柞蠶功能基因研究進展-沈陽農(nóng)業(yè)大學柞蠶研究所劉彥群研

柞蠶功能基因研究進展

——沈陽農(nóng)業(yè)大學柞蠶研究所劉彥群研究組

匯報人：劉彥群、李玉萍2011.03.一、研究組簡介二、研究進展三、當前重點研究工作

匯報內(nèi)容.背景：在家蠶基因組與功能基因組研究取得巨大進展和成功的背景下，我們于2008年組建了柞蠶基因組與功能基因組研究組。

一、研究組簡介.人員：固定成員已由最初的2人增長為6人（劉彥群、李玉萍、夏潤璽、王歡、李群、秦利）?，F(xiàn)有研究生6人，今年準備招生4人。包括特種經(jīng)濟動物飼養(yǎng)、動物學兩個專業(yè)。一、研究組簡介.研究領(lǐng)域：（1）以構(gòu)建的柞蠶全長cDNA文庫和完成的柞蠶轉(zhuǎn)錄組信息資源為平臺，克隆和鑒定柞蠶特異基因和重要功能基因；（2）利用基因組學技術(shù)和分子系統(tǒng)學方法，開展柞蠶遺傳與進化研究。

一、研究組簡介.目前承擔的國家自然科學基金課題：（1）面上項目（柞蠶蛹滯育解除期高豐度表達的KK-42結(jié)合蛋白基因的功能分析；2011.01~2011.12；劉彥群）。（2）青年科學基金（柞蠶mtDNA控制區(qū)遺傳多樣性與系統(tǒng)進化；2009.01~2011.12；劉彥群）。（3）面上項目（柞蠶神經(jīng)肽PBAN的受體鑒定及其作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分析；2011.01~2013.12；魏兆軍、李玉萍）。一、研究組簡介.發(fā)表論文：

2008年至今，在《InternationalJournalofBiologicalSciences》、《AnnalsoftheEntomologicalSocietyofAmerica》、《JournalofInsectScience》、《MolecularBiologyReports》、《ActaBiochimicaetBiophysicaSinica》、《蠶業(yè)科學》等發(fā)表24篇相關(guān)論文，包括13篇SCI論文（2008年1篇；2009年2篇；2010年9篇；2011年已發(fā)1篇，已投稿2篇）。一、研究組簡介.1、柞蠶EST測定與轉(zhuǎn)錄組測序2、柞蠶功能基因克隆二、研究進展.EST測定：（1）構(gòu)建了一個柞蠶全長cDNA文庫，為基因的克隆奠定了基礎(chǔ)；（2）獲得了1500條柞蠶EST，拼接后得到779個一致性序列，被注釋的一致性序列達533個，未被注釋的一致性序列達246個；（3）識別了200個新的EST；（4）獲得了313條柞蠶基因全長cDNA序列。1、柞蠶EST測定與轉(zhuǎn)錄組測序.轉(zhuǎn)錄組測序：（1）合作者合肥工業(yè)大學魏兆軍博士研究組已經(jīng)利用Solexa技術(shù)完成了滯育解除期柞蠶蛹的轉(zhuǎn)錄組分析。總共獲得84322個contig，注釋為38438個unigene。（2）我們正在利用同樣的技術(shù)進行滯育中期蛹的轉(zhuǎn)錄組分析。仍將進行注定滯育蛹和注定不滯育蛹的轉(zhuǎn)錄組分析。（3）旨在分離與柞蠶滯育相關(guān)的基因。1、柞蠶EST測定與轉(zhuǎn)錄組測序.（1）鑒定了柞蠶KK-42結(jié)合蛋白基因，查明其與蛹滯育密切相關(guān)。（2）鑒定了烯醇化酶I、II基因。烯醇化酶I基因在溫度刺激時是可調(diào)的。烯醇化酶II基因與生殖有關(guān)。（3）鑒定了柞蠶溶血磷酯酶基因、長壽基因、肌球蛋白輕鏈2基因、異常翅節(jié)蛋白基因、腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因、延伸引子-1α基因、肌動蛋白基因。2、柞蠶功能基因克隆.最近，又鑒定了柞蠶血小板活化因子乙酰水解酶基因、亞精胺合成酶基因、磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因、硒磷酸化物合成酶基因、賴氨酰-tRNA合成酶基因、牻牛兒基牻牛兒醇轉(zhuǎn)移酶、NIMA相關(guān)激酶基因等，完成了表達模式分析。還分離了4個小分子量熱激蛋白基因、1個微卵黃原蛋白基因。相關(guān)論文正在整理中。2、柞蠶功能基因克隆.1、柞蠶蛹滯育相關(guān)的KK-42結(jié)合蛋白基因的功能分析2、利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分離柞蠶蛹滯育相關(guān)基因三、當前重點研究工作.1、KK-42結(jié)合蛋白基因的功能分析：（1）咪唑類化合物（KK-42）是一種昆蟲生長調(diào)節(jié)因子，能加快昆蟲（如柞蠶、天蠶、家蠶等）甚至節(jié)肢動物（如對蝦）幼蟲的早熟變態(tài)；（2）并且能解除天蠶的卵滯育和棉鈴蟲的蛹滯育。我們的試驗表明，也能解除柞蠶的蛹滯育（需要進一步重復(fù)驗證）三、當前重點研究工作.1、KK-42結(jié)合蛋白基因的功能分析：（3）KK-42結(jié)合蛋白與天蠶的卵滯育解除有直接關(guān)系(Shimizuetal.,2002;Yangetal.,2008)

。（4）表達譜分析表明，柞蠶KK-42結(jié)合蛋白基因在4個發(fā)育階段和所有組織器官中均表達，并且與柞蠶的蛹滯育密切相關(guān)（滯育期不表達），而且在滯育解除后期高豐度表達。（5）序列比對和進化分析表明，KK-42結(jié)合蛋白具有兩個脂肪酶活性功能域，是脂肪酶的新成員。三、當前重點研究工作.1、KK-42結(jié)合蛋白基因的功能分析：（6）將系統(tǒng)研究KK-42處理對柞蠶生長發(fā)育的影響；（7）將利用免疫細胞化學技術(shù)進行該蛋白的亞細胞定位；（8）在真核細胞中表達后，利用酶學方法對該蛋白可能具有的脂肪酶活性進行鑒定；（9）利用RNAi技術(shù)進行KK-42結(jié)合蛋白基因的功能分析。三、當前重點研究工作.1、KK-42結(jié)合蛋白基因的功能分析：（10）該研究工作可以為深入理解昆蟲滯育解除的分子機理提供新的線索，也為探明KK-42的分子作用機制提供直接的證據(jù)。三、當前重點研究工作.2、柞蠶蛹滯育相關(guān)基因的分離：（1）滯育是昆蟲生活史中非常重要的一個生理學過程。柞蠶以蛹滯育，長期以來是國內(nèi)外研究滯育調(diào)節(jié)、神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控等方面的模式昆蟲之一。三、當前重點研究工作.2、柞蠶蛹滯育相關(guān)基因的分離：（2）已經(jīng)用于分離昆蟲滯育相關(guān)基因的技術(shù)有mRNA差異顯示（家蠶，Suzukietal.1999；棉鈴蟲，朱佳等2010）、消減雜交（馬鈴薯甲蟲，Yocum2003；尖音庫蚊，Robichetal.2007；天蠶，Yangetal.2008；紅尾肉蠅，Rinehartetal.2010）、EST（舊金山鹵蟲，Chenetal.2009）、cDNA芯片（家蠶，Hwangetal.2005）、差異蛋白質(zhì)組學（紅尾肉蠅，Lietal.2007；棉鈴蟲，LuandXu,2010）。三、當前重點研究工作.2、柞蠶蛹滯育相關(guān)基因的分離：（3）轉(zhuǎn)錄組是基于高通量測序技術(shù)從整體水平上研究細胞中基因表達及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的技術(shù)。由于測序成本的急速降低，該新技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于昆蟲滯育相關(guān)基因的分離（Raglandetal.,2010,PNAS

14909-14914）。

該方法采用直接測序的方式，無需了解物種基因信息，可以對任何物種在全基因組范圍內(nèi)進行精確的數(shù)字化基因表達定量分析，通過樣本間基因表達差異比較，可以準確鑒定與特殊性狀相關(guān)的候選基因。具有前述幾種技術(shù)不可比擬的優(yōu)勢。三、當前重點研究工作.2、柞蠶蛹滯育相關(guān)基因的分離：

（4）將進行柞蠶蛹4個重要滯育時期（注定非滯育蛹、注定滯育蛹、滯育中期蛹、滯育解除期）的轉(zhuǎn)錄組測序；（5）利用生物信息學方法，通過樣本間差異比較，鑒定與柞蠶滯育相關(guān)的候選基因；（6）利用定量PCR和Northernblot等技術(shù)對候選基因進行驗證。三、當前重點研究工作.（7）該研究工作可以為進一步開展柞蠶蛹滯育的分子機理研究提供新的線索。（8）柞蠶是我國的特色經(jīng)濟昆蟲，但我們對柞蠶的基因表達和功能的了解還非常缺乏。由于缺乏基因組數(shù)據(jù)，以往柞蠶功能基因的克隆只能采用費時費力的同源克隆方法。該研究工作將獲得大量基因表達數(shù)據(jù)，可以為柞蠶功能基因的快速克隆奠定基礎(chǔ)。三、當前重點研究工作.沈陽農(nóng)業(yè)大學柞蠶研究所全體同事！西南大學蠶學與系統(tǒng)生物學研究所全體老師！遼寧省蠶業(yè)科學研究所各位老師！合肥工業(yè)大學魏兆軍博士研究組！……祝各位老師與同仁身體健康！工作愉快！致謝.圖1基于氨基酸序列構(gòu)建的ApKK-42BP及其相關(guān)蛋白的進化樹LipasesYolkproteinsKK-42BPs.圖2ApKK-42BP基因的表達譜(A)組織分布。1-10分別代表5齡第10天幼蟲的血液、脂肪體、中腸、絲腺、體壁、馬氏管、精巢、卵巢、腦和肌肉。(B)發(fā)育階段。11-15分別代表卵、幼蟲、蛹和雌蛾、雄蛾。.圖3ApKK-42BP基因在注定不滯育和注定滯育的幼蟲中表達變化1和2分別代表注定不滯育和注定滯育幼蟲的腦。3和4分別代表注定不滯育和注定滯育幼蟲的血液。.圖4ApKK-42BP基因在不同滯育期的變化1表示注定不滯育的蛹（春蛹）；2-6分別表示注定滯育蛹（秋蛹）的前滯育期、滯育前期、滯育期、后滯育期I（顱頂板乳白色）、后滯育期II（顱頂板發(fā)紅；卵已形成）。.

AntheraeapernyiI

AntheraeapolyphemusABW39163

BombyxmoriIABL73887

SpodopterafrugiperdaSFC01447_2

TriboliumcastaneumEFA09609

TriboliumcastaneumEFA10506

TriboliumcastaneumEFA09610

DrosophilamojavensisEDW11671

DrosophilayakubaABH06824DrosophilamelanogasterABH06829

LutzomyialongipalpisABV60328OncometopianigricansAAU95200

AnophelesgambiaeEAA12254

AedesaegyptiEAT47221

CulexquinquefasciatusEDS26585

BlattellagermanicaABC96322

PediculushumanuscorporisEEB17453

HomarusgammarusP56252

PenaeusmonodonAAC78141

AphidiuserviCBE65825

ArabidopsisthalianaP25696

OryzasativaQ42971

HomosapiensNP_001419

MusmusculusNP_001020559

RattusnorvegicusNP_036686

SchizosaccharomycespombeNP_595903

SaccharomycescerevisiaegiNP_011770

MagnaporthegriseaXP_366389

AntheraeapernyiII

BombyxmoriII

ArchaeoglobusfulgidusAAB90112

HaloarculamarismortuiP29201

PyrococcusabyssiCAB494589810092100100100100100100978999969089595482807975100950.1InvertebratesplantsvertebratesfungiEnolaseIenolaseII圖5基于氨基酸序列構(gòu)建的烯醇化酶的進化樹.圖6柞蠶兩個烯醇化酶基因的表達模式(A)發(fā)育階段。1-4分別代表卵、幼蟲、蛹和