實(shí)驗(yàn)五 PCR 擴(kuò)增目的基因片段及檢測(cè)

授課教師 學(xué)生人數(shù) 課題 授課類型 授課方法 教學(xué)用具 教學(xué)目的 教學(xué)重點(diǎn) 教學(xué)難點(diǎn) 教學(xué)過程一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康??理解PCR反應(yīng)的基本原理2?掌握PCR的基本操作技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)原理DNA的變性：在適當(dāng)?shù)臈l件下，DNA分子內(nèi)堿基對(duì)之間的氫鍵斷裂，使規(guī)則有序的雙螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)椴灰?guī)則無序的單鏈線團(tuán)樣結(jié)構(gòu)的過程。DNA的復(fù)性：在適當(dāng)條件下，變性DNA的兩條互補(bǔ)鏈可再恢復(fù)成天然的雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過程稱為退火。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR），是DNA擴(kuò)增的一種方法，實(shí)驗(yàn)中很常用。包括高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)。PCR的目的是大量擴(kuò)增你所需要的片斷。換句話說，就是用人工的方法大量復(fù)制DNA。而DNA的復(fù)制是以一條鏈為模板，新合成鏈按照堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行的?？墒怯幸粋€(gè)問題，DNA的合成必須是前端有一小段序列，他接著這段序列合成，而不能從無到有，憑空合成。它前面這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。5MI 3'5MI 3'■2-A/DNA結(jié)欄■(DNAStmcturePCR反應(yīng)全過程包括3個(gè)基本步驟：1?高溫變性:在加熱的條件下（94r左右），模板DNA配對(duì)堿基間氫鍵斷裂，DNA雙鏈變成單鏈。2?退火/復(fù)性：在降溫的條件下（55乜-62?，引物與模板DNA上的目的序列片段結(jié)合，通過氫鍵配對(duì)形成雜交雙鏈，形成DNA模板—引物結(jié)合物。3?適溫延伸：在合適的溫度下（68乜-72乜），DNA模板一引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，由引物的3/端為起始點(diǎn)，從5/向3/端延伸,合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每反應(yīng)一個(gè)循環(huán)，樣本DNA片段數(shù)量增加一倍，經(jīng)30余次循環(huán)，DNA產(chǎn)物量可擴(kuò)增幾百萬倍。三、實(shí)驗(yàn)器材TC-XP型基因擴(kuò)增儀生產(chǎn)廠家：杭州博日科技有限公司產(chǎn)品型號(hào)：TC-XP(0.2mlX96管)2?離心管：0.2ml(30個(gè))3?移液槍：0.2pL、0.5pL、2pL、2.5pL四、 實(shí)驗(yàn)材料與藥品實(shí)驗(yàn)材料：上次課提取的雞血DNAPCR擴(kuò)增試劑盒(50次)包括：Buffer(10x)、Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物五、 實(shí)驗(yàn)試劑Buffer(10x)PCR的反應(yīng)buffer—般為10Xbuffer。主要作用是提供反應(yīng)的緩沖體系，維持反應(yīng)的穩(wěn)定，給TaqDNA聚合酶提供一個(gè)最適酶催反應(yīng)條件。組成：Tris-HCl(pH8.3)，KCl有利于引物與模板的退火。MgCl(25mM)2作用：TaqDNA聚合酶活性所必需的，提供離子濃度。通常Mg2+濃度范圍為l-5mM。Mg2+可促進(jìn)Taq酶活性影響反應(yīng)產(chǎn)量，但濃度過高會(huì)增加非特異性擴(kuò)增。dNTPs(10mmol/L)即脫氧核苷三磷酸，4種脫氧三磷酸核苷酸dATP、dGTP、dTTP、dCTP，是DNA合成的原料。高濃度可加速反應(yīng)，但同時(shí)增加錯(cuò)誤摻入和實(shí)驗(yàn)成本；低濃度可提高精確性，而反應(yīng)速度會(huì)降低。Taq酶(5U/pL)具有熱穩(wěn)定性的DNA高溫聚合酶，其作用是通過構(gòu)建磷酸二酯鍵將脫氧核苷酸聚合形成脫氧核苷酸鏈,從而形成雙鏈DNA分子。每—步對(duì)溫度的要求都不—樣，多數(shù)酶在高溫時(shí)即變性失活，然而該酶可以耐受90°C以上的高溫而不失活，所以不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷。同時(shí)也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，為保證酶的活性少受影響，應(yīng)盡量保持-20C環(huán)境。引物是一段與模板DNA鏈結(jié)合的寡核苷酸片段，對(duì)于DNA的擴(kuò)增起到引發(fā)的作用。六、 實(shí)驗(yàn)步驟(一)PCR反應(yīng)混合液的配制：PCR反應(yīng)體系為25口，在200口離心管中加入下面表1中組分，注意按照順序加入。表1PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系ddH2O16?8yLBuffer(10x)2.5pLMg2+(25mmol/L)2uL引物P1A(2pmol/pL)0.5pL引物P1B(2pmol/pL)0.5pLdNTPs(10mmol/L)0.5uLDNA(50ng-100ng)2pLTaa酶(5U/uL)0.2p,L用手指輕彈管底，使溶液混合均勻。（二）PCR反應(yīng)程序PCR反應(yīng)使用的標(biāo)準(zhǔn)程序見表2。表2PCR反應(yīng)程序階段溫度時(shí)間（共1.85小時(shí)）—預(yù)變性95C10min二變性94C1min退火58C45S35個(gè)循環(huán)延伸72C1min三再延伸72C5min四保存4C保存反應(yīng)完成后的PCR產(chǎn)物放在-20°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｆ?、注意事?xiàng)在配制PCR反應(yīng)液時(shí)注意吸取每一種藥劑后更好槍頭，避免交叉污染。配制PCR反應(yīng)液的整個(gè)過程最好在冰上進(jìn)行。3?加PCR反應(yīng)液時(shí)，槍頭要伸入到液面下一小點(diǎn)，防止槍頭有殘留藥液。配制PCR反應(yīng)液完成后，要輕搖離心管，防止加的藥液停留在管壁上。配制PCR反應(yīng)液時(shí)要注意加樣的順序，先加水，有利于反應(yīng)液的混勻，最后加Taq酶，避免非特異性反應(yīng)的發(fā)生。八、思考題PCR反應(yīng)中變性-退火-延伸各步反應(yīng)的目的？為什么要進(jìn)行預(yù)變性和再延伸？預(yù)變性是使模板DNA雙鏈完全變性解開。最后延伸是為了讓引物延伸完全并讓單鏈產(chǎn)物完全退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)以保證效果。因?yàn)镻CR開始的時(shí)候，模版是很長(zhǎng)的DNA鏈，如果補(bǔ)進(jìn)行預(yù)變性是無法讓雙鏈完全打開的；最后的延伸是為了讓taq酶工作地更徹底，就是讓你需要擴(kuò)增的序列完全的被復(fù)制，避免產(chǎn)生長(zhǎng)短不一的片段。預(yù)變性的目的：破壞DNA中可能存在的較難破壞的二級(jí)結(jié)構(gòu)。使DNA充分變性，減少DNA復(fù)雜結(jié)構(gòu)對(duì)擴(kuò)增的影響，以利于引物更好的和模板結(jié)合，特別是對(duì)于基因組來源的DNA模板，最好不要吝嗇這個(gè)步驟。此外，在一些使用熱啟動(dòng)Taq酶的反應(yīng)中，還可激活Taq酶，從而使PCR反應(yīng)得以順利進(jìn)行。再延伸的目的：因?yàn)樵谘h(huán)結(jié)束后，體系中的taq酶可能很多正處于復(fù)制狀態(tài)，如果此時(shí)降到室溫，將會(huì)影響最終產(chǎn)率，所以再留出5分鐘，以使正在復(fù)制中的taq酶能夠復(fù)制完全，以合成更多的目的分子。我們來看看最后一個(gè)循環(huán)，先95度，dna在高溫下變性，解鏈成單鏈分子，然后退