微生物菌種的冷凍干燥和低溫冷凍保藏

ⅧⅧ國家自然科技資源平臺微生物菌種的冷凍干燥和低溫冷凍保藏技術規(guī)程（試行）《自然科技資源收集整理保存技術規(guī)程研究制定》項目組二〇〇四年十二月十日目目次前 言 2引 言 3范圍 4規(guī)范性引用文件 4術語和定義 4內容 5參考文獻 101前前言本規(guī)程由微生物菌種資源平臺建設項目提出。本規(guī)程起草單位：中國農業(yè)科學院土壤肥料研究所、中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國科學院微生物研究所、中國林業(yè)科學研究院森林保護研究所、中國藥品生物制品檢定所、中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所、中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院。本規(guī)程主要起草人：張月琴、劉紅宇、黃明玉、姜瑞波、顧金剛、周宇光、樸春根、葉強、陳敏、程池等。ⅧⅧ引引言微生物菌種資源的長期有效保藏是微生物菌種資源有效實施共享的前提，采用操作性簡便、保藏周期長、遺傳變異率低是菌種資源保藏方法的首要選擇。微生物菌種的冷凍干燥和低溫冷凍保藏技術規(guī)程微生物菌種的冷凍干燥和低溫冷凍保藏技術規(guī)程范圍本規(guī)程規(guī)定了冷凍干燥和低溫冷凍保藏技術的定義、原理、技術要求、方法與步驟。藏。對于病原微生物及其他需要特殊操作技術的微生物的參見相應的技術規(guī)程。規(guī)范性引用文件隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容版本適用于本規(guī)范。國務院令第424號《病原微生物實驗室生物安全管理條例》GB19489科技部自然科技資源平臺聯(lián)合管理辦公室文件自然科技資源共性描述規(guī)范（試行）術語和定義下列術語和定義適用于本規(guī)范。3.1冷凍干燥freeze-drying期維持存活狀態(tài)。3.2液氮超低溫保藏preservationinliquidnitrogen液氮超低溫保藏技術是將菌種保藏在-196-150℃的氮氣中的長期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130℃以下新陳代謝趨于停止而有效地保藏微生物。3.3-80℃低溫冷凍保藏preservationin-80℃將菌種保藏在-80℃冰箱中以減緩細胞的生理活動進行冷凍的一種保藏方法。內容微生物菌種的冷凍干燥保藏技術規(guī)程好氧菌冷凍干燥管的制備安瓿管準備2用蒸餾水浸泡至pH中性，干燥后、貼上標簽，標上菌號及時間，加入脫脂棉塞后，121℃下高壓滅菌15-20分鐘，備用。保護劑的選擇和準備pH法。如血清，可用過濾滅菌；牛奶要先脫脂，用離心方法去除上層油脂，一般在100℃間歇煮沸2-3次，每次10-30分鐘，備用。凍干樣品的準備（參見科技部自（試行）），與保護劑混合均勻，分裝。微生物培養(yǎng)物濃度以細胞或孢子不少于108-1010個/ml為宜（以大腸桿菌為例，為了取得每毫升1010個活細胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升瓊脂斜面兩支）。0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，裝量為半個球部。若是液體培養(yǎng)的微生物，應離心去除培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)物與保護劑混勻，再分裝于安瓿管中。分裝安瓿管時間盡量要短，最好在1-2小時內分裝完畢并預凍。分裝時應注意在無菌條件下操作。預凍一般預凍2小時以上，溫度達到-20℃到-35℃左右。冷凍干燥采用冷凍干燥機進行冷凍干燥。將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機的干燥箱內，開始冷凍干燥，時間一般為8-20小時。終止干燥時間應根據(jù)下列情況判斷：——安瓿管內凍干物呈酥塊狀或松散片狀——真空度接近空載時的最高值——樣品溫度與管外溫度接近——選用1-2支對照管，其水份與菌懸液同量，視為干燥完結——選用一個安瓿管，裝1-2%氯化鈷，如變深蘭色，可視為干燥完結冷凍干燥完畢后，取出樣品安瓿管置于干燥器內，備用。真空封口及真空檢驗熔封。熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀測定真空度。保藏安瓿管應低溫避光保藏。質量檢查菌污染等。厭氧菌冷凍干燥管的制備主要程序與需氧菌操作相同安瓿管準備參見4.1.1.1保護劑的選擇和準備保護劑使用前應在100℃的沸水中煮沸15分鐘左右，脫氣后放入冷水中急冷，除掉保護劑中的溶解氧。凍干樣品的準備參見4.1.1.3預凍參見4.1.1.4冷凍干燥參見4.1.1.5真空封口及真空檢驗參見4.1.1.6保藏參見4.1.1.7質量檢查參見4.1.1.8冷凍干燥法適用范圍適用于大多數(shù)細菌、放線菌、病毒、噬菌體、立克次體、霉菌和酵母等的保藏，但不適于霉菌的菌絲型、菇類、藻類和原蟲等。保藏周期不同微生物復蘇周期不同，一般10年左右。復蘇方法——先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，——將安瓿管頂部燒熱，敲下已開裂的安瓿管的頂端，——用無菌水或培養(yǎng)液溶解菌塊，使用無菌吸管移入新鮮培養(yǎng)基上，進行適溫培養(yǎng)。微生物菌種低溫冷凍保藏技術液氮超低溫保藏技術安瓿管或凍存管的準備121℃下高壓滅菌15-20分鐘，備用。保護劑的準備保護劑種類要根據(jù)微生物類別選擇。配制保護劑時，應注意其濃度，一般采用10-20%甘油。微生物保藏物的準備微生物不同的生理狀態(tài)對存活率有影響，一般使用靜止期或成熟期培養(yǎng)物。分裝時注意應在無菌條件下操作。菌種的準備可采用下列幾種方法：刮取培養(yǎng)物斜面上的孢子或菌體，與保護劑混勻后加入凍存管內；接種液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)后取菌懸液與保護劑混合分裝于凍存管內；（直徑約5-10毫米），真菌最好取菌落邊緣的菌塊，與保護劑混勻后加入凍存管內；在小安瓿管中裝1.2-2毫升的瓊脂培養(yǎng)基，接種菌種，培養(yǎng)2-10天后，加入保護劑，待保藏。預凍預凍時一般冷凍速度控制在以每分鐘下降1℃為好、使樣品凍結到-35℃。目前常用的有三種控溫方法：好地控制降溫速率。氣霧中逐漸降溫。一般采用二步控溫，將安瓿管或塑料小管，先放-20℃至-40℃冰箱中1-2小時，然后取出放入液氮罐中快速冷凍。這樣冷凍速率大約每分鐘下降1-1.5℃?！獙δ偷蜏氐奈⑸?、可以直接放入氣相或液相氮中。保藏將安瓿管或塑料凍存管置于液氮罐中保藏。一般氣相中溫度為-150℃，液相中溫度為-196℃。保藏周期一般10年以上。復蘇方法從液氮罐中取出安瓿管或塑料凍存管，應立即放置在38℃-40℃水浴中快速復蘇并適當50秒-100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管，將內容物移至適宜的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。適用范圍各類微生物。液氮保藏應注意事項——防止凍傷，操作注意安全，帶面罩及皮手套——塑料凍存管一定要擰緊螺帽使用保溫瓶存放液氮——注意存放液氮容器的室內通風，防止過量氮氣使人窒息態(tài)氮體積膨脹約680倍，爆炸力很大，要特別小心——注意觀察液氮容器中液氮的殘存量，定期補充液氮。-80℃低溫冷凍保藏安瓿管或凍存管的準備參見4.2.1.1保護劑的準備參見4.2.1.2微生物保藏物的準備參見4.2.1.3凍結保藏將安瓿管或塑料凍存管置于-80℃冰箱中保藏。保藏周期一般1-5年。復蘇方法從冰箱中取出安瓿管或塑料凍存管，應立即放置38℃-40℃水浴中快速復蘇并適當快速50秒-100移至適宜的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)