核酸的研究方法

關(guān)于核酸的研究方法第1頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五一.核酸的分離，提純和定量測定（一）DNA的分離提純真核生物DNA與蛋白質(zhì)的復合物（DNP）溶于水和濃鹽溶液，但不溶于0.14mol/L鹽溶液，用苯酚或氯仿使蛋白質(zhì)變性，DNA溶于上清液。在十二烷基硫酸鈉（SDS）存在下用蛋白酶消化細胞，再用苯酚和氯仿除去蛋白酶，用RNase除去RNA，操作在低溫下進行，防止過酸，過堿，或機械振蕩，可得高質(zhì)量的DNA。第2頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五

（二）RNA的分離提純RNA易被廣泛存在的RNase水解，所有器皿與溶液都要經(jīng)過處理除去RNase，在破碎細胞的同時應使RNaes失活，在實驗反應體系中要加RNaes的抑制劑。目前常用的分離方法——為釽鹽/氯化銫密度梯度離心（RNA密度>1.89，DNA密度-1.71，蛋白質(zhì)密度<1.33）。另一為酸性釽鹽/酚/氯仿法。第3頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五

（三）核酸含量的測定法利用堿基，糖和磷酸基進行測定。紫外分光光度法：利用堿基260nm紫外吸收測定核酸含量。定磷法（鉬藍比色）：濃硫酸水解核酸之磷酸，酸性條件下磷酸與鉬酸形成磷鉬酸，用還原劑還原磷鉬酸為鉬藍，660nm比色測定含量。定糖法

RNA：核糖與鹽酸共熱生成糖醛，然后與地衣酚生成鮮綠色化合物，670nm比色測定含量。

DNA：脫氧核糖與二苯胺共熱生成藍色化合物，595nm比色測定含量。第4頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五

生物組織冷的稀酸抽提

酸溶性物質(zhì)殘留物有機溶劑抽提脂類物質(zhì)殘留物

堿法熱酸法冷酸法堿降解再酸化熱酸提取冷酸提取酸提取液殘留物殘留物酸抽提液殘留物酸提取液

（RNA）（DNA）（RNA+DNA）

熱酸（RNA）提取殘留物酸提取液

（DNA）第5頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五(1)熱酸法把組織預處理后的沉淀部分用稀的過氯酸（PCA）或三氯乙酸（TCA）在90C處理15min，兩種核酸皆成為酸溶性物質(zhì)而抽提出來，并與大部分不溶性的蛋白質(zhì)分開。

優(yōu)點：無蛋白質(zhì)干擾，迅速簡單缺點：沒有把DNA與RNA分開，準確度較差(2)冷酸法經(jīng)酸和有機溶劑處理后用1mol/LPCA于4C處理18h抽提出RNA，再用0.5NPCA在70C處理20min抽提出DNA。各抽提液用定磷法，定糖法或紫外分光光度法來測定。

優(yōu)點：可測定微量缺點：可能部分DNA混雜于RNA中第6頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五（3）堿法

將酸不溶的非脂類含磷化合物與1N氫氧化鈉在37C保溫過夜，RNA被堿解為酸溶性核苷酸，而DNA不被分解。加入PCA或TCA酸化后，DNA即沉淀下來，上清液中為RNA的酸解產(chǎn)物。優(yōu)點：將DNA和RNA分開缺點：RNA部分還有其他含磷化合物第7頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五

二.核酸的超速離心當含有細小顆粒的懸浮液靜置不動時，由于重力場的作用使得懸浮的顆粒逐漸下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液體小的粒子就會上浮。物質(zhì)在介質(zhì)中沉降時還伴隨有擴散現(xiàn)象。1)擴散是無條件的絕對的。擴散與物質(zhì)的質(zhì)量成反比，顆粒越小擴散越嚴重。2)沉降是相對的，有條件的，要受到外力才能運動。沉降與物體重量成正比，顆粒越大沉降越快。顆粒越小沉降越慢，而擴散現(xiàn)象則越嚴重。3)利用離心機產(chǎn)生強大的離心力，才能迫使這些微?？朔U散產(chǎn)生沉降運動。離心就是利用離心機轉(zhuǎn)子高速度旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的強大的離心力，加快液體中顆粒的沉降速度，把樣品中不同沉降系數(shù)和浮力密度的物質(zhì)分離開。第8頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五超速離心機第9頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五

密度梯度沉降平衡法1.核酸密度的測定當DNA樣品的沉降速度與擴散速度達到平衡狀態(tài)時，DNA形成一穩(wěn)定的區(qū)帶，漂浮于氯化銫密度梯度中的一定位置上。此時DNA所處的位置上的氯化銫密度等于DNA的浮力密度。用1-2個已知浮力密度的標準DNA樣品作參考，與未知樣品一起離心。2.測定DNA中G-C之含量G-C堿基對比A-T堿基對之密度大，含G-C對多的DNA，浮力密度大。而且G-C的百分含量與DNA的浮力密度之間呈正比關(guān)系。第10頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五3.溶液中核酸構(gòu)象的研究4.用于核酸的制備對于拓撲異構(gòu)體（核苷酸數(shù)目相同的核酸），其沉降速度為：

RNA>超螺旋DNA>解鏈環(huán)狀DNA>

松弛環(huán)狀DNA>線形DNA

也就是在離心管中最上層是線形DNA，最下面是RNA。

第11頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五三.核酸的凝膠電泳（一）瓊脂糖凝膠電泳以瓊脂糖為支持物。電泳的遷移率決定于以下因素：（1）核酸分子大小應用凝膠電泳可正確地測定DNA片段的分子大小。在同一膠上加一已知其相對分子質(zhì)量的樣品。電泳完畢后，經(jīng)溴化乙錠染色，照相，從照片上比較待測樣品中的DNA片段與標準樣品中的哪一條帶最接近，即可推算出未知樣品中各片段的大小。（2）膠濃度（3）DNA的構(gòu)象（4）電壓（5）堿基組成（6）溫度（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳以聚丙烯酰胺作支持物。第12頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五核酸的凝膠電泳第13頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五（一）DNA的酶法測序四.核酸的核苷酸序列測定第14頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五DNA的酶法測序第15頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五DNA的酶法測序第16頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五DNA的酶法測序第17頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五Sanger法第18頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五Sanger法第19頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五第20頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五

（二）DNA的化學法測序Maxam和Gilbert于1977年發(fā)明1）

用特異的化學試劑作用于不同的堿基進行修飾2）

然后用哌啶切除堿基，DNA鏈斷裂成片段，末端為特異堿基3）

變性膠電泳分離，放射自顯影得到測序圖譜4）

判斷方法同Sanger終止法（三）RNA測序1）用特異酶切斷特異堿基位置的核酸鏈。電泳分離得到測序圖譜，同Sanger終止法。2）化學試劑斷裂RNA，電泳得到測序圖譜3）逆轉(zhuǎn)錄生成DNA，然后用DNA測序法。第21頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五

五.DNA聚合酶鏈式反應（PCR）

PCR,polymerasechainreaction是80年代發(fā)展起來的新技術(shù)，廣泛應用于分子生物學(molecularbiology)和基因工程(geneengineer-ing)及其它與DNA鑒定相關(guān)的其它領(lǐng)域，如疾病檢測、臨床應用、商品檢疫、法醫(yī)鑒定和新藥品的開發(fā)等。PCR是指那些模擬體內(nèi)DNA復制的方式在體外選擇性地擴增(amplify)DNA某個特殊區(qū)域的技術(shù)第22頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五PCR過程在自然界是不存在的，它是人們對DNA復制的深刻理解而帶來的產(chǎn)物?，F(xiàn)代PCR概念是KaryMullis于20世紀80年代早期發(fā)明的。經(jīng)過與Cetus公司的同事合作，最終導致現(xiàn)在廣泛使用的PCR技術(shù)的誕生。Mullis的創(chuàng)新點在于使用兩個與DNA的兩條不同鏈互補的寡核苷酸作為引物特異性地擴增兩個引物之間的DNA區(qū)域，并且重復進行。在此同時，得到的擴增產(chǎn)物又可作為下一輪擴增的模板(template)，從而使得擴增產(chǎn)物按幾何級數(shù)遞增。特別重要的是，從嗜熱細菌中分離的耐熱DAN聚合酶使PCR從概念成為真正適用的技術(shù)。第23頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五1.基本要素Template:ssDNAordsDNAPrimers:oligo-nucleotides等substrates:dNTPDNApolymerase:Taqpoly

2.反應過程

denaturedsDNAssDNA92-96Cannealing37-72C50-58C

extension72C

這三個熱反應過程的重復稱為一個循環(huán)(cycle)第24頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五

PCR主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個步驟反復的熱循環(huán)構(gòu)成：

即在高溫（95℃）下，待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性成為兩條單鏈DNA模板；而后在低溫（37～55℃）情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結(jié)合，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫（72℃）下，以引物3’端為合成的起點，以單核苷酸為原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新鏈。這樣，每一雙鏈的DNA模板，經(jīng)過一次解鏈、退火、延伸三個步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復進行，每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴增一倍，PCR產(chǎn)物得以2n的批數(shù)形式迅速擴增，經(jīng)過25～30個循環(huán)后，理論上可使基因擴增109倍以上，實際上一般可達106～107倍。第25頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五聚合酶鏈式反應第26頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五假設擴增效率為“X”，循環(huán)數(shù)為“n”，則二者與擴增倍數(shù)“y”的關(guān)系式可表示為：y=(1+X)n。擴增30個循環(huán)即n=30時，若X=100%，則y=230=1073741824(>109)；而若X=80%時，則y=1.830=45517159.6(>107)。由此可見，其擴增的倍數(shù)是巨大的，將擴增產(chǎn)物進行電泳，經(jīng)溴化乙錠染色，在紫外線照射下（254nm）一般都可見到DNA的特異擴增區(qū)帶。

第27頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五六.DNA的化學合成將待活化的核苷酸上的某些游離基團保護（封閉）起來，使反應按設計的方向進行。5'-OH用二對甲氧三苯甲基（DMT）保護，堿基上的氨基用苯甲酸保護。對3'-OH用氨基亞磷酸化合物進行活化。第28頁，共31頁，2022年，5月20日，1點46分，星期五A第一個核苷酸的3'-OH與固相（樹脂）結(jié)合在一起，它的5'-OH與活化的單體之間形成一個亞磷酸三酯，活化單體上的5'-OH及堿環(huán)上的氨基等由于受到保護而不會參與反應。B亞磷酸三酯經(jīng)碘氧化形成磷酸三酯C加入二氯乙酸除