外源基因表達(dá)調(diào)控2課件

原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)植物取嫩葉酶消化細(xì)胞壁洗滌2-4次移栽入土

愈傷組織培養(yǎng)基原生質(zhì)體培養(yǎng)基形成完整植株誘導(dǎo)生芽生根三.轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列對(duì)外源基因表達(dá)的影響1.高等植物基因的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn).2.5`-端表達(dá)調(diào)控序列的基本特征.3.啟動(dòng)子和增強(qiáng)子.(1)組成型啟動(dòng)子:CaMV35S啟動(dòng)子,NOS啟動(dòng)子,其他啟動(dòng)子.(2)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子:光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(如SSrbcorrbcS,LHCPa/b),損傷型啟動(dòng)子(如PI-II),其他誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(如HSP70,對(duì)激素ABA敏感的啟動(dòng)子等)(3)組織特異型啟動(dòng)子:葉特異表達(dá)啟動(dòng)子,花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子,糊粉層特異表達(dá)啟動(dòng)子,其他組織特異性啟動(dòng)子.2.誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

所謂誘導(dǎo)型啟動(dòng)子就是在某些特定的物理或化學(xué)信號(hào)的刺激下，可以大幅度地提高基因轉(zhuǎn)錄水平的啟動(dòng)子。該類(lèi)啟動(dòng)子常以誘導(dǎo)信號(hào)命名，如光誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子；熱誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子；創(chuàng)傷誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子；真菌誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子等。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子1.光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

二個(gè)光合基因啟動(dòng)子SSrbcorrbcS,LHCPa/borCab.

rbcS:例1豌豆rbcS基因一段973bp調(diào)節(jié)序列和cat基因構(gòu)成嵌合基因,結(jié)果表現(xiàn)出葉綠體依賴(lài)性和光調(diào)節(jié)活性.發(fā)現(xiàn)-330—50長(zhǎng)度280bp一段DNA對(duì)光誘導(dǎo)是必需的.例2rbcS的另一組試驗(yàn)結(jié)果都保持了rbcS表達(dá)的組織和光調(diào)控特異性.當(dāng)rbcS5`-125--320bp區(qū)缺失時(shí),喪失光調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性,稱(chēng)為光反應(yīng)區(qū)(調(diào)節(jié)區(qū),Lightregulationelement,LRE),I區(qū)(GATAAG)G區(qū)(CCACGTGG)GT區(qū)(GGTTAA)蛋白因子:GA1GBFGT1點(diǎn)突變或缺失處理,使rbcS啟動(dòng)子完全喪失活性.其它誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來(lái)自果蠅的HSP70基因的熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子.菜豆的幾丁質(zhì)酶(chitinase)啟動(dòng)子,對(duì)真菌侵染敏感.馬鈴薯塊莖蛋白基因I(ClassIPatatin)啟動(dòng)子糖誘導(dǎo).水稻對(duì)激素,ABA敏感的啟動(dòng)子等.(3).組織特異性啟動(dòng)子

也稱(chēng)為器官特異性啟動(dòng)子，在這類(lèi)啟動(dòng)子的調(diào)控下，基因的表達(dá)往往只發(fā)生在某些特定的器官或組織部位，并往往表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。這種特異性通常以特定的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和化學(xué)物理信號(hào)為存在的基礎(chǔ)。典型的組織特異性啟動(dòng)子有：馬鈴薯塊莖蛋白基因啟動(dòng)子；小麥胚乳特異表達(dá)的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因啟動(dòng)子；番茄果實(shí)成熟特異性表達(dá)的多聚半乳糖醛酸酶基因啟動(dòng)子；花粉特異表達(dá)基因（lat52）啟動(dòng)子和木質(zhì)部特異表達(dá)的苯丙氨酸脂肪酶基因（pal）啟動(dòng)子等。(3)組織特異性(Tissue-specific)啟動(dòng)子

和器官特異性(organspecific)啟動(dòng)子1.葉特異表達(dá)啟動(dòng)子LHCPa/b(Cab):光誘導(dǎo)葉組織中特異表達(dá).光合有關(guān)的基因，葉綠體特有的基因只在葉片中而且依賴(lài)葉綠體才能表達(dá).馬鈴薯塊莖蛋白I基因(ClassIPatatin)啟動(dòng)子具有塊莖特異表達(dá)和損傷蔗糖誘導(dǎo)活性.馬鈴薯的葉/莖特異表達(dá)基因(ST-LST)的5`上游調(diào)控序列與馬鈴薯塊莖結(jié)構(gòu)蛋白基因及3`-末端形成嵌合基因可以在轉(zhuǎn)化煙草的莖葉內(nèi)特異表達(dá).而該結(jié)構(gòu)蛋白基因通常只在馬鈴薯的塊莖中表達(dá).組織特異性(Tissue-specific)啟動(dòng)子和器官特異性(organspecific)啟動(dòng)子人工創(chuàng)造雄性不育

TA291.5kbpromoter+黑曲霉RNaseT1或芽孢桿菌RNase(Barnase)融合基因轉(zhuǎn)化煙草,結(jié)果轉(zhuǎn)化株與對(duì)照相比表型沒(méi)有差別,但無(wú)花粉亦不能結(jié)種子,而花柱正常,雌性的育性不受影響.生物學(xué)特征表明表型的雄性不育是由于導(dǎo)入TA29-RNaseT1(Barnase),轉(zhuǎn)化植株中的RNase基因在絨氈層細(xì)胞內(nèi)特異地大量表達(dá),從而降低了細(xì)胞中的RNA,抑制了絨氈層的形成引起花粉敗育,導(dǎo)致雄性不育.組織特異性(Tissue-specific)啟動(dòng)子和器官特異性(organspecific)啟動(dòng)子3.糊粉層特異表達(dá)啟動(dòng)子大麥的α-淀粉酶(α-amylase)組分I的基因 通常amy只在發(fā)芽大麥的糊粉層表達(dá).（植物激素GA3可誘導(dǎo)其表達(dá),ABA可以抵消GA3的作用）把Pamy+NPTII融合,轉(zhuǎn)化不同來(lái)源的原生質(zhì)體,結(jié)果NPTII可以在糊粉層來(lái)源的原生質(zhì)體內(nèi)低水平表達(dá),GA3可以是表達(dá)水平提高10倍,ABA可以抵消GA3的作用;盾片來(lái)源的原生質(zhì)體只能低水平表達(dá),而且不受激素影響;在葉肉原生質(zhì)體中根本不表達(dá).對(duì)照用P35S-NPTII,在三種不同來(lái)源的原生質(zhì)體中都高效表達(dá),而且不受激素的影響.說(shuō)明Pamy不但具有激素誘導(dǎo)活性而且具有組織特異性.組織特異性(Tissue-specific)啟動(dòng)子和器官特異性(organspecific)啟動(dòng)子4.其他組織特異啟動(dòng)子小麥胚乳特異表達(dá)的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因P.

番茄果實(shí)成熟特異性表達(dá)PG酶基因啟動(dòng)子.花粉特異表達(dá)基因LAT52啟動(dòng)子.木質(zhì)部特異表達(dá)PAL(苯丙氨酸脂肪酶)基因啟動(dòng)子.三.mRNA3`-端非編碼區(qū)序列對(duì)外源基因表達(dá)的影響真核生物中:hnRNAmRNA(加帽,加尾)

1.3`-端序列的基本特征 （圖） mRNA加尾過(guò)程三.mRNA3`-端非編碼區(qū)序列對(duì)外源基因表達(dá)的影響3`端調(diào)控序列對(duì)CAT基因在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平的影響通過(guò)缺失突變發(fā)現(xiàn)位于PI-II終止子Poly(A)信號(hào)下游100bp一段含8bp組成的保守序列CGTGTTTT對(duì)于基因高效表達(dá)是必需的.這段序列廣泛存在于動(dòng)、植物的轉(zhuǎn)錄終止子內(nèi)(YGTGTTYY),這段序列的缺失將極大地影響基因表達(dá)水平.

3`端來(lái)源5`-端來(lái)源馬鈴薯PI-IIT-DNAgene6BT-DNAgene7馬鈴薯PI-II高低低CaMV35S高低低9CGTGTCTT15-20

AAUAAA~100CGTGTTTT

不同來(lái)源的有著很大影響。使用35S啟動(dòng)子與NPTII結(jié)構(gòu)基因形成共整合體，并于不同來(lái)源的終止子構(gòu)建成融合基因，轉(zhuǎn)化煙草。發(fā)現(xiàn)不同的終止子使NPTII基因的表達(dá)水平可相差60倍。植物基因的終止密碼子多用UGA，而在雙子葉植物中，UAA的使用頻率高于UGA。四.5`-端內(nèi)含子對(duì)外源基因的表達(dá)調(diào)控作用1.5`-端內(nèi)含子的特點(diǎn).2.5`-端內(nèi)含子對(duì)外源基因表達(dá)的促進(jìn)玉米SHI5`-端內(nèi)含子,胚乳蔗糖酶基因(6kb)16exon,在啟動(dòng)子后面有一段非編碼的外顯子,并緊隨著一個(gè)大的內(nèi)含子(intronI,1028bp)PexonintronIIintronintron

+1ATG6kb四.5`-端內(nèi)含子對(duì)外源基因的表達(dá)調(diào)控作用玉米shrunk基因內(nèi)含子1(shiintron)的存在對(duì)cat酶活性表達(dá)的影響Sh1promoterintronI(1028bp)catgenecat活性(rice)

58

0

1P35S

數(shù)10倍0

1四.5`-端內(nèi)含子對(duì)外源基因的表達(dá)調(diào)控作用玉米shrunkgene1外顯子1(exon1)的作用Promotercatcat在玉米,水稻細(xì)胞中的表達(dá)活性

1

intronl

100

exoI10

1000shrunkgene1內(nèi)含子的存在對(duì)catgene在煙草植株內(nèi)的表達(dá)有抑制作用.四.5`-端內(nèi)含子對(duì)外源基因的表達(dá)調(diào)控作用3.作用機(jī)理:

5`-端內(nèi)含子并不具有增強(qiáng)子那樣的結(jié)構(gòu)和序列,內(nèi)含子促進(jìn)基因表達(dá)是通過(guò)增加mRNA活性以及提高mRNA含量來(lái)實(shí)現(xiàn)的.可能還包括增加mRNA穩(wěn)定性既促進(jìn)mRNA成熟等作用.五.外源基因在轉(zhuǎn)(翻)譯水平的調(diào)控1.mRNA結(jié)構(gòu)對(duì)翻譯的影響

S-D序列(Shine-Dalgarno)核糖體結(jié)合位點(diǎn).原核mRNA翻譯起始所必需,細(xì)菌中3-9bp組成.在mRNA上與16S核糖體RNA3’端互補(bǔ)，從而控制翻譯的起始.真核生物中無(wú)此結(jié)構(gòu),但有帽子到AUG之間的先導(dǎo)序列(leader),可以形成二級(jí)結(jié)構(gòu)被核糖體識(shí)別,依此來(lái)調(diào)節(jié)翻譯的速度。往往二級(jí)結(jié)構(gòu)多對(duì)翻譯不利.五.外源基因在轉(zhuǎn)翻譯水平的調(diào)控2.翻譯增強(qiáng)因子對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響(1)TMV?因子來(lái)自TMV126KD蛋白基因的轉(zhuǎn)錄序列5`-末端的非翻譯區(qū),68nt組成.在AUG之前,并有3個(gè)8nt組成的重復(fù)序列.在AUG前51處,?因子提供了另外一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn).推測(cè)?因子促進(jìn)mRNA翻譯是通過(guò)提供一個(gè)額外的核糖體結(jié)合位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)的.體外實(shí)驗(yàn)證明:5`含?因子的GUS基因的mRNA在煙草細(xì)胞內(nèi)的翻譯水平比不用?因子高64倍.而且對(duì)植物動(dòng)物和微生物細(xì)胞的翻譯都有促進(jìn)作用.五.外源基因在轉(zhuǎn)翻譯水平的調(diào)控2.翻譯增強(qiáng)因子對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響(2)AMV的?樣因子 AMVRNA的436nt的先導(dǎo)序列也具有提高外源基因的翻譯活性的功能. 推測(cè)是由于這段序列不形成特定的二級(jí)結(jié)構(gòu),從而提高翻譯的效率。這與?因子正好相反. 常用?及?樣因子提高翻譯效率,使外源基因有效表達(dá).五.外源基因在轉(zhuǎn)翻譯水平的調(diào)控?因子對(duì)翻譯的促進(jìn)GUSmRNAGUS活性1?因子GUSmRNA64?因子:68nt組成來(lái)源于TMV126KD的轉(zhuǎn)錄序列5`-端非翻譯區(qū),含有3個(gè)8nt的重復(fù)序列-51處可能提供了一個(gè)額外的核糖體結(jié)合位點(diǎn).五.外源基因在轉(zhuǎn)翻譯水平的調(diào)控3.堿基組成

植物基因的GC含量顯著高于細(xì)菌.4.密碼子的偏好性密碼子的通用性.植物基因在編碼氨基酸的同義密碼子之間的選擇上是有偏好的(codonbias).由于密碼的兼并性和擺動(dòng)性而產(chǎn)生選擇偏好即第三位選擇G,C還是A,U.例:植物葉綠體線(xiàn)粒體基因同義密碼子第三位更偏愛(ài)AUNNA/U>65%綠藻,氰化細(xì)菌愛(ài)GC,NNG/C>90%,植物核基因單子葉GCNNG/C>75%,

雙子葉輕微偏好NNG/C>55%.五.外源基因在轉(zhuǎn)翻譯水平的調(diào)控5.起始密碼周邊序列的影響不同類(lèi)型的細(xì)胞對(duì)mRNA起始周邊序列有不同的要求,植物傾向于AXA*ATGGC.有資料顯示，ATG之前第三位的A對(duì)翻譯效率影響很大。例:向植物中引入Bt基因的改造6.信號(hào)肽序列對(duì)轉(zhuǎn)化外源基因翻譯產(chǎn)物的調(diào)控作用

翻譯的完成不是基因表達(dá)的結(jié)束，初級(jí)翻譯產(chǎn)物并不具有生物活性，稱(chēng)之為前體蛋白。它通常還需要加工、修飾和正確折疊才能成為有活性的蛋白。前體蛋白的信號(hào)肽與活性蛋白的成熟有關(guān)、也與蛋白質(zhì)的運(yùn)輸和分泌有關(guān)。五.外源基因在轉(zhuǎn)翻譯水平的調(diào)控6.信號(hào)肽序列對(duì)外源基因的翻譯蛋白的運(yùn)輸和定向作用 翻譯的完成不是基因表達(dá)的結(jié)束，初級(jí)翻譯產(chǎn)物并不具有生物活性，稱(chēng)之為前體蛋白。它通常還需要加工、修飾和正確折疊才能成為有活性的蛋白。前體蛋白的信號(hào)肽與活性蛋白的成熟有關(guān)、也與蛋白質(zhì)的運(yùn)輸和分泌有關(guān)。 分泌型 運(yùn)轉(zhuǎn)型 根據(jù)目的基因的蛋白起作用的部位選擇相應(yīng)的信號(hào)肽DNA序列，構(gòu)成融合基因，使其融合表達(dá)六.轉(zhuǎn)基因植物中外源DNA整合的遺傳效應(yīng) 對(duì)基因表達(dá)的影響遺傳效應(yīng)：位置效應(yīng)（positioneffect）重組（重排）效應(yīng)（recombination）甲基化（methylation）

轉(zhuǎn)基因沉默（transgenesilencing）六.轉(zhuǎn)基因植物中外源DNA整合的遺傳效應(yīng) 對(duì)基因表達(dá)的影響（一）位置效應(yīng)Hilder認(rèn)為，位置效應(yīng)是由于插入位點(diǎn)附近染色體的微環(huán)境影響了外源基因啟動(dòng)子的表達(dá)所致。等容線(xiàn)（isochore):在染色體的各個(gè)區(qū)段，堿基組成是不均勻的，在某些區(qū)段常含有固定的較高的GC堿基對(duì)，這樣的組成方式，稱(chēng)為等容線(xiàn)。產(chǎn)生易于識(shí)別的甲基化位點(diǎn)例：玉米al基因轉(zhuǎn)化的煙草株系之一，al失活測(cè)序結(jié)果顯示，al基因與插入位點(diǎn)兩側(cè)堿基組成差異太大。Al基因47.5％AT煙草插入點(diǎn)5‘74％AT3’77％ATIglesias等煙草試驗(yàn)：六.轉(zhuǎn)基因植物中外源DNA整合的遺傳效應(yīng) 對(duì)基因表達(dá)的影響(二）重組（重排）效應(yīng)轉(zhuǎn)基因很容易被植物基因組的重組和修復(fù)系統(tǒng)所識(shí)別，結(jié)果將使外源DNA不同程度的重排。轉(zhuǎn)基因的同源和非同源的重組必然引起DNA的易位、缺失、重復(fù)等結(jié)構(gòu)變化。Peerbolte(1996)用Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化煙草DNA結(jié)構(gòu)分析證明基因在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中發(fā)生缺失、重排和擴(kuò)增，導(dǎo)致表型變異。Southern雜交除了目的基因的雜交帶外，還有大小不一的條帶。說(shuō)明外源基因在受體細(xì)胞內(nèi)存在結(jié)構(gòu)、拷貝數(shù)等有差異，是由于整合時(shí)引起的DNA重組造成的。六.轉(zhuǎn)基因植物中外源DNA整合的遺傳效應(yīng) 對(duì)基因表達(dá)的影響（三）甲基化作用（Methylation)高等植物DNA中大約30％的胞嘧啶核苷酸殘基被甲基化，抑制基因的表達(dá)。是由于甲基化酶作用，真核細(xì)胞中多發(fā)生在CG二核苷酸對(duì)。對(duì)基因表達(dá)的作用1.影響DNA與蛋白質(zhì)的相互識(shí)別 2.影響DNA的構(gòu)像。Z－DNA去甲基化試劑如：5－azac可以認(rèn)為去甲基化實(shí)驗(yàn)例證：朱禎發(fā)生甲基化的機(jī)理或原因：限制修飾系統(tǒng)、基因組免疫功能（genomicimmunefunction)識(shí)別，(等容線(xiàn)差異識(shí)別）六.轉(zhuǎn)基因植物中外源DNA整合的遺傳效應(yīng) 對(duì)基因表達(dá)的影響（四）轉(zhuǎn)基因沉默 轉(zhuǎn)基因在受體植物中往往不能穩(wěn)定表達(dá)，有時(shí)甚至完全不表達(dá)，出現(xiàn)了所謂的轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象（transgenesilencing）。是指利用遺傳轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入并穩(wěn)定整合進(jìn)受體細(xì)胞中的完整的外源基因在當(dāng)代轉(zhuǎn)化體或在其后代中表達(dá)受到抑制的現(xiàn)象。

轉(zhuǎn)基因沉默的機(jī)理

外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞核后，會(huì)受到多種因素的作用，根據(jù)其作用機(jī)制和水平不同可分為三種：位置效應(yīng)（positioneffect）、轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默（transcriptionalgenesilencing，TGS）和轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing，PTGS）。

涉及DNA-DNADNA-RNARNA-RNA分子之間的相互作用轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默是DNA水平上基因調(diào)控的結(jié)果，主要是由啟動(dòng)子甲基化或?qū)牖虍惾旧|(zhì)化所造成的。二者都和轉(zhuǎn)基因重復(fù)序列有密切關(guān)系。

重復(fù)序列可導(dǎo)致自身甲基化。外源基因如果以多拷貝的形式整合到同一位點(diǎn)上，形成首尾相連的正向重復(fù)（directrepeat）或頭對(duì)頭、尾對(duì)尾的反向重復(fù)（invertedrepeat），則不能表達(dá)。而且拷貝數(shù)越多，基因沉默現(xiàn)象越嚴(yán)重。這種重復(fù)序列誘導(dǎo)的基因沉默（repeat-inducedgenesilencing，RIGS）可能是重復(fù)序列間自發(fā)配對(duì)，甲基化酶特異性地識(shí)別這種配對(duì)結(jié)構(gòu)而使其甲基化，從而抑制其表達(dá)。此外，重復(fù)序列間的相互配對(duì)還可以導(dǎo)致自身的異染色質(zhì)化。其機(jī)理可能是異染色質(zhì)化相關(guān)蛋白質(zhì)識(shí)別重復(fù)序列間配對(duì)形成的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，與之結(jié)合，并將重復(fù)序列牽引到異染色質(zhì)區(qū)，或直接使重復(fù)序列局部異染色質(zhì)化。

轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默是RNA水平基因調(diào)控的結(jié)果，比轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默更普遍。特別是共抑制（cosuppression）共抑制是指在外源基因沉默的同時(shí)，與其同源的內(nèi)源DNA的表達(dá)也受到抑制。轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默的特點(diǎn)是外源基因能夠轉(zhuǎn)錄成mRNA，但正常的mRNA不能積累，也就是說(shuō)mRNA一經(jīng)合成就被降解或被相應(yīng)的反義RNA或蛋白質(zhì)封閉，從而失去功能?？赡苁怯捎谕椿蛑貜?fù)的基因表達(dá)了過(guò)量mRNA的結(jié)果。有人提出，細(xì)胞內(nèi)可能存在一種RNA監(jiān)視機(jī)制用以排除過(guò)量的RNA。當(dāng)mRNA超過(guò)一定的域值后，就引發(fā)了這一機(jī)制。特異性的降解與外源基因同源的所有RNA。此外，過(guò)量的RNA也可能和同源的DNA相互作用導(dǎo)致重新甲基化，使基因失活。

共抑制，矮牽牛CHS（四）轉(zhuǎn)基因沉默轉(zhuǎn)基因沉默的機(jī)理重復(fù)序列是基因沉默的普遍誘因，甲基化是基因沉默的直接原因上述三種機(jī)制并不是獨(dú)立的，而是相互關(guān)聯(lián)的?；虺聊瑱C(jī)制在核酸水平上均是DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA相互作用的結(jié)果，所以人們認(rèn)為對(duì)基因沉默機(jī)制的研究開(kāi)啟了認(rèn)識(shí)DNA水平及RNA水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)的新紀(jì)元，并提出了基因免疫，即基因組對(duì)外源基因入侵有抵抗能力的新觀念。六.轉(zhuǎn)基因植物中外源DNA整合的遺傳效應(yīng) 對(duì)基因表達(dá)的影響克服轉(zhuǎn)基因沉默的策略

1、轉(zhuǎn)基因密碼子優(yōu)化及轉(zhuǎn)化載體的合理修飾，使用具有組織和發(fā)育特異性調(diào)控作用的增強(qiáng)子：由于轉(zhuǎn)基因DNA序列與受體植物基因組DNA堿基不同是引發(fā)DNA甲基化的重要原因，所以在開(kāi)展遺傳轉(zhuǎn)化前非常有必要對(duì)轉(zhuǎn)基因進(jìn)行密碼子的優(yōu)化工作，盡量使用植物偏愛(ài)密碼子。為避免反式失活及共抑制，轉(zhuǎn)化載體中應(yīng)盡量避免使用相同的啟動(dòng)子及重復(fù)序列并保證載體上的構(gòu)建序列應(yīng)在同一個(gè)方向閱讀以免產(chǎn)生異?；蚍戳xRNA。六.轉(zhuǎn)基因植物中外源DNA整合的遺傳效應(yīng) 對(duì)基因表達(dá)的影響

2、在有性生殖后代中篩選單拷貝轉(zhuǎn)基因個(gè)體，避免多拷貝引起的轉(zhuǎn)基因沉默：如利用southern雜交，反向PCR等來(lái)確定，如采用常規(guī)的雜交、回交等，通過(guò)分析后代分離比來(lái)確定。篩選到單拷貝轉(zhuǎn)基因個(gè)體后，要對(duì)轉(zhuǎn)基因純合株系轉(zhuǎn)基因表達(dá)的穩(wěn)定性進(jìn)行鑒定?？梢酝ㄟ^(guò)組培來(lái)了解環(huán)境脅迫引起的轉(zhuǎn)基因的甲基化，并結(jié)合不同田間條件及不同遺傳背景開(kāi)展轉(zhuǎn)基因表達(dá)穩(wěn)定性的鑒定。

六.轉(zhuǎn)基因植物中外源DNA整合的遺傳效應(yīng) 對(duì)基因表達(dá)的影響

3、選擇合適轉(zhuǎn)化方法以及在遺傳轉(zhuǎn)化方法上的改進(jìn)： 基因直接轉(zhuǎn)化法極易導(dǎo)致多拷貝轉(zhuǎn)基因在宿主細(xì)胞中的整合，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因沉默。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法由于其產(chǎn)生的拷貝數(shù)相對(duì)較少，可以在一定程度上避免這個(gè)問(wèn)題。（1）選用基于Ac/Ds轉(zhuǎn)座系統(tǒng)建立的轉(zhuǎn)化載體：該轉(zhuǎn)化載體能擴(kuò)大寄主范圍，提高轉(zhuǎn)化效率及轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)的質(zhì)量。（