅外范圍的C-AgNCSo據(jù)文獻(xiàn)報道，OAgNCs已經(jīng)廣泛用于金屬離子的檢測，硫醇類分子的檢測，DNA/RNA的檢測，蛋白質(zhì)的檢測，活細(xì)胞表面標(biāo)記，細(xì)胞內(nèi)染色等。鑒于此，在本文中，我們首次建立以DNA?AgNCs為熒光探針檢測尿酸含量的光學(xué)生物傳感器。我們利用硼氫化鈉為還原劑，以聚C堿基核甘酸連為模板，合成了無毒害，熒光強(qiáng)度強(qiáng)，光穩(wěn)定性好的水溶性銀納米簇?；谶^氧化氫對銀納米簇的猝滅作用，得以簡便快速地檢測尿酸。此外，該方法靈敏度高,選擇性好，檢測限低（0.0511M）,且在較寬濃度范圍內(nèi)有良好線性，并可用于復(fù)雜體系中尿酸的測定。2實驗部分化學(xué)試劑與儀器實驗中所用到的核甘酸鏈（5'-TTAACCCCCCCCCCCCTTAA-3?）,由寶生物工程（中國，大連）有限公司合成。尿酸氧化酶購自北京百靈威科技有限公司（中國，北京）。尿酸購自西格瑪奧德里奇公司（中國，上海）。硝酸銀、雙氧水、磷酸氫二鈉（Na2Hp（X?1240）、磷酸二氫鈉（NaH2P0/?240）、尿酸、葡萄糖、甘氨酸、L-組氨酸、抗壞血酸、尿素等試劑均為分析純，使用前未經(jīng)過任何處理。測定中使用的是自制的20mMPB緩沖液（pH7.0,20mMNaH2P04-Na2HP0.,）o實驗用水來自Direct-PurePlus超純水及R0純水組合型一體機(jī)純水儀，電阻率為18.2MQo實驗所用緩沖溶液和超純水均需滅菌處理。pH調(diào)節(jié)是依靠pH計(PHS-3C)來完成。反應(yīng)溫度控制通過微量恒溫器(HW-8C)實現(xiàn)。所有的熒光光譜實驗，均在FL-7000熒光光譜儀(日立，日本)上完成對樣品的熒光測量及分析；固定激發(fā)波長為490nm,在510nm至650nm范圍內(nèi)收集熒光光譜；激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5.0nm：掃描速度為1200nm/min,響應(yīng)時間2.Os,PMT電壓700V。CAgNCs的合成本實驗中C-AgNCs的合成方法如下：首先配制lOOmM的AgN6儲備液，滅菌后于4℃避光存放，使用時稀釋成所需濃度使用。DNA凍干粉先于8000rpm離心5min,再用20mMPB緩沖液5^17.0)溶解使其濃度為100^M。將0.6PlL10mMAgNG溶液和10RLlOOpM單鏈DNA模板加入至86.4piL20mMPB緩沖液(pH7.0)中，充分混勻，在避光條件下冰中孵育30min。然后迅速加入3HL2mM新制的NaBH,溶液，劇烈震蕩1min,于喑處在4c下靜置5h后，即可進(jìn)行熒光測量。DNA、硼氫化鈉、硝酸銀的最終濃度分別為10pM,60pM和60pM。過氧化氫的猝滅作用考察將30%的過氧化氫的原液用20nlMPB緩沖液稀(pH7.0)釋至3%的過氧化氫作為儲備液(置于4℃避光保存)，不同濃度的過氧化氫溶液由該儲備液稀釋得到。由于過氧化氫易分解，故需根據(jù)情況重新配制過氧化氫溶液。將50plL不同濃度的過氧化氫溶液加入到50klL上述制備好的C-AgNCs中，避光條件下于37℃溫浴30min后，進(jìn)行熒光測定。尿酸含量的檢測尿酸儲備液是濃度為4mM的水溶液，使用時先稀釋成ImM,然后再根據(jù)需要稀釋成不同濃度的尿酸溶液。尿酸氧化酶(10unit/mg)溶解在PB緩沖液(pH7.0)中配制成100|Jg/ml的尿酸氧化酶溶液，置于4c避光保存保存?zhèn)溆?。?0PlL不同濃度的尿酸溶液和50pL2.5Plg/ml的尿酸氧化酶溶液混合,在避光條件下37c中孵育20min,然后將這100pL混合液加入到100pL上述制備的銀納米團(tuán)簇溶液中，于暗處在37c下孵育30min,進(jìn)行熒光測定。復(fù)雜環(huán)境中尿酸的檢測人血液樣品是從當(dāng)?shù)蒯t(yī)院所收集到的健康自愿者血液樣品。先將血液樣品于12000rpm離心lOmin,并靜置2h以上，得到上層血清液。再用超純水將上述所得血清稀釋不同的倍數(shù)，稀釋后的血清用于后續(xù)尿酸的分析測定。其測定條件及實驗過程同上。2.3結(jié)果與討論C-AgNCs熒光傳感器原理圖3.1基于氏。2對C-AgNCs熒光的猝滅檢測尿酸的基本原理示意圖基于H2O2對C-AgNCs熒光的猝滅，我們建立了一種新的檢測尿酸含量的熒光分析方法，作用原理如圖3.1所示。根據(jù)尿酸的檢測過程一尿酸在尿酸氧化酶的催化作用下，被溶解在溶液中的氧氣所氧化，產(chǎn)生過氧化氫；過氧化氫可以有效猝滅銀納米團(tuán)簇的熒光。由此，過氧化氫作為中介物，我們能夠構(gòu)建一種尿酸生物傳感器以實現(xiàn)其定量檢測。C-AgNCs的表征

550、1550、1450EM(nm)620圖3.2.1以DNA為模板合成的AgNCs的三維熒光光譜。實驗中所用的DNA序列為(S^TTAACCCCCCCCCCCCTTAA-SOo最大激發(fā)波長為488nm,最大發(fā)射波長為556nm,熒光強(qiáng)度為1890o圖3.2.2C-AgNCs的TEM圖和粒徑分布圖通過快速簡便的方法，我們合成出高熒光強(qiáng)度的水溶性的C?AgNCs。我們對合成的C-AgNCs進(jìn)行了熒光性質(zhì)的考察，實驗結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明以該DNA分子為模板合成的銀納米簇，其熒光最大激發(fā)波長在488nm左右，最大發(fā)射波長在566nm左右，并且熒光強(qiáng)度很強(qiáng)。此外，利用透射電子顯微鏡TEM和動態(tài)光散射粒度儀DLS,我們對該DNA分子為模板合成的銀納米簇的結(jié)構(gòu)大小進(jìn)行了表征，如圖2所示，可以看出CAgNCs粒子為球形，直徑約為2.5nm,粒徑主要分布在2.5nm左右。C-AgNCs熒光探針可行性驗證oooOoO的oooOoO的O8642(?nv)AESU±UI2004006008001000ConcentrationofUA(|iM)iiii-1012ooooOoooOiiii-1012ooooOoooO8642(?n.loulsusulLog(ConcentrationofUA/|iM)圖3.6(A)不同濃度尿酸對體系熒光強(qiáng)度的影響:尿酸濃度從上到下分別為0,0.05,0.2,0.5,2.5,5,25,50,75,100,150,200,250,300,400,500,lOOOpMo(B)該傳感器對尿酸濃度的動力學(xué)響應(yīng)范I韋I。(C)為該傳感器檢測尿酸的校準(zhǔn)曲線。尿酸濃度在50PM和50、400PM范圍內(nèi)，尿酸濃度的對數(shù)與C-AgNCs熒光強(qiáng)度的線性關(guān)系。在最優(yōu)實驗條件下，我們用C-AgNCs探針測定了不同濃度尿酸對其熒光強(qiáng)度的影響。在尿酸氧化酶濃度為2.5iig/niL時，C?AgNCs的熒光強(qiáng)度隨尿酸濃度的升高而降低(如圖3.6(A,B))。圖3.6(C)顯示，尿酸濃度在0.05?5011M和50700IIM范圍內(nèi)時，熒光強(qiáng)度與尿酸濃度的對數(shù)之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其最低檢測濃度為0.05JIM,對應(yīng)的線性回歸方程分別為：F=1028.5429-166.6836logC,(R2=0.9963)(2)F=1873.8153-670.8776logC,(R2=09971)(3)式中F為體系中C-AgNCs的熒光強(qiáng)度，C為尿酸的濃度。結(jié)果證明C-AgNCs對尿酸的熒光響應(yīng)非常靈敏。與其他檢測尿酸的文獻(xiàn)報道相比(如表1所示),該方法有明顯優(yōu)勢，比較滿意。Table1.Analysisofuncacidbydifferentmethods.MethodSystemDetectionlimit(M)ReferenceEC-SERSAu/Agsubstrat1.0X10-4[37]UV-spectrophotometryTCNE5.7X106[38]ElectrochemistryDPD-Auelectrode50X1Q-7[39]ElectrochemistryCNT/NanoZnO1.48X10d[40]ElectrochemistryFc-GO1OXIO-7[41]ElectrochemistryFe304@Au-S-Fc/GS-clutosan/GCE2.0X1Q-7[42]FluorometryDNA-AgNCs5.0X10sThiswork選擇性考察圖3.7該分析方法選擇性考察。圖為C-AgNCs在尿酸和干擾物存在時的熒光強(qiáng)度，各干擾物濃度均為500處4,尿酸濃度為250處窘我們選取了抗壞血酸（維生素C）、尿素、甘氨酸、L?組氨酸等幾種血液中常見組分作為干擾物，對該方法的選擇性進(jìn)行了考察，各干擾物濃度均為5001iM,測定過程和測定條件均與測定尿酸時相同，實驗結(jié)果如圖3.7,結(jié)果表明，抗壞血酸（維生素C）、尿素、葡萄糖、甘氨酸均對銀納米簇產(chǎn)生一定的猝滅作用，L一組氨酸對銀納米簇?zé)晒猱a(chǎn)生一定的增強(qiáng)作用，但與尿酸相比，這些干擾物所引起的銀納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度的變化程度可忽略不計，由此表明該方法具有良好的選擇性。復(fù)雜體系中尿酸的檢測為了評定該方法的適用性，我們將其應(yīng)用于復(fù)雜環(huán)境中尿酸含量的分析。通過復(fù)雜體系加標(biāo)回收率的檢測實驗，我們評估了該方法的準(zhǔn)確度（數(shù)據(jù)如表2）。結(jié)果顯示，用該實驗方法所得檢測數(shù)據(jù)與已知血清稀釋液中尿酸含量十分接近。因此，我們建立的這種用于尿酸分析的生物傳感器可以用于復(fù)雜體系中尿酸含量,并具有檢測實際血液樣品中尿酸含量以及應(yīng)用于臨床血樣的可能。Table2.Thedetectionofuncacidcontentinthecomplexsystemsamplediluted(mM)Spiked(mM)found(mM)(meana±SDb)Recovery(%)Onginal(mM)11.4X10-116X101312X10J1D.05010750.1422.7X10,2.3X1025.03X1009010130.2733.5X10〃1.5X1054.96X10'±0.1009730.35[a](Meanvalueoftlireedetermination.)[b](Standarddeviation.)2.4小結(jié)在這一章中，我們利用銀納米簇簡單環(huán)保的合成方法和優(yōu)越的光學(xué)性能，構(gòu)建了一種新的檢測過氧化氫和尿酸的平分。該光學(xué)生物傳感器檢測尿酸的原理是,尿酸在尿酸氧化酶的催化作用下，被溶解在水溶液中的氧氣所氧化，可產(chǎn)生過氧化氫，過氧化氫將C-AgNCs中的銀原子氧化，銀納米簇結(jié)構(gòu)遭到破壞而失去相應(yīng)的光學(xué)性能，從而產(chǎn)生熒光猝滅的現(xiàn)象。結(jié)果表明該方法有較好的選擇性和較高的靈敏度高，并且有較寬的線性范圍核較低的檢測限，并可被用于復(fù)雜環(huán)境中尿酸的測定。由此，該方法不但有希望廣泛應(yīng)用于那些有過氧化氫產(chǎn)生的反應(yīng)底物的檢測；而且，由于該納米傳感器穩(wěn)定的熒光發(fā)射及良好的生物相容性，如若對其進(jìn)一步修飾，將有助于其在體內(nèi)體外分析中得到廣泛應(yīng)用。參考文獻(xiàn)[ljDryhurst,GElectrochemistryofBiologicalMolecules;AcademicPressNewYork,1977.Ames,R.B,;Cathcart,R.;Schwiers,E;Hochstein,P.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A1981,78,6858-6862.Chu,Q.C.;Lin,M.,Geng,CH.;Ye,INChromatographia2007,65,179-184.Wortmann,R.L.Disordersofpurinepyrimidinemetabolism.InHarnson"sPrinciplesofInternalMedicine,15thed.;Braunwald,E,Fauci,A.S.,Kasper,D.L,,Hauser,S.L.,Longo,D.L.,Jameson,J.L,Eds.;McGraw-Hill:NewYork,2001;pp2268-2273.Khosla,U.M,Zharikov,S.;Finch,JL,Nakagawa,T.;Roncal,C.;Mu,W.;Krotova,K.;Block,E.R;Prabhakar,Johnson,RJ.Kidneylilt.2005,67,1739-1742.Baker,J.F.;Knshnan,E.;Clien,L.;Schumacher,H.RAm.J.Med.2005,118,816-826.Moallem,H.J;Taiungo,G.;Jiang,C.K;Hishhorn,R.;Fikrig,S.Clin.hnmunol.2002,105,75-80.Savaj,S.;Vazin,N.D.Iran.J.KidneyDis.2012,6,334-338.(3)Carty,DM.,Delies,C.;Dominciczak,A.F,TrendsCardiovasc.Med.2008,18,186-194.Goldenberg,RL;McClure,E.M;MacGuire,E.R.,Kainath,B.D.;Jobe,A.H.Int.J.Gynecol.Obstet.2011,113,91-95.Conde-Agudelo,A.;Villar,I,Lindheimer,MObstetGynecol.2004,104,1367-1391.[ll]Lovgren,T.R;Dugofif,L.;Galan,H.L.Clin.Obstet.Gynecol.2010,53,888-898.Telang,M.A.;Bhutkar,S.P.;Hirwam,R.RPlacenta2013,34,2-8Urato,A.C.;Bond,B.;Craigo,S.D.;Norwitz,E.R.,Paulus,J.K.;Strohsmtter,W.CJ.Pennatol.2012,32,757-762.Wu,Y.;Xiong,X.;Fraser,W.D.;Luo,Z.-CAm.J.Hypertens.2012,25,711-717.Wolak,T.?Sergienko,R.;Wiznitzer,A.;Paran,E.;Sheiner,E.Hypertens.Pregnancy2012,31,307-315.Buhimschi,C.S.;Norwitz,ER.;Funai,E.;Richman,S.;Giiller,S.;Lockwood,C.J.,Buhimschi,IA.Am.J.ObstetGynecol.2005,192,734-741.Behera,S.;Raj,C.R,Biosens.Bioelectron.2007,23,556-561.Moraes,ML.;RodriguesFilho,UP.;Oliveira,O.N,Jr;Ferreira,M.J.SolidStateElectrochem.2007,11.1489-1495.Liao,C.W.;Chou,J.C;Sun,TP.;Hsiung,S.K,Hsieh,J.H,IEEETrans.Biomed.Eng.2006,53,1401-1408.Prasad,K.S.;Muthuramaii,G.?Zen,JM.ElectrochemCommun.2008,10,559-563.He,D.;Zhang,Z.;Huang,Y.;Hu,Y.;Zhou,H.;Chen,D.Luminescence2005,20,271-275.Lin,Z.;Chen,Z.;Liu,Y.;Wang,I;Chen,G.Analyst2008,133,797-801.Poole,RA.;Kielar,F.,Richardson,S.L.;Stenso,P.A.;Parker,D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