候選蛋白的驗(yàn)證技術(shù)

候選蛋白的驗(yàn)證技術(shù)免疫印跡法（）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來檢測(cè)樣品的一種方法。令免疫組化法免疫熒光法流式細(xì)胞術(shù)>免疫印跡法SouthernBlottingNorthernblottingWesternBlottingEasternBlottingSouthernBlottingNorthernblottingWesternBlottingEasternBlotting2D電泳分離蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)膜,Southwesternblotting檢測(cè)對(duì)象是處國\堿基互補(bǔ)配對(duì)檢測(cè)對(duì)象是電國檢溜對(duì)象是特定蛋白質(zhì)檢測(cè)蛋白質(zhì)翻譯后修飾特異的探針去檢測(cè)檢測(cè)DNA和蛋白質(zhì)相互作用對(duì)象已知確定SD4PAGE分離蚩白，轉(zhuǎn)膜，尿素去除SDS,蚩白復(fù)性特定DN懸探針檢測(cè)Jfar-westernblotting?；斓鞍踪|(zhì)之間的相互作用］對(duì)象與目標(biāo)蛋白結(jié)合的非抗體蛋白質(zhì)稔測(cè)J未知■電泳將分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至固相支持體抗原抗體反應(yīng)步驟：制膠一蛋白樣品制備和上樣―電泳一轉(zhuǎn)膜一封閉一一抗雜交一二抗雜交一底物顯色電泳原理加入破壞蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，大量結(jié)合后，讓各種蛋白都帶上相同的負(fù)電荷（遠(yuǎn)大于原有電荷量，原有電荷量忽略）和破壞部分的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)；加入0巰基乙醇破壞二硫鍵，破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。最終蛋白質(zhì)的遷移率主要取決于它的分子質(zhì)量。在電場(chǎng)作用下，帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，向膠板下方移動(dòng)（+極），分子量小的蛋白質(zhì)所受阻力小電泳快，位于膠板最下方，分子量大的相反，各蛋白質(zhì)依分子量被分散于電泳道各處。在不連續(xù)電泳時(shí)，采用了兩種緩沖液，其凝膠孔徑、H直、電泳電壓和濃度不同。上層膠為濃縮膠（大孔徑，，），下層膠為分離膠（分子篩，,電壓，根據(jù)目的蛋白的分子量大小選擇合適的凝膠濃度）。濃縮膠中的緩沖對(duì)為，電泳的緩沖對(duì)為甘氨酸。膠中的移動(dòng)最快，電泳中的甘氨酸（為）在濃縮膠時(shí)解離度很小，故移動(dòng)最慢。而在無分子篩效應(yīng)的大孔徑濃縮膠中移動(dòng)速度居第二。即泳動(dòng)速度為蛋白＞甘氨酸離子。加上電壓后，氯離子和甘氨酸離子分離開來，在二者之間形成一個(gè)導(dǎo)電性較低的區(qū)帶（因?yàn)橹g電荷少），由于導(dǎo)電性和電場(chǎng)強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶的電壓梯度較高，又反過來加速位于區(qū)帶后方的甘氨酸離子的泳動(dòng)，使其追趕氯離子，建立甘氨酸和氯離子的電壓梯度和泳動(dòng)速度乘積相等的穩(wěn)定態(tài)，使這些帶電顆粒以相同的速度泳動(dòng)（這兩種離子之間有明顯的邊界，電泳調(diào)節(jié)一定的情況下，此高電壓梯度帶寬度不變）。蛋白質(zhì)則以相同的速度和相對(duì)固定的位置在此高電壓梯度帶中泳動(dòng)，同時(shí)受此高電壓梯度影響，蛋白質(zhì)分子被堆積在一起，形成一條狹窄的條帶。當(dāng)此高電壓梯度帶移動(dòng)到濃縮膠和分離膠界面時(shí)，凝膠增高，大量甘氨酸解離并帶上負(fù)電荷，此時(shí)甘氨酸的泳動(dòng)速率明顯增加，超越蛋白質(zhì)分子，位于氯離子后，使高電壓梯度帶縮窄，蛋白質(zhì)則不再位于該帶內(nèi)，落在后面的蛋白質(zhì)便在均一的電壓梯度和環(huán)境中泳動(dòng)，并根據(jù)其固有分子量大小進(jìn)行分離。.制膠（先下后上）配制的濃縮膠也稱堆積膠、積層膠或上層膠，按需配體積：成分配制不同體積SDS濃縮膠所需各成分的體積（毫升）5%膠2346810蒸餾水1.42.12.74.15.56.830%Acr-Bis(29:1)0.330.50.671.01.31.71MTris-HCl,pH6.80.250.380.50.751.01.2510%SDS0.020.030.040.060.080.110%過硫酸銨（AP）0.020.030.040.060.080.1TEMED(1%oV)0.0020.0030.0040.0060.0080.01依據(jù)目的蛋白的分子量大小選擇合適的凝膠濃度（實(shí)質(zhì)就是丙烯酰胺的濃度），再按照下面的表格配制的分離膠即下層膠：SDS分離膠濃度最佳分離范圍6%膠50-150kD8%膠30-90kD10%膠20-80kD12%膠12-60kD15%膠10-40kD成分配制不同體積SDS分離膠所需各成分的體積（毫升）6%膠51015203050蒸餾水2.04.06.08.012.020.030%Acr-Bis(29:1)1.02.03.04.06.010.01MTris-HCl,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%過硫酸銨（AP）0.050.10.150.20.30.5TEMED(1%oV)0.0040.0080.0120.0160.0240.04成分配制不同體積SDS分離膠所需各成分的體積（毫升）8%膠51015203050蒸餾水1.73.35.06.710.016.730%Acr-Bis(29:1)1.32.74.05.38.013.31MTris-HCl,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%過硫酸銨（AP）0.050.10.150.20.30.5TEMED(1%V)0.0030.0060.0090.0120.0180.03成分配制不同體積SDS分離膠所需各成分的體積（毫升）10%膠51015203050蒸餾水1.32.74.05.38.013.330%Acr-Bis(29:1)1.73.35.06.710.016.71MTris-HCl,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%過硫酸銨（AP）0.050.10.150.20.30.5TEMED(1%V)0.0020.0040.0060.0080.0120.02

成分配制不同體積SDS分離膠所需各成分的體積（毫升）12%膠51015203050蒸餾水1.02.03.04.06.010.030%Acr-Bis(29:1)2.04.06.08.012.020.01MTris-HCl,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%過硫酸銨（AP）0.050.10.150.20.30.5TEMED(1%oV)0.0020.0040.0060.0080.0120.02成分配制不同體積SDS分離膠所需各成分的體積（毫升）15%膠51015203050蒸餾水0.51.01.52.03.05.030%Acr-Bis(29:1)2.55.07.510.015.025.01MTris-HCl,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%過硫酸銨（AP）0.050.10.150.20.30.5TEMED(1%V)0.0020.0040.0060.0080.0120.02注：和是促凝劑，量適當(dāng)就好，溫度高需適當(dāng)減量，避免過早凝固。不要有氣泡，不要漏水、分離膠（板多配毫升體積，高度可調(diào)節(jié)，至少加到卡槽線；上樣槍頭要垂直）在一邊貼壁流下，少量無水乙醇（壓膠，使成水平）均勻由各處流下，待凝固（不可過久，否則將吸走分離膠中水分）。倒出多余無水乙醇（醇封需要用洗板），在一邊貼壁加入配置好的濃縮膠，依據(jù)估計(jì)上樣體積安裝適當(dāng)齒梳，待凝固i成膠后緩慢拔出齒梳，用去離子水趕出泳道內(nèi)氣泡（不要對(duì)著沖），側(cè)置膠板用濾紙吸出可流出的去離子水（不必全部吸干，操作在保證不損壞膠的前提下進(jìn)行）。組裝儀器，倒入（內(nèi)槽新液，外槽舊液）。細(xì)安裝、查漏水、（）內(nèi)過板、外過線、紅對(duì)紅、黑對(duì)黑.蛋白樣品制備和上樣蛋白樣品制備，用Uf鹽水超聲等充分裂解細(xì)胞。成分所需各成分量和作用/Tris-HCl,PH8.0?50mM緩沖對(duì)，防止蛋白變性NP-401%非離子型去污劑，裂解細(xì)胞Na-deoxycholate1%離子型去污劑，溶解細(xì)胞膜/NaCl150mM防止蛋白非特異性的聚合SDS0.1%強(qiáng)離子型去污劑，裂解細(xì)胞PMSF0.05mM蛋白酶抑制劑之一注：激酶的實(shí)驗(yàn)禁加Na-deoxycholate，其可變性激酶蛋白，并使其失去活性。2.磷酸酶的實(shí)驗(yàn)禁加磷酸酶抑制劑。.離子型去污劑存在極性頭部基團(tuán)，去污活性較強(qiáng)，尤SDS。SDS會(huì)使蛋白質(zhì)變性并破壞其三維結(jié)構(gòu)，因此當(dāng)研究蛋白質(zhì)活性或蛋白質(zhì)相互作用存在時(shí)，禁用SDS。如需去除蛋白質(zhì)的SDS，可利用SDS低溫沉淀特性，鉀鹽液中更明顯。不能通過離子交換色譜去除。.非離子型去污劑沒有極性的親水基團(tuán)，是比較溫和的表面活性劑，并且多數(shù)不能使蛋白質(zhì)變性，可保留蛋白的天然構(gòu)象、功能及它們的相互作用。注：用上樣針（每次洗5遍）選擇適當(dāng)?shù)鞍咨蠘恿浚ㄌ笊蠘恿繒?huì)造成“過載”，膜無法完全吸附所需蛋白，反而沒條帶）。上樣時(shí)為了簡便操作，建議上樣體積相同（）。上樣前分別測(cè)各蛋白樣品濃度，用或裂解細(xì)胞的配平各上樣蛋白濃度（使各組蛋白質(zhì)濃度相同）并于℃，加熱，終止可能的酶促反應(yīng)，防止提取的蛋白質(zhì)降解?？瞻子镜烙锰畛渥罱K使混液變?yōu)榈?。加入已知分子量的一系列蛋白混液作為確認(rèn)分子量的。泳道膠板：滿孔體積，上樣體積最好不過其，可選M上樣體積。泳道膠板：滿孔體積，可選M上樣體積。主要成分所需各成分作用Tris-HCl,PH6.8緩沖對(duì)，調(diào)節(jié)甘油增加樣品密度，從而沉降于點(diǎn)樣孔中，避免飄出溴酚藍(lán)（）指示劑，紫蘭色，顯示電泳過程二甲苯氰指示劑，蘭色，顯示電泳過程（部分有）變性酶類，終止酶促反應(yīng)，破壞氫鍵、疏水鍵，加入負(fù)電荷巰基乙醇破壞二硫鍵4.電泳紅對(duì)紅、黑對(duì)黑、調(diào)參數(shù)、適時(shí)停（溴酚藍(lán)到交界）?；厥諠饪s膠參數(shù)：，恒壓。原因：低電壓可以避免高電壓梯度帶過寬，使在蛋白移動(dòng)到濃縮膠和分離膠界面時(shí)，甘氨酸仍遠(yuǎn)未到，甚至讓蛋白在分離膠中的泳動(dòng)也收到該高電壓帶影響，而產(chǎn)生偏差（在分離膠中蛋白泳動(dòng)應(yīng)僅與其自身分子量大小有關(guān)）。分離膠參數(shù)：，恒壓。原因：增大電壓，讓蛋白質(zhì)在分離膠的泳動(dòng)更快。成分所需各成分作用Tris-HCl,PH?構(gòu)建高電壓梯度帶的必須試劑，并調(diào)節(jié)

Glycine構(gòu)建高電壓梯度帶的必須試劑SDS？去離子水溶齊|」.轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜參數(shù)：依據(jù)目的蛋白的分子量來確定。分子量小的所需電壓小，反之。示范，恒流，5三明治：黑（極）、海綿、濾紙（至少層）、膠、膜（見下）、濾紙、海綿、紅（極）?硝酸纖維素膜de膜）親水性膜硝酸纖維素膜de膜）親水性膜,價(jià)格便宜L簡單快速封閉非特異性抗體結(jié)合封閨非特異性抗體結(jié)合麻煩膜的選擇《］尼龍膜）價(jià)格昂貴需要更高的蛋白結(jié)合率（危龍膜=480pg.1!cm2g?硝酸纖筵素:朦=SOpg-'cm2>〔特殊要求下的選擇‘：目的蛋白與硝酸纖維膜的結(jié)合能力弱〔需要更大的機(jī)械強(qiáng)度密信—新疏水性膜，需要甲醇浸泡103預(yù)處理，轉(zhuǎn)為親水性或（算烯覆》活化腹上的正點(diǎn)基團(tuán)。蛋白結(jié)合量最高，機(jī)械強(qiáng)度也PVDF.m）高，其上的蛋白可用染料染色也可免疫顯色，但使用前需處理,特別適于氨基酸組成分析和序列分析。注：裁剪膜時(shí)可在右上角剪一個(gè)缺做為標(biāo)記。制作三明治的時(shí)候一定要保證各層之間無氣泡（如有可重新“貼膜”或粗針注水驅(qū)趕），在加最后一層海綿之前用滾筒趕氣泡（個(gè)人認(rèn)為可以每層都用，除了膠膜層），最后一層海綿擰干，避免過大安不上。膜用甲醇浸泡后用去離子水洗遍。浸潤前，在膜上標(biāo)記上下和蛋白質(zhì)的前后面，甚至可以描摹k儀器內(nèi)放冰盒（板靠冰盒），外加冰浴。成分所需各成分作用Tris-HCl,PH?調(diào)節(jié)Glycine？SDS？甲醇？為什么還要加？去離子水溶齊|」方法一：依據(jù)分子量標(biāo)記將內(nèi)參的相應(yīng)分子量附近條帶橫向剪開，分別封閉雜交兩條膜。一條膜為內(nèi)參，雜交內(nèi)參一抗；一條膜為目的蛋白，雜交目的蛋白一抗。方法二：在確保所用一抗間不會(huì)互相結(jié)合的前提下，可以多個(gè)同種屬來源一抗同時(shí)雜交，用抗該種屬的不同來源抗體雜交二抗。優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果更可信，更漂亮。缺點(diǎn)，可能會(huì)有不符合趨勢(shì)的條帶，一抗液不可回收，成本高。6.封閉用洗膜遍，加入封閉液，膜的蛋白面朝上，搖床h成分封閉液所需各成分量和作用脫脂奶粉填滿膜上未被蛋白占據(jù)的處，避免非特異性條帶溶劑（過會(huì)洗膜要用所以用做溶劑）成分所需各成分量和作用？去離子水溶齊|」非離子型去污劑，減少非特異性抗體結(jié)合7.一抗雜交用液洗膜遍，加入一抗，膜蛋白面朝上，搖床℃過夜。（單一一抗可回收再利用）成分一抗液所需各成分量和作用脫脂奶粉填滿膜上未被蛋白占據(jù)的處，避免非特異性條帶溶劑（過會(huì)洗膜要用所以用做溶劑）一抗體（）特異性結(jié)合所需觀察的目的蛋白二抗雜交用液洗膜遍，加入二抗，膜蛋白面朝上，h（二抗便宜，可不回收）成分二抗液所需各成分