凝膠層析(分子篩層析)

【目的】掌握凝膠層析的基本原理學習利用凝膠層析法分離純化物質的實驗技能凝膠層析（分子篩層析）1

層析也稱之色譜，基本原理是分析樣品作為流動相流過固定相時，由于樣品中的各個成分與固相相互作用不同使得樣品中的各個成分通過固定相的速率產生了差別，從而達到分離樣品中各個成分的目的。層析因固相介質不同又分為離子交換層析、分子篩層析和吸附層析等各種層析。5.2層析原理

【原理】23

層析也稱之色譜，基本原理是分析樣品作為流動相流過固定相時，由于樣品中的各個成分與固相相互作用不同使得樣品中的各個成分通過固定相的速率產生了差別，從而達到分離樣品中各個成分的目的。層析因固相介質不同又分為離子交換層析、分子篩層析和吸附層析等各種層析。5.2層析原理

【原理】4

【原理】

凝膠層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網狀結構凝膠的分子篩作用，根據被分離物質的分子大小不同來進行分離的技術。經常使用的凝膠有交聯葡聚糖（Sephadex）、聚丙稀酰胺凝膠和瓊脂糖（Sepharose）。5

單個凝膠珠本身象“篩子”。不同類型凝膠的篩孔的大小不同。凝膠過濾層析凝膠珠6帶網孔的凝膠珠小分子不同程度自由進入凝膠珠內大分子不能進入珠內，經珠之間縫隙流出凝膠過濾層析過程示意圖7總結：直徑大于凝膠網孔的分子(相對分子量大）被完全排阻流程較短，阻力小，速度快；首先流出。直徑小于凝膠網孔的分子（相對分子質量小）可完全滲透進入網孔，流程較長，阻力大，移動速率慢；最后流出。中等大小的分子，凝膠顆粒內外部分滲透，滲透程度取決于它們分子的大小，流出介于二者之間。各組分按分子從大到小的順序依次流出，從而達到了分離的目的。凝膠的網孔大小決定了凝膠的分級分離范圍（fractionationrange)。

8幾個有關凝膠體積的術語：Vt：凝膠柱床的總體積（totalvolume),常稱為柱床體積。Vo:孔隙體積（voidvolume)或外體積。Vi:內體積（innervolume),凝膠珠內部的水相體積。Vm:凝膠基質體積(matrixvolume)

9Ve:某一溶質組分的洗脫體積（elutionvolume),是自加樣品開始到該組分洗脫峰（峰頂）出現時的流出體積。

Ve=Vo+Kd×ViKd:

與凝膠孔隙、溶質分子大小相關的函數，0≤Kd≤110凝膠層析的應用范圍：

凝膠層析法適用于分離和提純蛋白質、酶、多肽、激素、多糖、核酸類等物質。凝膠層析的優(yōu)點：

凝膠層析具有設備簡單、操作方便、分離迅速、效果好、重復性高、不影響分子的生物學活性等。11【試劑與器材】1.待分離樣品：0.5%藍色葡聚糖(BlueDeXtran2000，藍色，分子量為2×l06)和0.5%鉻酸鉀(黃色，分子量為194.2)混合物。2.葡聚糖凝膠G-25(Sephadex-G-25)3.洗脫液：蒸餾水；4.層析柱、鐵架臺:兩人一組；5.細玻棒及滴管(細長)。6.試管及試管架、燒杯。

12【操作方法】膠干粉經蒸餾水室溫充分溶脹48h，抽真空脫去顆?？障吨械目諝?；將膠懸液攪勻，每組倒取50mL。凝膠的預處理裝柱柱垂直放好，關閉出水口;關閉出口，加入洗脫液約3cm高：自頂部緩緩加入稀薄的攪勻膠懸液，待底部凝膠沉積1-2cm，再打開出水口(10滴/min)，繼續(xù)加入上述懸液;至凝膠層沉積達15cm即可，關閉出水口。

平整連續(xù)、均勻無氣泡無“紋路”13用2～3倍柱床體積的洗脫液平衡，流速為0.5mL/min。（略）靜置2min后打開出水口，使溶液緩緩流下，至液面剛好或即將進入凝膠柱表面，關閉出水口；取葡聚糖（14滴）和重鉻酸鉀（7滴）混合；旋轉、沿壁，緩緩加入：開啟出水口，使樣品流入柱內；

關閉出水口。小心加入蒸餾水20滴，開啟出水口，使緩緩流入柱內（7滴/min)。平衡加樣不要攪動凝膠面，應保持平整：液面不能低于凝膠面14用蒸餾水洗脫；蒸餾水分批加入；同時用試管分部收集（7滴/管），至有色溶液全部流出；流速：7滴/min。用蒸餾水（15－30mL)洗滌；流速：10－20滴/min；倒出柱料。洗脫收集清洗凝膠面必須有液體，不可流干；控制恒定流速，不能太快。15凝膠過濾層析過程示意圖小分子大分子凝膠基質凝膠珠16注意事項裝柱前先檢查層析柱是否漏水。膠懸液（柱料）不能進行劇烈攪拌，禁止使用電磁攪拌器，這樣會使凝膠顆粒破裂而產生碎片。裝柱：柱料應連續(xù)均勻分布，表面平整，防止產生氣泡與分層。加樣：不要攪動凝膠面，上樣量不能太大。洗脫：保持恒定流速，不能太快。始終保持柱內液面高于凝膠表面，否則凝膠變干，混入大量氣泡，影響液體在柱內的流動，導致分離效果變壞。17實驗結果觀察并記錄上樣和洗脫全過程，柱料顏色的變化；以洗脫管號為橫坐標，以光密度為縱坐標作圖即得洗脫曲線。分析曲線圖并討論實驗結果。（實驗中肉眼觀察，用符號數表示顏色深淺。藍色：＋，黃色：Δ；列表記錄后作圖）

管號123……藍黃18附錄19凝膠過濾層析經常遇見的問題

1．流速慢

（1）有氣泡、出水管阻塞

（2）沒打開夾子（3）柱壓太緊（操作壓過大、長期使用、接頭漏氣

2．柱內產生氣泡

（1）上水口不流或皮管破裂，洗脫液外流

（2）接口漏氣，如上水口螺絲擰的不緊

3．條帶扭曲20

（1）膠面不平

（2）樣品或洗脫液中有顆粒

（3）裝